Giáo trình thiết lập chất đối chiếu (tài liệu dùng cho sv định hướng chuyên ngành kiểm tra chất lượng thuốc)

HCM –  Kiểm Tra Chất L ợ ) P 2016 Các nguyên tắc chung cho vi t t ập, bảo trì phân ph i củ ất ất ọ ấ (Primary chemical reference substances) ất ọc t ấ (Secondary chemical reference substances) Quy trình Thi t lập chất i chi u Các t á v k ểm tra chất ợng chất i chi u Bộ li u phổ tr xá nh cấu trúc chất i chi u/chuẩn làm vi c ổ ổ Phổ ổ N uyê ắ u , bảo rì, ố C Ph n A ất chí hóa học ấ (Primary chemical reference substances) A.1 ánh giá c n thi t cho vi c t t ập ọ A.2 Nguồn nguyên li u A.3 ánh giá ọ A.3.1 Sử dụng t t A.3.2 Sử dụng t ộ tinh t A.3.3 Sử dụng t ợng A.3.4 Sử dụng hi u chuẩn t t A.4 á hóa học vật ý ợc sử dụng vi á A.4.1 P dụ ể danh ọ A.4.2 P dụ ể xá ộ tinh t ọ A.5 á tr v ợ A.6 ọ phân ph i ọ A.6.1 tr ọ A.6.2 L trữ A.6.3 ộ ổ nh ủ A.6.4 Thông tin ợc cung cấp v i ọ A.6.5 Phân ph i cung cấp A.6.6 Thời sử dụng Ph n B Các ọ t ấ (Secondary CRS) B.1 ánh giá c n thi t B.2 Nguồn nguyên li u B.2.1 L a chọn chất B.2.2 cung cấp v i ợ t t ậ B.2.3 Thử nghi m u cho phù hợp v i yêu c u chuyên ậ B.3 B.4 á PTN (PTN) ể xá tr v ợ B.4.1 Nă c PTN tham gia B.4.2 Tài li u t t ấ B.4.3 tr t B.4.4 ánh giá k t B.4.5 ẩ B.5 nhận t ấ B.6 C tr tá k ể B.7 T t ợc cung cấp v i t ấ B.8 Thời sử dụng B.9 Phân ph i cung cấp ố C u ọ ệ Nă 1975, Ủy ban v thông s kỹ thuật ợc phẩm ủ "nguyên tắc chung cho vi c t t ập, trì phân ph i ọ " (1) Thờ ể tắc nhằm s hợp tác hài hòa ọ qu c gia khu v c Các nguyên tắ ã ợc ụ u b i Trung tâm ọ qu c t Thụy ển ể ấ C C t (ICRS) Các chất chủ y ợc sử dụng v i ậ tr ợ ển t [2] ể ảm bảo tính sẵn sàng ti t ki m chi phí, ng ủ qu c gia khu v c t c n thi t ể thi t lập ọ ( ) bên Trung tâm ữ công vi c nhữ ời cộng tác t Trung tâm thi t lập ọ qu c t phả ợc lặp l i PTN khu v c, nguyên tắc c n ảm bảo s toàn vẹn tập qu c gia khu v c ă 1975 ã ợc ổ sử ổ ă 1982 [3] ổ v ă 1999 [4] ă 2004, ủ khuy n khích s phát triể ng dẫn chi ti t v vi c t t ập t ấ bổ sung ph n B phiên t ể áp dụng cho chất t ấ ợc cung cấ " t c" khu v c /qu c gia, ch không ụ chuẩn v (Working standards) ả x ất (NSX) PTN khác Tuy nhiên, v nguyên tắc, tiêu chuẩn ủ t ấ b i NSX ợc xem "chuẩn làm vi c" cách sử dụng tr Mụ vi c t t ập ể t ợ ộ xác ộ k t phân tích theo u c u kiểm sốt ất ợ ợc phẩm nói chung Các chất t ợc chuẩn b b i ộ khu v c qu c gia ặ ể ợ ủ ủ ục Quả ý ợc Trong Guideline này, vi c sử dụng ọ ợc coi ph n chuyên ậ ợ ợc sử dụng tr t tính, xá ộ tinh t ợ t ất tr v t ẩ Mụ vi c t t ập t ấ ể sử dụng phân tích t ể t , xá ộ tinh t, v ặc bi t, ợng ợc chất tr ợc phẩm M ộ thử nghi m t ấ t v ấ i u c n thi t t ấ ợ ẩ v ấ hoặ k ợc công nhậ r tr ờng hợp nghi ngờ k t tranh chấp sử dụng th cấp, thử nghi ợc lặp l i cách sử dụng ấ Vi c th t lập ọ d a vi á k t thử nghi m phân tích Báo cáo t ẩ ả ợc s chấp thuậ v ợc thông qua b i ặ ụ L Vi c t t ập tr TCCL qu c t , qu c gia khu v c Mỗi chất t ợc thi t lập cho mụ ụ thể, ợ t ụ L N ợc sử dụng cho mụ k t trách nhi m củ ời sử dụng, ột thích hợ ợc bao gồm tờ thông tin kè Guideline liên quan v i ấ v t ấ Vi c ọ nên tuân thủ yêu c u củ h th ảm bảo chất ợng, bao gồm nguyên tắc GMP GLP [5-10] tr t có nguồn ậ ủ ợc yêu c u v t t lập tùy thuộc vào s sẵn : ọ : chất ồng ã ợ xá ể dùng phép thử ã ợc nh v hóa học, vật lý sinh học Trong phép thử t ất chất i chi u ợc so sánh v i tính chất chất c n thử Chất i chi u phả ộ tinh t phù hợp v i mụ dụng ọ ấ ất ợc th a nhận có chất có ợ ợc nh v ợc chấp nhận so sánh v i chất hóa học k ợ ột phù hợp ã , tr ợng mà không c n ọ t ấ chất ặ ể ợc nh và/hoặc hi u chỉnh t hóa học ấ M c ất ợ v ặc tính thử nghi m ọ t ấ t ấ ột hóa học ấ Mặ ĩ t ể áp dụng cho s chất gọi "chuẩn làm vi c", ph n B Guideline nhằm áp dụng cho chất t ấ ợc cung cấp "chính th c" khu v c/qu c gia, khơng ụ ẩn làm vi ủ NSX PTN khác q ố ế (International Chemical Reference Substance – ICRS) ọ Qu c t (ICRS) Ủy ban v TCKT ợc phẩm thử vật lý hóa học tr ợ ển t Các ICRS ợc sử dụ ấ ợc t t ập chuyên gia ủ ợc cung cấp chủ y ể sử dụng ợ mô tả ậ t ả ủ D ợc ể ẩ t ấ ặ tr ợ ể ợc ỉ r ph n gi i thi u ủ General requirements for the competence of reference material pro r (yêu c v ă c NSX ) chất ợc t t ập phân ph i b i nguyên tắc chung củ ng dẫn C ý, cung cấ dùng thông tin v giấy ch ng nhận phân tích ngày h t h n" [9] : i ả ời P ầ A (Primary CRS) ầ A.1 ánh giá ế vệ ế ậ Sản xuất, á, Bảo ả Phân ph i tr t n t n thời gian Nhu c u cho m i phát sinh x ti ẩ kỹ t ật (TCKT) cho ợ chất m i sản phẩ ã ợc ấ ợ xuất TCKT yêu c u t t lập ọ ể sử dụ ột ất chuẩn so sánh Vì vậy, vấ u tiên ợc á qu tr ợc t ẩ mà khơng ất chuẩn so sánh hay không ? tr t ợc sử dụng TCKT ủ ợc chất phẩm yêu c u ọ là: - Quang phổ hồng ngo i (IR), cho dù mụ nh tính ợng; - Quang phổ hấp thu tử – k ả k (UV-VIS) ; -P so màu, cho dù t t hay ả ; ắ ký ụ nh tính hoặ ợng; ợng (bao gồm á t ộng ) d a kỹ thuật tách phụ thuộc vào chất giữ v ộ xác ủ tr phụ thuộ v u ki n t khác ữ PTN; ợ , t ờng ẩ ột ểt (titrimetric) ặ k t k ợ d a ật tá ụ ợ (stoichiometric); -P ợng d a ă ất quay ; - á u ọ bao gồm tỷ l c nh thành ph ợc bi t (ví dụ: ỗ ợ ồng phân cis/trans, mẫu t t ẩ ) A.2 N ê ệ ế ậ Nguồn nguyên li u t t ậ t yêu c u chất ợng ợ chọn t lô ợ chất ợ sản xuất theo qu tr bình t ờng, n ộ tinh t chấp nhậ ợc t ti p tục c n thi t ể ợ sử dụ ột hóa học Yêu c ộ tinh t cho ọ phụ thuộc vào mụ dụng Một ọ cho t nh tính khơng át k t, s hi n di n tỷ l nhỏ t p chất t ờng khơng có ả tr kiểm tra nh tính Mặt khác, ợc sử dụng thử ợ có m ộ tinh t ất Theo nguyên tắc Guideline, ộ tinh t 99,5% hoặ ợ mong ợ , tính tốn d ng khan k chất dễ , tr tr ờng hợp t ặ tr phân tích k , m ộ tinh t tr ủ ọ không c n thi t Trong vi c quy t nh v s phù hợp hóa học, ắ quan trọng ả t p chất v k t ả ợ tr không t ặc hi u Các t p chất v i t ất ýt t v it ất ủ t ất khơng làm giảm tính hữu dụng ọ , ột ợ v t t p chất v i tính ất khác n cho chất không phù hợ ể sử dụng nh ột ọ Khi nguồn nguyên li u sử dụng v t t ậ ọ ợ lấy t nhà cung cấp, nhữ ữ t ợc cung cấp: k ểm nghi m v t t ủv t nghi m, giá tr tìm thấy, s t , phổ và/hoặc ; - Các k t nghiên c ộổ nh ã ấ t v ); - Thông tin v u ki n ả ả t n thi t ể ảm bảo ộ ổ nh (nhi t ộ v ộ ẩm); - K t nghiên c u v ộ ẩ và/hoặc tr t ẩ nguồn nguyên li u; - Xá nh t p chất ợc phát hi n và/hoặc thông tin cụ thể v t i ợ xá tr n thành ph n / tỷ l ph tră kh ợng t p chất; - Tài li u cập nhật v an toàn v nguy v s c khỏ n nguyên li u v ợ chất m i, NSX phải nhận th c v xây d ng ậ c n thi t, lô ợ chất m ợc ể sử dụng t t ậ ọ mong ợ ủ ể chia sẻ lô nguyên li u, ợ chất ợc sử dụng cho á t nghi k u ỏ tr ổi thông tin liên quan n quy trình t t ập , NSX , sẵn có v u ki n cung cấp A.3 ánh giá C S phù hợp chất ợc sử dụ ột ọ ỏi thẩ nh cẩn thận b i C n thi t ể xem xét tất li t ợc t thử nghi m lo t á t tổ thể, u ảm bảo ột chất thích hợp cho mục dụng M ộ phân tích yêu c u phụ thuộc vào ụ mà ọ ợc dụng, vào s ợ PTN ộc lập t t ẩ A.3.1 Trong ể sử dụng t t (quang phổ IR và/hoặ nguyên li u chất ợng t t ợc tuyển chọn t trình sản xuất n ộ tinh t chấp nhậ ợ t bổ sung b i c dụng t mà chất d nh ụ ụ PTN ể áp dụng tất t hóa lý mơ tả s t nghi m, ch ng h t vô sinh ộ ộ t thi t cho nguyên li u d nh ụ A.3.2 ộ i k iế x SK), lô t yêu c u n thi t Kiểm tra quan trọng nh tính Thơng t ờng ậ có liên quan; vi khuẩn, khơng c n L cho ọ ể sử dụng vi xá nh ột t p chất cụ thể rộ , ặc bi t k ợc sử dụng thử nghi m xá gi i h n (LOD, LOQ) N u kỹ thuật sử dụng sắc ký l p mỏng (SKLM), ộ tinh t t i thiểu chấp nhậ ợc t t ờng 90%, t ất 95% ợc yêu c u cho sắc ký lỏng (SKL), sắc ký khí (SKK) T ủ ể có PTN á ợc sử dụng t ộ tinh t N u xuất ợc phân lập l u tiên, t m hóa ý ộ ng t h t nhân (NMR), ổ k (MS) phân tích nguyên t , phả ợc áp dụ ể xá A.3.3 N u ọ ợc sử dụng t ợng ( u, SKL, SKK hay quang phổ UV), ộ thử nghi m nhi u T i thiểu ba PTN nên hợp tác thử nghi m chất ợ xuất, sử dụng lo t kỹ thuật t ợc t t ập á, bao gồ á ợc sử dụng Các ng t i ộ ấp thu t i t p chất hi n phả ợc kiểm tra t nghi k ặc hi ợc sử dụng, ví dụ quang phổ UV Khi t m chọn lọ ợc sử dụ , ặc bi t quan trọng xá nh s ợng t p chất r tr ờng hợp này, t t kiểm tra ợ xuất b i t ể ụ kể pháp t i v ε / A1 ) i v i chất có tính acid base, chuẩ ộ t ể t ả , phản k ợc bi t ể t t ật tá ụ ợ ả ợc sử dụng phân tích ộ i i i i differential scanning calorimetry - DSC) ợc sử dụ tr tr ờng hợp nh Tổng ợ c, ợ dung môi hữ , ợ t p chất v thành ph n hữ v 100% iv ih uh t dành cho thử nh l ợng, ợ ợc thể hi n " " thi t lập ọ , c n thi t ả xá nh ợ c dung môi tồ v t ợng không t, v xá nh ợ t p chất v t ợng chọn lọc A.3.4 T i ẩ ủ iế Các ọ ợc sử dụng vật li u hi u chuẩn t t t m ộ thử nghi m t t ột ọ sử dụng thử ợng PTN nên hợp tác thử nghi m xuất ằ sử dụng lo t kỹ thuật ể kiể tr ộ tinh t ó ợ k ã ợ x x t ợ , ợ v ủ hợp tác c ng tham gia t ất 03), ể thi t lập giá tr cho TCKT cơng cụ thích hợp A.4 C hóa lý ụ vệ á ợc sử dụ ể thi t lập s phù hợp t ằ tr hai nhóm sau: chủ y u nhằm xá nh chất sử dụ ể thi t lậ ộ tinh t V i h u h t á , tỷ l ph tră ộ tinh t ọ ẽ hi ột giá tr t i n u t p chất k ợc xác ộ tinh t t t ậ c tính d a li t ợc ữ pháp phân tích khác A.4.1 P ể nh tính CĐC Một ợ ngh chất có cấ tr ợ xá nh cách ỉ ,v danh ó ợc xác nhận cách ợ ữ ổ IR chất v ổ ủ mẫu ẩ ã ợ xá t ặc bi t ý [8] ữ kỹ thuật cao tk , ổ NMR, MS Nhiễu x t x, thể ợ ể danh nh tính d nh thay th hóa học k ã ợc t t ập c ấ tr phân tử phả ợc xác minh, ể xá nh tính chất ặ tr ả hai gi ng mụ ,t ủ ể so sánh phổ IR ủ , tr tr ờng hợp ợ xuất khơng có sẵn ất ẩ ã xá t ể so sánh, t c n ả xác t ất cách áp dụng kỹ thuật phân tích hi n ểt ẩ v hợp chất m i ữ t bao gồm: phân tích nguyên t , t t t ể ọ ễ x t ), ổ k (MS), ổ ộ t t (NMR), phân tích nhóm ch c (quang phổ IR UV) t bổ sung khác theo yêu c , ể thi t lập chất ợ xuất t ặ tr A.4.2 P ụ ểx ộ i k iế ủ CĐC Cá t ụ ợc chia thành ba lo i: - mà yêu c u so sánh v i ẩ (ví dụ: SK ổ); - mà phụ thuộc hoàn toàn vào t ất nội t i ủ ất ( ộ t phân tích pha t t ợ v ); - cá k A.4.2.1 ỹ t tr ật tá ợc sử dụng cho vi xá ộ tinh t ả ợc x t ẩ v i yêu c u t phù hợp h th ng t hợp P SK: t a tách SK ặc bi t hữu ích cho vi c phát hi n xá nh t p chất Sắc ký lỏng hi ă SKLHNC) SK sử dụng rộ rã ất, SKLM SKK Các ấ tử riêng lẻ tách ợ bằ SK k ợ ẩ v xá t ất ủ họn lọc SKLHNC SKK t ờng t t SKLM Cả hai ợi th dễ dàng áp dụng t ợ , ỏi thi t b ph c t H t SKLHNC sử dụ phát hi ằ ổ giá tr ặ t ph thử ợng ằ ổ UV B c sóng UV phát hi n t p chất ọ ợc l a chọn ng phát hi n t p chất t t Khi ng c sóng phát hi n ữ k , ột chỉnh thích hợp phả ợc th c hi ể c tính ợ t p chất SKL phát hi n ằ ã hữ ể ghi l i phổ UV ủ ả t p chất SKL phát hi ằ k ổ ợc sử dụ ể nh tính t p chất tá ợ t , v ặc bi t quan trọng khơng có ất chuẩn k ổ IR tham chi u P SKK ợc sử dụng cho t ợ SKLHNC, v t p chất ợc xá , SKK có giá tr ặc bi t phát hi v xá nh t p chất dễ tr , bao gồm dung môi tồ SKLM sử dụng ụ ụ ản không t n kém; kỹ thuật dễ th c hi n áp dụng ộ microgram Nó tách hợp chất liên quan , ồng phân hình học ợ ất ấ tr t t Tất thành ph n chất t ể xuất hi n sắ ký Tuy nhiên, s thành ph n cịn v x ất át, s di chuyển v i dung mơi, s d chuyển vậ t v thành ph n s khơng ợ phát hi n Do , t ể ợ tă ờng cách sắc ký hai chi u cách sử dụng s h dung môi khác v nhi át hi n Trong s tr ờng hợp SKLM ợc sử dụng ể nh ợ v ộ chấp nhậ ợc cách sử dụng má t ật ộ (densitometer) ả : ả (CE) ổ bi n Nó ợc xem xét bổ sung cho SKL ể phát hi n t p chất A.4.2.2 P tr t ất t ộ ọ á tr ờng m ộ t p chất t tr u ki n t i t t ợ v (Differential scanning calorimetry): kỹ thuật ợc sử dụ ể kiểm tra s hi n di n t hình khác v ể xá nh t p chất rắn t ộ tinh t d oán d tr xá nh ả mẫu t ổ tr ểm chảy gây b i s hi n di n t p chất t t ể ợc th c hi n nhanh chóng v ộ xác cao Tuy nhiên, khơng áp dụng ợ n u chất phân hủy tan chả u gi i h n giá tr ụ củ ột quy trình chung cho xá ộ tinh t k t ể ụ n u ất rắn t ch -P t ộ hòa tan tr : k ợc sử dụ , tr h n ch tr t n thời gian Nó ợc sử dụ ể phát hi n chất nhiễm v (bao gồm )v ể v k ủ k ợ tr ất ) Một s y u t ụ là: s ủ chất trình phân tích, hình thành dung d ch tr t rắn t tr thành ph n k A.4.2.3 P P - Quang phổ hấ t k r r ổ ặ tr k ợ kể hoặ - Quang phổ IR ợc sử dụ - Phổ NMR, công cụ phổ P ẩ ột ểt P ẩ ột ểt ộ tinh t pháp khác ổ t ọ t t v k y Vi c sử dụ ể xá ộ tinh t, phát hi n t p chất ấ t ặ tr , n hợp chất có ch a ấ t tr v t t nhau, c ể nh t v xá nh tỷ l ồng phân hình học ả v hữu ích vi xá ộ tinh t cung cấp t n có giá tr ể xác nhận vi c xác nhận giá tr ộ t t t ợc t ể danh quay (Circular dichroism spectrometry) ợ xá nh bằ , t ặ ổ ể ợng mang l i k t xác 6.6.8 ấ ứ Ả ng nhóm th ộ d ch chuyển C gắ v C2 có s tă t nh ti n v vùng t tr ờng thấp (I > Br > F) δC ộ ố 6.6 ấ ợ ất d vòng no t ổi ph c t p V i enua alkyl ò 50 ợ ất d vịng khơng no Ngun tử C d v t t d vòng Trong nhân pyridine, mật ộ chuyển v tr ờng thấ t i v tr v trí nên d ch chuyển v tr ộ d ch chuyển 105 – 170 ppm tùy theo cấu trúc t tập trung t i v trí 2,4,6 nên hi u ng d ch ợc l i pyrol, mật ộ n tích âm tập trung t i 52 Độ ể 13 C-NMR ủ ấ ữ 54 P ổ 13C-NMR-DEPT (Distortion Enhancement by Polarization Transfer) 13 Các kỹ thuật khử C-1H giúp lo i bỏ hoàn toàn s ghép lo i bỏ ph n, giữ l i s thông tin v bậc C v i s ỉnh tuân thủ qui luật n+1 Tuy nhiên, vi c xác nh gặp nhi k k ă ất hợp chất có ch a h t nhân 13C có  g n k nhau, che lấ , k k ă v c giả ấu trúc Kỹ thuật DEPT v i thời gian phân tích hợp lý, th c hi tr ợng mẫu nhỏ ồng thời 13 xá nh xác s proton gắn vào C phân tử, dễ dàng bi n giải phổ Kỹ thuật E ợc th c hi ồng thời hai kênh 1H 13C lo t xung ph c t ã ợ tr ồm có xung thời gian nghỉ) H chuỗi xung C có gắn một, hai, ba hydrogen ợc máy ghi thành pha khác Th c hi n l n ghi phổ DEPT khác t ợc nhi u thông tin vể lo i C: Phổ DEPT 45: C có mang H cho tr ổ Phổ DEPT 90: Chỉ có -CH- (methine) cho xuất hi n tr ổ Phổ DEPT 135: C lo i >CH-(methine) -CH3 (methyl) xuất hi n phổ nhữ >CH2 (methylen) xuất hi ng v chi ợc l i v < ậ k r k x ất hi n phổ DEPT 4D 32 Mi C6 C7 C10 C8 C2 C9 C1 DEP C4 C3 C5 56 4D 33 (a) 13C-NMR k ủ I CDC 3, (b) DEPT 135; (c) DEPT 90 Xét phổ 13C-NMR phân tử ipsenol (a) Phổ khử ghép proton: cho bi t tổng s C có phân tử 10 (b) Phổ DEPT 135 cho bi t có: C (>CH- -CH3) C (>CH2 ) (c) Phổ DEPT 90 cho bi t có: C (>CH-) Vậy phân tử 10 C (>CH2), C (>CH-), C(-CH3) v P Ổ MR AI ậ I U (2D-NMR) ệ ợc phát triển b i nhà hóa học Thụ ĩ Er t v t ập niên 1980 v ă 1991 ổ ản hóa vi c bi n giải phổ NMR t u lo i h t ng dụng l v ĩ v c Y- ợc Hóa học Các lo i phổ 2D-NMR bao gồm: ổ Y (1H-1H correlation spectroscopy): phổ t ữa proton-proton 13 Phổ HETCOR ( H- C heteronuclear chemical shift correlation) ổ (Heteronuclear single quantum correlation) ổ t r r t t r ) v MBC (Heteronuclear multiple bond coherence) ổ E Y r v r rE tL tr ) Kỹ thuật 2Dt giả í ệ ổ 2D-NMR Ta c n phân bi t phổ 1D 2D-NMR 1D-NMR: có trục hồnh trục t n s trục tung trụ 2D-NMR: trục hoành trục tung trục t n s , trụ P ổ O Y( e e ộ ộ chi u th 3, ; 1H- 1H) Phổ COSY cung cấp thông tin s ghép cặp proton phân tử ĩ ồng nhân (homonuclear) S ghép proton phân tử ợ xá nh th c nghi m hai l n cộ ễ xá r t ã ặp v i phân tử: proton gem (germinal: hai proton gắn C), proton vic (vicinal, hai proton gắn hai C k nhau), proton ghép qua nhi u n i g n v khoảng cách khơng gian Trên phổ COSY có hai lo i tín hi u: ờng chéo (diagonal signals): o Biễu diễn tín hi u phổ 1D 1H-NMR nằ tr ợc dùng làm nhữ ểm chuẩn cho phân tích nhữ ể ờng chéo o Mỗi tín hi u nằ tr k k t ờng ngang hoặ ọ ẽ gặp tín hi u cộ t ng nằm trục tung trục hồnh bi ờng chéo (off- diagonal signals); tín hi u giao (cross pics) o Ch ng minh s hi n hữu vi c ghép cặp (ngang qua liên k t hóa tr ) hai h t nhân, cho bi t proton phân tử ã ặp v i o T tín hi u giao kẻ ờng chéo ch r t ể i x ng gi ờng th ng song song v i trục tung trục hoành cắt ngang ãt t ng Do phổ t i x ng nên có ờng chéo 4D.34: P COSY ủ 2-amino 1,5 dicarboxylic propan ổ Y-NMR (300 MHz) 21,5 r x r P ổ E OR ( e e e e f e t ấ J2-3; 2J2-4 ; - 13 ) v Q Phổ HETCOR cho bi t proton gắn tr c ti p v i d nhân (13C; 15N) s liên quan tín hi u proton hay s ghép 1JC-H ổ E t s liên quan tín hi u proton 13 H chi u F1 (trục tung) v i tín hi u C chi u F2 (trục hoành), ngang qua s ghép n i 1JC-H Do thông tin v  khác hai chi u, nên phổ E k i x ng không ch ỉnh nằ tr ờng chéo mà ch ỉnh giao hiển th proton ã ắn v i C phân tử ợ ể xá nh m i liên quan này, t tín tín hi u cộ ng vẽ ờng th v n ợc giao Có b n khả ă xả r tr tr ờng hợp 58 ờng th ng không giao v i ể → tử C không gắn v i proton N u có tín hi u giao ngun tử C gắn tr c ti 1, r t ý tr ờng hợp có proton gắn vào C hoặ r t t ọc v i s trùng lắp tình cờ N u có hai tín hi u giao tr ờng hợ ặc bi t v i hai proton có tính xun lập thể (diastereotopic protons) gắn vào nhóm methylen Tín hi r t k t v i r ờng hợp proton gắn v i d t (-OH; - …) Kỹ thuật HETCOR c ợng mẫu l ể pha thành dung d v i nồ ộ ≥ 0,5 v khoảng hoặ u nồ ộ mẫu loãng ể khắc phụ ợ ểm ời ta dùng ph n m ổ F rr r F ) v ể có kỹ thuật v 13 13 Hai kỹ thuật khảo sát H ghép cặ ,t u C chi u F1(trục hồnh) tín hi u proton F2 (trục tung) Trong th c nghi ợ ộ dụng thêm kỹ thuật khử , ộ nh 4D.35 P 7.5 P ổ M C 300M MB ( e e ủ I e CDC eb e e e; 2J -H 3JC-H) Phổ HETCOR, HSQ , u cung cấp thông tin v s proton gắn tr c ti v , ĩ 13 hai h t nhân C 1H cách b i n i hóa tr r k ổ HMBC cho tín hi u củ t tá x , k t (2JCH; 3,4 JCH) k t tác 1JC-H Kỹ thuật HMBC khơng thể phân bi t ợc tín hi u giao 2J tín hi u 3J hai lo i hi n di n Ngoài kỹ thuật , ã t ợc cách gián ti t tá -C (mặc dù không 13 13 phải h t nhân C-C ), giúp hiểu bi t v cấu trúc hợp chất c n khảo sát Tuy nhiên vi c bi n giải phổ k k ă v ải có s kè HSQC hay HMQC 4D.36: P M C 300M ủ I ( 4D ) T tín hi u carbinol C4 (68 ppm) kẻ ờng chấm nằm ngang t trái sang phải gặp tín hi u r ă t u giao khơng tín hi u thể hi n 1JC4-H4 t 3,8 r ă t hi t ng v i proton xuyên lập thể, t nhóm methylen v trí s 60 2JC4-H3 t i 1,45 ppm 2JC4- 3’ t i 1,28 ppm; v r t t t v trí s 2JC4-H5 t i 1,48 ppm 2JC4- 5’ t i 2,22 ppm; tín hi u proton methine 2JC4-H2 t i 1,82 ppm Qua t gián ti p m i liên l c >CH-OH v i nguyên tử α v β T tín hi u C3 (47 ppm) cho thấy có tín hi t ng v i 3JC3-H1 t i ppm; JC3-H2 t i 1,82 ppm; 2JC3-H4 t i 3,8 ppm; 3JC3-H5 t i 1,48 ppm; 3JC3- 5’ t 2,22 ppm T tín hi u C5 (41 ppm) cho thấy có tín hi t ng v i 3JC5-H3 t i 1,45 ppm; JC5- 3’ t i 1,28 ppm; 2JC5-H4 t i 3,8 ppm; 3JC5-H7 t i 6,39 ppm; JC5- 6’ t i 5,09 ppm Lậ ảng tổng hợp giúp giải quy t t ột tá t ể tr ổ, c ý: 13 Sắp x p C H theo th t li n k t ặt mà gắn vào K sát hai bên C n i tr c ti p v i H (n i), α m β N u C khảo sát không trông thấ α ặ β ĩ α, β ậ Carbon C1- 1’ C2 C3 C4 C5 C6 6’ C7 C8 Proton (ppm) 22; 21 23 47 64 41 145 120 140 115 H-1ab 0,93 n i α β H-2 1,82 α n i α β H-3a 1,45 β α n i α β H-3b 1,22 β α n i α β H-4 3,83 β α n i α β H-5a 2,48 β α n i α β β H-5b 2,22 β α n i α β β H-6’ 5,09 β α n i β H-7 6,39 β α β n i α H-8a 5,09 β α n i H-8b 5,16 Β α n i 7.6 P ổ OE Y v ROE Y ( e / -frame Overhouser enhancement spectroscopy) ổ ấp thông tin v cấu d ng phân tử hay v trí g n hai proton Ha Hb không gian (không kể n s n i hóa tr giữ ) , t nhân mu n có hi u ng chúng phải g n khoảng 0,3 nm (t t ≤ 0,25 ) Phổ E Y ợc trình bày g n gi ng phổ Y, ĩ trục hoành trục tung phổ 1H Tuy nhiên, s khác bi t hai phổ là: tín hi tr E Y t ợ tr v c hai proton k bên v khoảng cách không gian Phổ ROESY kỹ thuật cải ti n d a NOESY, rút ngắn thờ ổ ặc tính v k t c, kh ợng phân tử, hình d , ộ nh t… ẽ ả n vận t c phục hồ v t ả n vi c quan sát phổ NOE Phổ NOESY th c hi n ph xá nh cấu trúc hóa lập thể hợp chất vẫ tỏ b i ph k ã t c hi n B i phổ E Y ợ ể ộ tín hi u l thuộc nhi v t ộng phân tử khảo sát v i phân tử có M > 1000Da ộ nh t cao phổ NOESY cho tín hi u âm Ví dụ: dẫn xuất cyclobutane có hai cấu d ng (A) (B) Phổ NOESY cho thấy có s giao o-proton củ t t v i proton H1, H2, H4 o-proton th hai củ t t hai v i H1, H2 mà có cấu d ng (B) m i thỏ ã ợc 4D 37 P 7.7 P ổ NOESY ủ q 13 ẫ x ấ C-13C 2D-INADEQUAT (Incredible natural abundance double quantum transfer experiment) Phổ 2D-INADEQUATE cung cấp thông tin v s t ữa hai h t nhân 13C-13C, cho bi t phân tử C k sát C Kỹ thuật ợc l a chọn cho vi c phân tích cấu trúc ph c t p mà li u phổ NMR khác không giúp bi n giả ợc cấu trúc 13 chất tỉ C t nhiên thấ 0,01 , xá ất ể 2C gặp 0,01 x 0,01= 0,0001, ĩ tr 10 000 tử có phân tử át ợ ộ Vì th ộ nh y củ ể ổ 2D-INADEQUATE phải l n t n nhi u thời gian 62 Phổ có hình d ng gi ng v i COSY, khác khơng có tín hi trình bày tín hi u giao Phổ 13C-NMR menthol cho thấy có 10 tín hi t ng δ 4D 38 P 2D-INADE A E ủ M T tín hi 70,9 tr ờng chéo kẻ ờng th ng song song trụ F2, ểm giao trục song song F1 l i 50,4 v 40,6 ĩ gắn v i CH CH2 ờng chéo mà ờng th ng cắt 70,9 ã ÀI IỆU AM K ẢO Ti ng Vi t Nguyễn Hữ ĩ , r n Th 1998) Ứng dụng s ổ nghiên c u cấu trúc phân tử NXB Giáo Dục Hà Nội Nguyễn Vi t Kình (2013) Khảo sát cấu trúc flavonoid phổ NMR Tài li u học tập v t t t nghi ợ ĩ i học Nguyễn Kim Phi Phụng (2005) Phổ NMR sử dụng phân tích hữ i Học Qu c Gia TP.HCM Ph L 2007) á ổ xá nh cấu trúc hợp chất hữu tr t i họ k ợ , i Học Yợc TP.HCM Ti ng Anh r x r 1998) t tr t t r tr Wiley-Interscience publication p.1-87 Bernard Blumich (2006) Essential N r t t r L r r P.1-57 E Breitmaier (2003) Structure elucidation by NMR in organic chemistry A practical guide p.1-67 11 R.M.Silverstein, Francis.X.Webster (2005) Spectrometric identification of organic compounds John Wiley & Son New York, Toronto p.127-162 64