Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hoa sữa tại thành phố đồng hới trong dung môi n hexan và clorofom

LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp thành kiến thức kĩ mà em thu sau năm ngồi ghế giảng đường đại học Thành khơng thể riêng em làm được, nhờ cơng ơn dạy dỗ, kinh nghiệm quý báu mà thầy cô truyền đạt lại cho em năm học qua, quan tâm, ủng hộ gia đình bạn bè Để hồn thành khóa luận em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô giáo tận tình hướng dẫn, giảng dạy suốt trình học tập, nghiên cứu, rèn luyện Trường Đại học Quảng Bình, thầy giáo tổ mơn Hóa, Khoa Khoa học tự nhiên Đặc biệt em chân thành cảm ơn cô giáo hướng dẫn Thạc sĩ Lý Thị Thu Hồi tận tình hướng dẫn em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Mặc dù có nhiều cố gắng để thực đề tài cách hoàn chỉnh song điều kiện thực tế hạn chế mặt kiến thức kinh nghiệm nên thân em có sai sót mà thân khơng thấy được, mong đóng góp ý kiến q thầy bạn để khóa luận hồn chỉnh Em xin chân thành cảm ơn! Đồng Hới, tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Tuyết Trinh MỤC LỤC Trang DANH MỤC i MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Giả thuyết khoa học Nhiệm vụ nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu Bố cục khóa luận NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu hoa sữa i) Sơ lược nguồn gốc hoa sữa giới thực vật ii) Cây hoa sữa 1.2 Một số nghiên cứu thành phần hóa học hoa sữa 1.3 Hợp chất Ancaloit i) Khái niệm ii) Thành phần nguyên tố cấu tạo Ancaloit iii) Phân loại Ancaloit iv) Tính chất chung Ancaloit v) Sự tạo thành Ancaloit vi) Thuốc thử Ancaloit 1.4 Flavonoit 10 i) Đại cương flavonoit 10 ii) Hợp chất flavonoit có hoa sữa 12 1.5 Phương pháp tách số hợp chất hữu có hoa sữa 12 i) Phương pháp chưng cất lôi nước 12 ii) Phương pháp chiết 13 iii) Phương pháp sắc ký 17 iv) Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) 20 Chươ ng 2: NHỮNG NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 22 2.1 Nguyên liệu, dụng cụ, hóa chất 22 2.1.1 Nguyên liệu 22 2.1.2 Thu mẫu hoa phương pháp xử lý 22 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 22 2.2 Quy trình nghiên cứu 22 2.2.1 Tách, chiết tinh dầu 22 2.2.2 Tách, chiết dung môi hữu 24 2.2.3 Tách, chiết dung dịch axit 26 2.2.4 Pha thuốc thử 27 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Hàm lượng tinh dầu 28 3.2 Thành phần dịch chiết nước, chiết dung dịch axit 28 3.2.1 Dịch chiết nước 28 3.2.2 Dịch chiết dung dịch axit 29 3.3 Thành phần Ancaloit dịch chiết n-hexan 30 3.3.1 Hàm lượng 30 3.3.2 Trạng thái vật lý 31 3.3.3 Phản ứng với thuốc thử 31 3.4 Thành phần dịch chiết clorofom 32 3.4.1 Hàm lượng 32 3.4.2 Trạng thái vật lý 32 3.4.3 Phản ứng với thuốc thử 33 3.5 Kết khảo sát điều kiện chiết Ancaloit 34 3.5.1 Kết lựa chọn thuốc thử 34 3.5.2 Kết lựa chọn dung môi chiết 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 Kết luận 36 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1: Các loại pha động pha tĩnh thường sử dụng kỹ thuật sắc ký 18 Bảng 2: Tóm tắt cấu hình sắc ký khác 19 Bảng 3: Kết thử sản phẩm chiết với thuốc thử 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1: Cây hoa sữa thành phố Đồng Hới Hình 2: Hoa sữa Hình 3: Hệ thống chưng cất lơi nước 13 Hình 4: Hệ thống chưng cất lôi nước Hoa sữa phịng thí nghiệm 23 Hình 5: Chiết n-hexan 25 Hình 6: Thuốc thử nhận biết Ancaloit 27 Hình 7: Kết thử thuốc thử dịch nước chiết dung mơi hữu 28 Hình 8: Hòa tan cao etanol vào nước cất, thử thuốc thử 29 Hình 9: Cao etanol hòa tan dung dịch HCl 5% 30 Hình 10: Dịch chiết n-hexan 31 Hình 11: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Wagner 31 Hình 12: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer 32 Hình 13: Dịch chiết clorofom 33 Hình 14: Dịch chiết clorofom phản ứng với thuốc thử Mayer 33 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Hoa sữa phổ biến Việt Nam Cây thường trồng lấy bóng mát nhiều địa phương Từ xa xưa ông cha ta biết dùng vỏ hoa sữa làm thuốc chữa bệnh Các nghiên cứu gần chủ yếu nghiên cứu thành phần vỏ hoa sữa cho thấy vỏ chúng chứa Ancaloit có tác dụng dược lý Một phận khác hoa lại nghiên cứu đề cập đến Hoa sữa lồi hoa có mùi thơm nồng nên nghiên cứu xác định thành phần có hoa làm phong phú thêm nguồn hương liệu phục vụ công nghiệp sản xuất Mặt khác, ngồi vỏ có tác dụng dược lý hoa chứa thành phần tương tự, xác định thành phần làm phong phú thêm nguồn dược liệu phục vụ y học Ở địa bàn thành phố Đồng Hới nơi có nhiều hoa sữa, làm nguồn nguyên liệu phong phú phục vụ cho trình nghiên cứu ứng dụng Việc thực nghiên cứu xác định thành phần dịch chiết hoa sữa dung môi n-hexan clorofom hướng nghiên cứu tách chiết hợp chất thiên nhiên Vì vậy, tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học dịch chiết hoa sữa thành phố Đồng Hới dung mơi n-Hexan Clorofom” Mục đích nghiên cứu - Xác định thành phần hoá học hợp chất dịch chiết hoa sữa dung môi n-Hexan Clorofom - Xây dựng qui trình chiết tách Ancaloit hoa sữa Đối tượng phạm vi nghiên cứu - Cây hoa sữa, chọn cách ngẫu nhiên địa bàn thành phố Đồng Hới - Hoa hoa sữa lấy khoảng thời gian tháng 11/2014 - 01/2015 Giả thuyết khoa học - Hoa sữa thuộc họ trúc đào, có hàm lượng Ancaloit lớn tự nhiên Theo nghiên cứu trước cho thấy thành phần vỏ chứa Ancaloit, mà thực vật Ancaloit không tập trung phận mà phân bố nhiều phân khác Hoa hoa sữa chứa thành phần Ancaloit - Hoa sữa sử dụng nhiều y dược, có hợp chất có tác dụng dược lý - Đề tài xác định thành phần có dịch chiết hoa sữa để biết rõ hợp chất có dịch chiết n-Hexan Clorofom Nhiệm vụ nghiên cứu - Xây dựng hệ thống lý thuyết tách chiết hợp chất dung môi làm sở cho thực nghiệm - Tìm hiểu đối tượng cần nghiên cứu hoa sữa - Lập kế hoạch, quy trình nghiên cứu thành phần dịch chiết hoa sữa dung môi n-hexan clorofom - Tổ chức thực kiểm chứng lại giả thuyết nêu Các phương pháp nghiên cứu - Nghiên cứu lý thuyết - Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm: + Phương pháp chọn mẫu + Chiết dung môi n-hexan clorofom + Xác định thành phần hợp chất dịch chiết từ vỏ hoa sữa dung môi chiết phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC-MS Bố cục khóa luận Đề tài có cấu trúc gồm có phần: - Phần mở đầu - Phần nội dung + Chương 1: Tổng quan + Chương 2: Những nghiên cứu thực nghiệm + Chương 3: Kết nghiên cứu thảo luận - Phần kết luận kiến nghị NỘI DUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu hoa sữa 1.1.1 Sơ lược nguồn gốc hoa sữa giới thực vật Hoa sữa, hay gọi mò cua, mù cua (danh pháp khoa học Alstonia scholaris (L.) R.Br) loài thực vật nhiệt đới thuộc chi Hoa sữa, họ Trúc đào, Hoa vặn (Contortae) hay Long đởm (Gentianales) Họ Trúc đào - Apocynaceae, gỗ hay nhỏ, nhiều phận có nhựa mủ trắng Lá thường mọc đối mọc vịng, đơi mọc cách, khơng có kèm Hoa đơn độc tập hợp thành cụm hoa vô hạn hay cụm hoa xim Hoa trừ nhụy gồm nỗn (đơi 3-5) Hoa đều, tràng hợp hình ống, thường có phần phụ dạng vảy lông bên ống tràng, thùy tràng xếp vặn Số nhị số cánh hoa, dính vào ống tràng, bao phấn hình mũi tên, trung đới mang phần phụ lơng dài, hạt phấn rời Bầu trên, thường rời phân thùy, vòi đầu nhụy Đầu nhụy thường loe rộng, hình nón cụt bao phấn thường dính vào Trong nỗn bầu có từ đến nhiều nỗn đảo Quả thường gồm đại, có hạch Hạt có cánh hay chùm lông tơ, dễ phát tán Phôi nhỏ có nội nhủ [1] Trúc đào họ lớn, có tới gần 200 chi 2000 lồi, phân bố rộng rãi vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Ở nước ta tìm thấy khoảng 50 chi 170 lồi, thường mọc đồi rừng thưa, có số loài trồng Chất nhựa mủ họ Trúc đào thường có tính độc (như chi Nerium, Strophanthus), có vị đắng, y học dùng làm thuốc Ở số cây, chất nhựa mủ lại có tính đàn hồi cao su Trong cây, sợi libe vững chắc, dùng lấy sợi Một số quen thuộc họ Trúc đào như: - Dây huỳnh (Allamanda cathartica L.): Cây bụi leo mọc vòng một, hoa to, màu vàng Cây trồng làm cảnh - Trúc đào (Nerium odrorum L.): Cây nhỏ, mọc vòng một, màu lục thẩm, dai cứng Hoa thường có cánh kép, màu đỏ hồng hay trắng Lá có chất độc, chứa neriolin, dùng để chữa bệnh tim Cây trồng làm cảnh - Đại (Plumeria rubra L var acutifolia (Ait.) Woods.): Cây nhỡ, cành khỏe, lớn mọc cách, để lại vết sẹo sau rụng Hoa lớn, màu trắng, vàng, thơm Một vài phận dùng làm thuốc: vỏ thân vỏ rể có tác dụng tẩy mạnh, hoa dùng chữa ho, dã đắp chữa sai khớp, bong gân, mụn nhọt, nhựa dùng vỏ thân liều thấp hơn, dùng chữa chai chân vết loét Cây thường trồng đình chùa làm cảnh - Thơng thiên (Thevetia peruviana (Pers.) K.Schum.): Cây nhỡ, mọc cách màu lục bóng Hoa màu vàng, hình chng Quả màu lục Cây trồng làm cảnh Hạt chứa dầu số heterozit có chất thevetin dùng chế thuốc chữa bệnh tim Có nơi dùng hạt dã nát làm thuốc trừ sâu Tuy nhiên, việc dùng thuốc chế từ phải thận trọng độc Ở đồi rừng thưa ta hay gặp loài như: - Sừng trâu (Strophantus divaricatus (Lour.) Hook Et Arn.): Cây nhỏ, cao độ - 4m, xanh bóng, hoa màu vàng nhạt, khơ gồm đại dính gốc, nom sừng trâu Cây độc, hạt dùng chế thuốc chữa bệnh tim - Thừng mức hay lồng mức (Wrightia annamensis Dub et Eberh.): Cây gỗ nhỡ, hoa màu trắng hay vàng nhạt, mọc thành xim Gỗ trắng, thớ mịn nhẹ, dùng làm guốc khắc dấu Cây mọc nhiều rừng thưa tái sinh khỏe đồi hoang tỉnh miền Bắc, miền Trung [1] 1.1.2 Cây hoa sữa Hoa sữa hay mò cua (Alstonia scholaris (L.) R.Br.): Cây to cao khoảng 10 20m, vỏ nứt nẻ màu xám Cành mọc vòng Lá mọc vòng - cái, tập trung đầu cành; phiến dày, hình bầu dục Hình 1: Cây hoa sữa thành phố Đồng Hới Hoa nhỏ, màu trắng đục, mọc thành xim tán nách lá, mùi thơm hắc, đêm Quả gồm hai đại dài hẹp, chứa nhiều hạt Hạt có mào lơng hai đầu Hình 2: Hoa sữa Lồi cổ nhiệt đới, mọc hoang trồng khắp nước ta Cây ưa sáng, sinh trưởng nhanh thường mọc ven rừng nơi ẩm ven sơng, ven suối Tái sinh chồi mạnh Có thể trồng hay cành, hoa vào tháng 10 - 11 có tháng - hàng năm Gỗ làm gỗ dán đồ dùng thông thường Thường trồng làm cảnh, trồng ven đường phố quanh cơng trình cơng cộng để lấy bóng mát Vỏ thân chứa nhiều Ancaloit (0,16 - 0,27%), dùng nhiều làm thuốc Thường dùng làm thuốc bỗ chữa thiếu máu, kinh nguyệt không đều, sốt rét cấp mạn tính, đau bụng, ỉa chảy, kiết lỵ, viêm khớp có sưng nóng đỏ đau, bệnh da, lở ngứa Vỏ sắc đặc dùng ngậm chữa sâu Ở nước ta, vỏ hoa sữa dùng làm dược liệu chế rượu bổ Dikatina Ở Ấn Độ, vỏ dùng trị sốt rét dùng trị ỉa chảy, kiết lỵ, trị rắn cắn; dịch đáp vết loét Ở Thái Lan, vỏ dùng trị lỵ, trị cảm viêm phế quản Ở Trung Quốc, vỏ dùng trị ho gà, viêm khí quản mạn tính, suyễn khan, sốt rét, cảm mạo phát sốt, sưng amygdal, viêm gan cấp tính, phong thấp, đòn ngã, gãy xương, mụn nhọt sưng đỏ [5] 1.2 Một số nghiên cứu thành phần hóa học hoa sữa Hoa sữa loài phổ biến Ấn Độ, vùng Nam Á, Đơng Nam Á nhà khoa học ngồi nước có báo cáo, nghiên cứu Các nhà hóa học nghiên cứu hoa sữa chủ yếu nghiên cứu xác định thành phần hóa học phận Nhiều đề tài chủ yếu nghiên cứu thành phần vỏ cây, Một số nhà khoa học phân lập số chất có Những nghiên cứu thành phần hóa học cây, phận có chứa Ancaloit Hoa sữa biết đến thực vật giàu Ancaloit có giá trị điều trị bệnh Trong thành phần hóa học có lồi Ancaloit đóng vai trị quan trọng đến việc phát triển lồi thuốc mới, Ancaloit có loạt cấu trúc hóa học xác định định đến tính chất dược lý Hầu tất phận vỏ, rễ, lá, hoa, phát có chứa Ancaloit Từ phận hoa sữa, nhà khoa học nhiều nước khác giới phân lập chất Ancaloit sau: picirinine; scholaricine; echitamine; clorua echitamine; rhazine; nareline; dihydrocondylocarpine; 19,20-Zvallesamine; 19,20-E-vallesamine; alschmine isoalschomine; mataranine A B Ngoài thành phần hóa học hoa sữa cịn có số thành phần khác như: linalol; cis trans oxit linalol; α – tecpineol; tecpinen-4-ol tìm thấy hoa sữa Một số hợp chất như: iridois; coumarin; flavonid; leucoanthocyanis; đường khử; phenolics đơn giản, steroids, saponin tanin tìm thấy [6], [7] 1.3 Hợp chất Ancaloit 1.3.1 Khái niệm Ancaloit hợp chất hữu có chứa dị vịng nitơ, có tính bazơ, thường gặp nhiều lồi thực vật đơi cịn tìm thấy vài động vật Trên thực tế có nhiều loại thực vật có Ancaloit mức độ vết tỉ lệ phần vạn Để giới hạn với thực tiễn, xem có Ancaloit phải chứa 0,05% Ancaloit so với mẫu khơ Đặc biệt Ancaloit có tác dụng hoạt tính sinh lý cao thể người động vật, hệ thần kinh Với lượng nhỏ, có Ancaloit chất độc gây chết người, có lại thần dược trị bệnh đặc hiệu [2] 10 2.2.2 Tách, chiết dung môi hữu * Sơ đồ thực hiện: * Quy trình thực hiện: - Hoa sữa tươi phơi khô, tránh ánh nắng trực tiếp, tránh ẩm mốc, tạp chất làm ảnh hưởng đến chất có thành phần hoa sữa, tránh phản ứng hóa học làm biến đổi chất đó, làm sai lệch ảnh hưởng đến kết nghiên cứu - Mẫu hoa sau phơi khơ, đến độ ẩm cịn khoảng 10%, ngâm ngập etanol 95o Bình đậy kín - Lọc dịch etanol, loại bã Lắp hệ thống cô đuổi, thu hồi dung mơi, chưng đuổi dung mơi bình cầu thể tích 250ml Hệ thống tương tự chưng cất lơi nước hoa sữa tươi Nhiệt độ đặt đuổi dung mơi khoảng 60 - 70oC Đuổi dung mơi bình cầu đến thể tích cịn khoảng 1/3 bình, chuyển sang cốc thủy tinh, chưng cất thủy để đuổi hết dung môi Thu cao etanol; chứa Ancaloit nhiều chất hữu khác 28 - Chiết n-hexan: Pha cao etanol với nước cất bình tam giác; sau thêm n-hexan, lắc, để yên, chiết Sử dụng pipet để lấy dịch n-hexan phía Thao tác cẩn thận để không lẫn nước vào dịch chiết Chiết nhiều lần nhạt màu Lần đầu tiên, pha cao etanol với 150ml nước cất, thêm 50 ml n-hexan, lắc, để yên, chiết; dịch n-hexaxn phía trên, dịch nước phía dưới, chiết lấy n-hexan Sau lần chiết thứ nhất, thêm tiếp 50ml nước cất 50 ml n-hexan, lắc, chiết nhexan Sau lần chiết thứ 2, thêm 50ml n-hexan, chiết tiếp Thêm tiếp 25ml nhexan cho lần chiết thứ 4, 5, Các dịch chiết nhạt màu dần: dịch nước có màu vàng, dịch n-hexan dần, có màu xanh lục a) b) Hình 5: Chiết n-hexan: 5-a) Hỗn hợp chiết lần đầu; 5-b) Hỗn hợp chiết lần cuối - Dịch n-hexan sau chiết đuổi thu hồi dung mơi bình cầu, đun bếp với nhiệt độ 50 – 60oC Đuổi n-hexan đến thể tích cịn khoảng 1/3 V, sau chưng cách thủy để đuổi hết n-hexan, thu cao n-hexan - Dịch nước sau chiết n-hexan, lọc, chiết với clorofom Chiết nhiều lần dịch clorofom nhạt màu Lần chiết thứ nhất, thêm 25ml clorofom vào dịch nước, lắc chiết lấy clorofom phần dưới, thao tác cẩn thận, để nước không lẫn vào dịch clorofom chiết, dịch clorofom lần chiết có màu vàng Ở lần chiết thứ 2, thêm tiếp 25ml clorofom, lắc, để yên, chiết dịch clorofom Cũng tương tự cho lần chiết thứ 3, thêm 25ml CHCl3 Ở lần chiết cuối (lần thứ 3) dịch clorofom khơng màu.Dịch clorofom thu sau chiết, cô đuổi dung môi thu dịch clorofom đậm đặc - Thử dịch sau chiết với thuốc thử Mayer, Wagner 29 2.2.3 Tách chiết dung dịch axit * Sơ đồ thực hiện: * Quy trình thực hiện: - Chiết hoa sữa khơ với etanol, thu hồi dung môi cách chưng đuổi dung mơi cịn lại khoảng 1/3 V; sau chưng cách thủy thu cao etanol - Hòa tan vào dd axit HCl 5%, đun ấm cho tan tốt nhằm biến đổi tất Ancaloit dạng bazơ tự Ancaloit dạng muối, thành dạng nuối clorua, tan nước - Thêm nước cất vào dung dịch, khuấy Để yên qua đêm; loạc bỏ cặn Dung dịch chiết với clorofom nhằm loại bỏ hợp chất hữu khơng phải Ancaloit - Dịch nước cịn lại chứa muối Ancaloit, chiết clorofom loại bỏ gần hết hợp chất hữu Ancaloit - Trong trường hợp tiết kiệm dung môi hữu cơ, thực sau: cao tổng Ancaloit thô hòa vào nước, dùng dung dịch axit để chỉnh pH = Khuấy lọc Dùng dung dịch kiềm chỉnh pH = 10, để yên qua đêm có tủa Lọc lấy tủa Hịa tủa vào nước, chỉnh pH = 3, lại cho kết tủa dung dịch kiềm Thực vài lần thu Ancaloit thô Kết tinh lại Ancaloit dung môi - Thử dịch nước hòa tan cao tổng etanol, dịch axit chứa muối Ancaloit, dịch axit chứa muối Ancaloit dùng Na2CO3 chỉnh pH = 10 với thuốc thử Mayer, Wagner Quan sát tốc độ phản ứng màu sắc dịch với thuốc thử 30 2.2.4 Pha thuốc thử a Thuốc thử Mayer Hòa tan 1,36 g HgCl2 60 ml nước cất hòa tan g KI 10 ml nước cất Hỗn hợp hai dung dịch thêm nước cho đủ 100ml Nhỏ vài giọt thuốc thử vào dịch chiết quan sát tượng b Thuốc thử Wagner Hòa tan 1,27 g iod I2 g KI 20 ml nước cất Thêm nước cho đủ 100 ml Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dịch chiết quan sát tượng a) Thuốc thử Mayer b) Thuốc thử Wagner Hình 6: Thuốc thử nhận biết Ancaloit 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN A 3.1 Hàm lượng tinh dầu Các nghiên cứu trước cho thấy hoa sữa có số hợp chất monoterpen: linalool; cis trans oxit linalool; α - tecpineol; tecpinen-4-ol Tinh dầu hợp chất khơng tan nước, có mùi thơm, nhiệt độ sơi khoảng 40 -60oC; phương pháp chưng cất lôi nước khoảng thời gian từ 40 - 60 phút thu tinh dầu Tuy nhiên, điệu kiện phịng thí nghiệm chưa có chứng cất lôi nước, dụng cụ tự lắp đặt (hình 4) thực với mẫu nhỏ, hàm lượng tinh dầu hóa sữa nhỏ, nên thu lượng tinh dầu chưa tiến hành đo GC/MS để xác định thành phần hóa học 3.2 Thành phần dịch chiết nước dịch chiết dung dịch axit 3.2.1 Dịch chiết nước Dịch nước thu sau chiết dung mơi hữu cơ: n-hexan, clorofom có màu vàng, trong, nhạt màu dịch clorofom, khơng có kết tủa dịch nước Thử dịch nước với thuốc thử Mayer, Wagner cho kết sau: - Thuốc thử Mayer: Khi nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào ống nghiệm đựng 3ml dịch nước chiết dung môi hữu có kết dương tính với thuốc thử Trong ống nghiệm xuất kết tủa màu vàng, kết tủa xuất nhanh, nhiều, dung dịch có màu vàng đục - Thuốc thử Wagner: Nhỏ vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm đựng dịch nước cho kết dương tính Trong ống nhiệm xuất kết tủa màu nâu, kết tủa xuất nhanh, dịch nước có màu nâu đỏ Hình 7: Kết thử thuốc thử dịch nước chiết dung môi hữu cơ: a) Mayer; b) Wagner 32 Khi hòa tan 1gam cao etanol vào 100ml nước cất, để yên qua đêm lọc, thu dịch nước có màu vàng tươi, Cũng nhận biết dịch nước thuốc thử Wagner Mayer Nhỏ vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm đựng 3ml dịch nước Kết cho thấy với thuốc thử Mayer dung dịch chuyển sang màu trắng đục, khơng thấy có kết tủa Cịn với thuốc thử Wagner dung dịch có màu nâu đỏ, khơng có kết tủa xuất Kết cho thấy, có hàm lượng nhỏ Ankaloit tan vào nước, khó nhận thuốc thử a) b) c) Hình 8: Hịa tan cao etanol vào nước cất, phản ứng với thuốc thử a)Dịch nước hòa tan cao etanol, lọc; b) Thuốc thử Mayer; c) Thuốc thử Wagner 3.4.2 Dịch chiết dung dịch axit Cho vào hai bình tam giác, bình 1gam cao etanol, sau hịa tan cao 100ml dung dịch HCl 5% Ngâm qua đêm, lọc Bình thứ nhất, chiết clorofom Bình thứ hai, thêm dung dịch Na2CO3 lỗng Thử thuốc thử với dung dịch hai bình: Bình gồm dịch nước dịch clorofom; bình Hịa tan cao etanol dung dịch axit chuyển Ankaloit có mẫu dạng bazơ tự sang dạng muối clorua tan nước Cao etanol tan nhanh dung dịch axit 33 Hình 9: Cao etanol hịa tan dung dịch HCl 5% Ở bình 1: Chiết với clorofom dịch clorofom thu khơng màu Phản ứng với thuốc thử dịch axit cho kết dương tính Thuốc thử Mayer cho kết tủa vàng, rõ, thời gian xuất kết tủa nhanh Thuốc thử Wagner, dung dịch thu có màu nâu xuất nhanh, lượng kết tủa nhiều Ở bình 2: Thêm dung dịch Na2CO3 vào dung dịch chứa muối Ankaloit bazơ mạnh đẩy bazơ yếu khỏi muối, đưa Ankaloit lại dạng bazơ tự Cho dung dịch phản ứng với thuốc thử thuốc thử Mayer cho kết dung dịch màu vàng đục, nhạt so với dung dịch bình 1; thuốc thử Wagner cho dung dịch màu nâu đỏ đục, nhạt bình 1, hai khơng thấy kết tủa xuất 3.3 Thành phần Ancaloit dịch chiết n-hexan 3.3.1 Hàm lượng Etanol dung mơi phân cực, hịa tan hợp chất có tính phân cực không phân cực hợp chất hữu có hoa sữa Một số chất tan nước tan tốt ancol metanol hay etanol Mục đích việc sử dụng etanol hịa tan gần tồn chất hữu có mẫu hoa sữa khơ, mặt khác etanol độc metanol Chiết với cao etanol, mẫu hoa sữa tươi có khối lượng 700g, sau phơi khơ có khối lượng 80g (chiếm 11,43% khối lượng mẫu tươi) Sau ngâm, chiết với etanol, cô đuổi, thu hồi dung mơi thu cao etanol có khối lượng 14,74g (chiếm 18,425% khối lượng mẫu khô; 2,11% khối lượng mẫu tươi) Khi ngâm, chiết với etanol hợp chất khơng phân cực phân cực ít, đa số hợp chất hữu có hoa sữa tan 34 dung môi etanol Cao tổng chứa thành phần toàn hợp chất hữu có Ankaloit, flavonoid, Chiết với dung mơi n-hexan, hịa tan cao với nước cất cao khơng tan hết, dịch nước có màu vàng, thêm n-hexan phần lớn cao di chuyển lên phần dịch n-hexan n-hexan dung mơi khơng phân cực, hịa tan tốt hợp chất hữu không phân cực Sau chiết n-hexan, cô đuổi, thu hồi dung môi nhiệt độ khoảng 60oC thu cao n-hexan 3.3.2 Trạng thái vật lý Cao n-hexan có màu xanh thẫm Hịa tan vào lại n-hexan thu dịch chiết, khơng thấy có kết tủa Hình 10: Dịch chiết n-hexan 3.3.3 Phản ứng với thuốc thử Thử dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer Wagner: Cho vào ống nghiệm 2ml dịch chiết n-hexan, sau nhỏ vài giọt thuốc thử - Thuốc thử Wagner: Dịch chiết n-hexan có kết dương tính với thuốc thử Wagner Thời gian để xuất kết tủa khoảng 15 phút sau nhỏ thuốc thử vào dịch chiết.Kết tủa dung dịch nhiều, bám dính đáy ống nghiệm, có màu nâu sẫm Hình 11: Dịch n-hexan phản ứng với thuốc thử Wagner - Thuốc thử Mayer: Dịch chiết n-hexan cho kết dương tính với thuốc thử Wagner Chất lỏng ống nghiệm tách lớp, lớp không màu, lớp 35 xanh đen.Trong dịch màu xanh đen có xuất kết tủa với lượng nhỏ Hình 12: Dịch chiết n-hexan với thuốc thử Mayer Trong dịch chiết n-hexan có chứa thành phần Ankaloit, với hàm lượng nhỏ, nhận biết nhờ sử dụng thuốc thử Mayer, Wagner 3.4 Thành phần dịch chiết clorofom 3.4.1 Hàm lượng a Chiết dung môi hữu cơ: Sau chiết với n-hexan, dịch nước thu chiết với CHCl3, trình chiết xảy nhanh sau lần chiết thu dịch clorofom không màu Dịch clorofom thu sau chiết, thực cô đuổi, thu hồi dung môi nhiệt độ khoảng 50 - 60oC Từ 75ml dịch clorofom thu 5ml dịch clorofom đậm đặc b Chiết dung dịch axit: Khi hòa tan cao etanol vào dung dịch HCl 5%, ngâm qua đêm, lọc bỏ bã, chiết clorofom dịch CHCl3 thu khơng màu 3.4.2 Trạng thái vật lý a Chiết dung môi hữu cơ: Dịch chiết clorofom có màu vàng, dịch chiết clorofom đậm đặc có màu vàng nâu Khơng có tủa xuất dịch chiết clorofom 36 Hình 13: Dịch chiết clorofom b Chiết dung dịch axit: Dịch chiết clorofom không màu, khơng có kết tủa dịch Mặc dù khơng có màu clorofom hịa tan hợp chất hữu mà tan tốt CHCl3 axit 3.4.3 Phản ứng với thuốc thử a Chiết dung môi hữu Khi thử thuốc thử Mayer Wagner với dịch chiết clorofom phản ứng cho kết khác Ở thuốc thử Wagner, có kết tủa nâu xuất sau thời gian khoảng 30 phút, dung dịch tách lớp khơng rõ ràng, thuốc thử Wagner I2/KI, I2 bị hòa tan dung môi phân cực clorofom nên tách lớp xảy khơng rõ ràng Hình 14: Dịch chiết clorofom phản ứng với thuốc thử Mayer Thuốc thử Mayer xảy tách lớp rõ ràng, khơng có kết tủa xuất hiện.Lớp màu vàng đậm dịch chiết clorofom, lớp thuốc thử Mayer Lớp chứa dịch chiết clorofom sẫm màu so với chưa thử thuốc thử Trong dịch chiết clorofom có chứa Ankaloit, khơng có b Chiết dung dịch axit Hòa tan cao etanol vào dung dịch HCl 5%, ngâm qua đêm chiết với clorofom, thu dịch clorofom Phản ứng thuốc thử với dịch clorofom cho kết âm tính, dịch clorofom khơng màu phản ứng với thuốc thử Mayer dung dịch ống nghiệm tách lớp rõ rệt, hai lớp dung dịch khơng màu 37 khơng có kết tủa xuất hiện; với thuốc thử Wagner dung dịch có màu nâu đỏ, khơng có tách lớp rõ ràng Ngun nhân tách lớp phản ứng với thuốc thử dịch clorofom thuốc thử Mayer dung dịch hai muối KI, HgCl2, chất phân cực, không tan dung môi phân cực CHCl3; thuốc thử Wagner hỗn hợp I2/KI, I2 vừa tan KI lại vừa tan CHCl3 nên xảy tách lớp không rõ ràng 3.5 Kết khảo sát điều kiện chiết Ancaloit 3.5.1 Kết lựa chọn thuốc thử Kết thử sản phẩm chiết với thuốc thử tổng hợp bảng sau: Bảng 3: Kết thử sản phẩm chiết với thuốc thử Phương pháp chiết Dịch chiết n-hexan Dung môi hữu Clorofom Dịch nước Dịch nước Dung dịch HCl 5% Dịch axit Clorofom Dd axit + Na2CO3 Thuốc thử Hiện tượng Mayer Kết tủa màu nâu sẫm Wagner Kết tủa màu nâu đen Mayer Khơng có kết tủa Wagner Kết tủa nâu (sau thời gian) Mayer Kết tủa vàng rõ rệt Wagner Kết tủa nâu rõ rệt Mayer Dung dịch trắng đục, kết tủa Wagner Dung dịch nâu đỏ, khơng có kết tủa Mayer Kết tủa vàng, rõ rệt Wagner Kết tủa nâu, Mayer Khơng có kết tủa Wagner Khơng có kết tủa Mayer Dung dịch vàng đục, khơng có kết tủa Wagner Dung dịch nâu đỏ, khơng có kết tủa 3.5.2 Kết lựa chọn dung môi chiết 38 Kết cho thấy chiết dung môi hữu cơ, n-hexan chiết tốt hợp chất không phân cực, số Ancaloit dạng bazơ tự không tan nước mà tan dung môi n-hexan, nên phản ứng với thuốc thử cho kết dương tính, hàm lượng Ancaloit mẫu thường tồn dạng muối, chiết dung mơi hữu n-hexan hay clorofom muối khó tan dung môi hữu cơ, nên dịch nước thu sau chiết dung mơi hữu có chứa hàm lượng lớn muối ancaloit, kết phản ứng với thuốc thử thấy rõ ràng Khi chiết dung dịch axit, Ancaloit dạng bazơ tự chuyển sang dạng muối, muối tan tốt nước, không tan dung môi phân cực clorofom, nên cô cạn, đuổi nước thu Ankaloit dạng muối Vì phản ứng với thuốc thử xảy nhanh Trong điều kiện pH khác khả chiết Ancaloit khỏi dung dịch khác Thực nghiệm cho thấy, pH = 3, Ancaloit tồn dạng muối, phản ứng nhanh với thuốc thử; pH = 10, Ancaloit tồn dạng bazơ tự số Ancaloit có tính bazơ mạnh khơng bị đẩy khỏi muối, phản ứng chậm với thuốc thử Qua hai phương pháp chiết dung dịch axit dung mơi hữu kết cho thấy, Ancaloit tồn chủ yếu dạng muối, tan tốt nước Khi chiết hai phương pháp kết thu gần tương đương Tuy nhiên, để đảm bảo, an tồn tiết kiệm dung mơi nên thực phương pháp chiết dung dịch axit, thu muối, sau phân lập hợp chất 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua trình nghiên cứu thực nghiệm, rút số kết luận sau: - Nghiên cứu tổng quan đối tượng nghiên cứu hoa sữa Nghiên cứu tổng quan lý thuyết tách chiết sỗ hợp chất thiên nhiên như: Ancaloit, Flavonoit - Nghiên cứu phương pháp tách chiết số hợp chất có hoa sữa Phương pháp xử lý mẫu, tách chiết tinh dầu hoa sữa tươi Phương pháp tách chiết dung môi hữu cơ, dung dịch axit - Định tính Ankaloit có thành phần dịch chiết Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu theo hướng sâu hơn: chạy sắc kí cột để tách cấu tử tinh khiết từ hoa sữa, đo GC-MS, LC-MS, cộng hưởng từ để xác định cấu trúc hợp chất Làm giàu cấu tử chính, thử hoạt tính sinh học nghiên cứu phản ứng chuyển hóa chúng - Có thể nghiên cứu mở rộng xác định thành phần chất có lá, rễ hoa sữa so sánh với thành phần chất có hoa sữa Từ đó, lựa chọn nguồn nguyên liệu tối ưu để tiếp tục nghiên cứu hoạt tính sinh học phục vụ cho y học 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Võ Văn Chi (2003); Từ điển thực vật thông dụng, Tập 1; NXB Khoa học kỹ thuật [2] Lê Văn Đăng (2005); Chuyên đề Một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [3] Nguyễn Thị Thanh Huyền (2011); Nghiên cứu, xác định thành phần hóa học vỏ hoa sữa; Luận văn thạc sĩ Hóa học, Trường Đại học Đà Nẵng [4] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007); Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ; NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh [5] Hoàng Thị Sản (2006); Phân loại học thực vật; NXB Đại học Sư phạm [6] Abhijit Dey (2011); Alstonia scholaris R.Br (Apocynaceae): Phytochemistry and pharmacology: A concise review; Journal of Applied Pharmaceutical Science [7] Bhanu Pratap, G.S.Chakraborthy, Nandini Mogha (2013); Complete Aspects Of Alstonia Scholaris; International Journal of PharmTech Research [8] Wikipedia ting Vit; http://vi.wikipedia.org/wiki/Ancaloit 41 hướng dẫn đọc toàn văn báo cáo KQNC ! ! Bạn muốn đọc nhanh thông tin cần thiết ? Hy đọc qua Mục lục bên tay trái bạn trước đọc báo cáo ( với Acrobat 4.0 trở lên, cho trỏ chuột vào đề mục để đọc toàn dòng bị che khuất ) ! Chọn đề mục muốn đọc nháy chuột vào ! ! Bạn muốn phóng to hay thu nhỏ trang báo cáo hình ? Chọn, nháy chuột vào kích th thưước có sẵn Menu , ! Mở View Menu, Chän Zoom to ! Chän tû lÖ cã sẵn hộp kích th thưước muốn,, Nhấn OK tự điền tỷ lệ theo ý muốn Chúc bạn hài lòng với thông tin đđưược cung cấp ... ? ?Nghi? ?n cứu thành ph? ?n hóa học dịch chiết hoa sữa thành phố Đồng Hới dung môi n- Hexan Clorofom? ?? Mục đích nghi? ?n cứu - Xác định thành ph? ?n hố học hợp chất dịch chiết hoa sữa dung mơi n- Hexan Clorofom. .. trình nghi? ?n cứu ứng dụng Việc thực nghi? ?n cứu xác định thành ph? ?n dịch chiết hoa sữa dung môi n- hexan clorofom hướng nghi? ?n cứu tách chiết hợp chất thi? ?n nhi? ?n Vì vậy, tơi ch? ?n đề tài: ? ?Nghi? ?n. .. bi? ?n ? ?n Độ, vùng Nam Á, Đơng Nam Á nhà khoa học ngồi n? ?ớc có báo cáo, nghi? ?n cứu Các nhà hóa học nghi? ?n cứu hoa sữa chủ yếu nghi? ?n cứu xác định thành ph? ?n hóa học ph? ?n Nhiều đề tài chủ yếu nghiên