Đang tải... (xem toàn văn)
Nguyen Van Hieu ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN VĂN HIỆU Tên đề tài “PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG CỦA BACILLUS SUBTILIS CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO LÀM CƠ SỞ CHO VIỆC CHẾ TẠO CHẾ[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN VĂN HIỆU Tên đề tài: “PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG CỦA BACILLUS SUBTILIS CÓ KHẢ NĂNG SINH PROTEASE CAO LÀM CƠ SỞ CHO VIỆC CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC DÙNG TRONG CHĂN NI” KHĨA LUẬN THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : CNSH Lớp : 42 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hương dẫn : GS.TS Nguyễn Quang Tuyên TS Nguyễn Văn Duy Thái nguyên - 2014 n LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập nghiên cứu để hồn thành khóa luận tốt nghiệp nhận hướng dẫn, giúp đỡ động viên thầy cô, bạn bè gia đình Nhân dịp hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS TS Nguyễn Quang Tuyên – Viện khoa học sống – ĐH Thái Nguyên trực tiếp hướng dẫn, bảo tơi suốt q trình thực hồn thành khóa luận Xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Văn Duy - Khoa CNSH & CNTP Đại học Nông Lâm Thái Nguyên cán môn Vi sinh vật Khoa CNSH & CNTP Đại học Nông Lâm Thái Nguyên nhiệt tình giúp đỡ bảo tơi Xin chân thành cảm ơn ThS Đỗ Bích Duệ tất cán phịng thí nghiệm – Viện khoa học sống – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô, bạn bè giúp đỡ động viên tơi suốt q trinh hồn thành khóa luận Lời cảm ơn sâu sắc tơi xin dành cho gia đình người thân yêu Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Văn Hiệu n DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Các phản ứng sinh hóa Bacillus subtilis Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 14 Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 15 Bảng 3.3: Thành phần môi trường MPA dạng thạch 16 Bảng 3.4: Môi trường định tính khả sinh tổng hợp protease [19],[30] 16 Bảng 3.5: Mơi trường thử hoạt tính enzyme protease [24] 16 Bảng 3.6: Môi trường lên men đường maltose 16 Bảng 3.7: Môi trường Simmons Citrate Agar 17 Bảng 3.8: Môi trường khử nitrate 17 Bảng 3.9: Mơi trường lịng đỏ trứng 17 Bảng 3.10: Môi trường Clark Lubs 18 Bảng 4.1 Kết phân lập vi khuẩn nghi ngờ Bacillus subtilis từ mẫu đất 28 Bảng 4.2: Kết thử phản ứng sinh hóa chủng vi khuẩn phân lập 33 Bảng 4.3 : Kết đo bán kính vịng phân giải casein 10 chủng vi khuẩn phân lập (mm) 36 Bảng 4.4 : Kết đo tốc độ sinh trưởng hoạt độ protease chủng 37 Bảng 4.5: Kết thí nghiệm ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme protease vi khuẩn KTC1 38 Bảng 4.6: Kết thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh trưởng sinh tổng hợp protease vi khuẩn KTC1 40 Bảng 4.7: Kết thí nghiệm ảnh hưởng pH đến sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme protease KTC1 41 n DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Vi khuẩn Bacillus subtilis Hình 4.1 : Đồ thị đường chuẩn Tyrosine 26 Hình Hình thái khuẩn lạc tế bào vi khuẩn phân lập 32 Hình 4.2 Kết phản ứng sinh hóa xác định Bacillus subtilis 34 Hình 4.3 : Vịng phân giải casein chủng KTB2, KTB4, KTC1 36 Hình 4.4 : Đồ thị biểu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme protease vi khuẩn KTC1 39 Hình 4.5: Đồ thị biểu ảnh hưởng nhiệt độ lên khả sinh trưởng sinh tổng hợp protease vi khuẩn KTC1 40 Hình 4.6: Đồ thị biểu ảnh hưởng pH đến sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme protease KTC1 42 n DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT THUẬT NGỮ VIẾT TẮT DIỄN GIẢI H MPA Malt-Peptone-Agar OD Optical Density VSV Vi sinh vật n MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài 2.1 Sơ lược vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát 2.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.1.4 Đặc điểm nuôi cấy 2.1.5 Đặc điểm sinh hoá 2.1.6 Bào tử khả tạo bào tử vi khuẩn Bacillus subtilis 2.2 Giới thiệu enzyme protease 2.2.1 Tổng quan enzyme Protease 2.2.2 Phân loại đặc điểm protease 2.2.3 Chức sinh học protease vi sinh vật 2.2.4 Tính ưu việt ứng dụng protease vi sinh vật 2.2.5 Những nghiên cứu phân lập, tuyển chon, thu nhận enzyme protease từ Bacillus nói chung Bacillus subtilis nói riêng 12 PHẦN ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Đối tượng khảo sát 14 3.2 Thời gian địa điểm thực đề tài 14 3.2.1 Thời gian : 23/12/2013 – 31/5/2014 14 3.2.2 Địa điểm 14 3.3 Hóa chất thiết bị sử dụng 14 3.3.1 Hóa chất 14 3.3.2 Thiết bị dụng cụ 14 3.3.3 Môi trường sử dụng 15 n 3.4 Nội dung nghiên cứu 18 3.5 Phương pháp thực đề tài 19 3.5.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ đất 19 3.5.2 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính protease cao 23 3.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên khả sinh trưởng tạo enzyme chủng vi khuẩn 27 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28 4.1 Kết phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ mẫu đất 28 4.1.1 Kết phân lập vi khuẩn nghi ngờ Bacillus subtilis từ mẫu đất 28 4.1.2 Kết khảo sát đặc điểm sinh hóa chủng vi khuẩn nghi ngờ Bacillus subtilis 32 4.2 Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả tổng hợp protease 35 4.2.1 Kết khảo sát vòng phân giải 10 chủng phân lập 35 4.2.2 Kết khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme protease chủng KTB2, KTB4, KTC1 37 4.3 Kết nghiên cứu điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme prorease vi khuẩn KTC1 38 4.3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme protease chủng vi khuẩn KTC1 38 4.3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên khả sinh trưởng sinh tổng hợp enzyme protease chủng vi khuẩn KTC1 39 4.3.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường lên khả sinh trưởng tạo enzyme chủng vi khuẩn KTC1 41 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.2 Kiến nghị 43 n PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, kinh tế ngày phát triển với tiến khoa học làm cho sống người có nhiều thay đổi lớn Càng ngày đời sống vật chất cao, nhu cầu chất lượng sản phẩm tăng cao đòi hỏi nhà sản xuất phải nâng cao chất lượng sản phẩm để đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng Với mục đích bảo vệ sức khỏe cho người sử dụng sản phẩm chăn nuôi, bảo vệ môi trường sống không bị nhiễm hố chất độc hại, người ta hạn chế cấm sử dụng số loại thuốc, đặc biệt thuốc kháng sinh thay thuốc kháng sinh chế phẩm sinh học Chế phẩm sinh học dạng thức ăn bổ sung vi sinh vật sống, có tác động có lợi đến động vật thông qua việc cải tiến cân vi sinh vật đường ruột Tác dụng chế phẩm sinh học làm tăng khả tiêu hoá nhờ hệ thống enzyme, tổng hợp vitamin nhóm B vitamin K manh tràng đại tràng, trung hoà độc tố ruột, khử độc phân huỷ số chất có độc tính [11] Protease nhóm enzyme sử dụng rộng rãi chế phẩm sinh học Người ta thu enzyme protease từ nhiều nguồn khác động vật, thực vật vi sinh vật Tuy nhiên thu enzyme từ thể động vật hay thực vật khó khăn tốn thường phải phá bỏ tổ chức để thu enzyme trình bảo quản phức tạp Trong vi sinh vật đặc biệt vi khuẩn có chứa nhiều loại enzyme có hoạt tính cao Chúng lại có khả chuyển hóa chất sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lại thường rẻ tiền, người ta dể dàng điều khiển tổng hợp enzyme từ nguồn nguyên liệu khác [12] Vì vi sinh vật nguồn thu enzyme tiềm Trong nguồn thu protease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng việc thu protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis lồi vi khuẩn phổ biến dễ phân lập, thu enzyme enzyme thường có hoạt tính cao có nhiều ưu hẳn [7] n Từ thực tế trên, tiến hành thực đề tài : “Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả sinh protease cao làm sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả sinh protease làm sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi 1.3 Ý nghĩa đề tài - Ý nghĩa khoa học Phân lập loài vi khuẩn Bacilussubtilis từ đất, tuyển chọn chủng có khả sinh protease Biết hiểu rõ thoa tác kĩ thuật thông số quy trình cơng nghệ q trình thực đề tài - Ý nghĩa thực tiễn + Làm tiền đề cho việc sản xuất chế phẩm sinh học, đáp ứng yêu cầu cao ngành chăn nuôi n PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát Bacillus subtilis phát phân ngựa vào năm 1941 tổ chức y học Nazi Đức Lúc đầu sử dụng chủ yếu để phòng bệnh lỵ cho binh sĩ Đức chiến đấu Bắc Phi Việc điều trị phải đợi đến năm 1949 1957, Henrry cộng tách chủng khiết Bacillus subtilis Từ “subtilis therapy” có nghĩa "thuốc subtilis" đời trị chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy rối loạn tiêu hoá Ngày nay, vi khuẩn trở nên phổ biến, sử dụng rộng rãi y học, chăn nuôi, thực phẩm [9] 2.1.2 Đặc điểm phân loại phân bố vi khuẩn Bacillus subtilis - Đặc điểm phân loại: Theo Vũ Thị Thứ, (1996) [19] Bacillus subtilis thuộc: Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Lồi: Bacillus subtilis Hình Vi khuẩn Bacillus subtilis http://www.isciencemag.co.uk/blog/tasty-humans/attachment/bacillus-subtilis/ n ... chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi? ?? 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả sinh protease làm sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học dùng chăn nuôi 1.3 Ý nghĩa... thường có hoạt tính cao có nhiều ưu hẳn [7] n Từ thực tế trên, tiến hành thực đề tài : ? ?Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus subtilis có khả sinh protease cao làm sở cho việc chế tạo chế phẩm sinh học. .. phân lập khảo sát đặc điểm sinh học tìm hiểu khả sinh enzyme vi khuẩn Bacillus subtilis để sản xuất thử nghiệm chế phẩm sinh học Năm 2009 Nguyễn Thị Trần Thụy nghiên cứu tuyển chọn vi khuẩn Bacillus