Khóa luận tốt nghiệp SVTH Lê Ngọc Mỹ 1 LỜI MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Cây hoa Huệ Hương (Polianthes tuberose L ) là cây hoa cắt cành thuộc nhóm thân thảo, thích cường độ ánh sáng cao và cho hoa quanh năm Hoa[.]
Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây hoa Huệ Hương (Polianthes tuberose L.) hoa cắt cành thuộc nhóm thân thảo, thích cường độ ánh sáng cao cho hoa quanh năm Hoa Huệ Hương nhập vào nước ta từ lâu Cây hoa Huệ Hương trồng phổ biến vùng Nam Trung Bộ đem lại thu nhập cao cho người trồng xóa đói giảm nghèo cho vùng chun canh lồi Hiện nay, việc canh tác hoa Huệ thường chủ yếu nhân giống kỹ thuật nhân giống truyền thống, chủ yếu lấy củ trồng Với phương pháp nhân giống dễ lây lan mầm bệnh có sẵn củ, đặc biệt bệnh virus làm giảm suất phẩm chất hoa, khiến cho giống hoa ngày thối hóa Trong năm gần đây, bệnh hại hoa Huệ Hương xuất nhiều, đặc biệt có bệnh khó trị bệnh chai Tác nhân gây bệnh chưa xác định Bệnh xuất diện rộng làm ảnh hưởng đến suất phẩm chất hoa Bệnh không làm cho chết làm cho chồi, củ, hoa phát triển, làm thất thu nguồn thu nhập nông dân Các triệu chứng bệnh virus mô tả Horner Person (1988), Chen Chang (1998) gần giống biểu hoa Huệ Hương Nam Trung Bộ Vấn đề đặt làm để tạo nguồn giống bệnh cung cấp cho nhân dân? Phương pháp nhân giống in vitro với nhiều ưu điểm, tạo trẻ hóa bệnh nên tiềm sinh trưởng, phát triển suất cao, khắc phục nhược điểm phương pháp nhân giống truyền thống, khôi phục lại phẩm chất vốn có giống Đồng thời hệ số nhân phương pháp nhân giống cao đáp ứng nhu cầu số lượng giống có chất lượng cao, ổn định đáp ứng nhu cầu sản xuất quy mô rộng Cho đến kĩ thuật nuôi cấy mô nghiên cứu ứng dụng có hiệu việc nhân giống hàng loạt loại -1- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ trồng tạo ngân hàng giống bệnh, khỏe mạnh cho suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất Mục đích nghiên cứu Xác định ảnh hưởng chất hòa sinh trưởng thực vật lên trình phát sinh hình thái quy trình nhân giống hoa Huệ Hương kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào, làm sở cho việc hình thành quy trình nhân giống in vitro hoa Huệ Hương, góp phần giải khó khăn thực tiễn sản xuất hoa Đối tượng phạm vi nghiên cứu Cây hoa Huệ Hương đối tượng sản xuất giống phương pháp nuôi cấy mô nước ta Xuất phát từ yêu cầu khó khăn thực tiễn, nhằm khắc phục tượng chai hoa Huệ Hương, giống hoa Huệ quý mang lại hiệu cao cho nơng dân Trên sở đó, việc nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống in vitro hoa Huệ tiến hành thử nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Đề tài đưa minh chứng tác động phương pháp khử trùng đến tỷ lệ sống mẫu cây, tác động chất điều tiết sinh trưởng đến khả phát sinh hình thái Kết nghiên cứu đề tài sử dụng nghiên cứu ni cấy mơ tế bào hoa Góp phần sản xuất giống có hiệu cao, chất lượng tốt, ứng dụng vào sản xuất góp phần nâng cao hiệu kinh tế ngành sản xuất hoa Huệ Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến trình phát sinh hình thái mầm ngủ củ hoa Huệ Hương Sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật như: kinetin, BA, IBA, α-NAA, 2,4-D, IAA -2- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào Là phương pháp nuôi cấy mô tế bào môi trường dinh dưỡng nhân tạo điều kiện vô trùng tái sinh chúng thành Nhân giống kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào phương pháp bổ sung cho kỹ thuật nhân giống truyền thống nhiều kỹ thuật tiến bộ, khắc phục hạn chế phương pháp nhân giống truyền thống 1.2 Lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Năm 1838, sở nghiên cứu độc lập, hai nhà bác học người Đức Schleiden Schwamn khởi xướng học thuyết tế bào Học thuyết cho tế bào đơn vị cấu trúc chức sinh vật, có khả tồn độc lập Gottlibe Haberlandt người đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật vào năm 1902 để chứng minh học thuyết tính tồn tế bào Theo ơng tế bào thể mang toàn hệ thống di truyền cần thiết đầy đủ thông tin sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành thể hồn chỉnh Ơng tiến hành thí nghiệm với tế bào khí khổng tế bào biệt hóa chức khác khơng thành cơng Điều giảm tin tưởng nhà khoa học phương pháp nuôi cấy mô tế bào thời gian dài Đến năm 1922 học trò Gottlibe Haberlandt Kotte Robbinss làm lại thí nghiệm ơng Họ lấy đỉnh sinh trưởng rễ hịa thảo ni cấy mơi trường có khống, đường, đầu rễ sinh trưởng mạnh tạo hệ rễ nhỏ rễ phụ Tuy nhiên sinh trưởng tồn thời gian chuyển sang môi trường Năm 1934, bắt đầu giai đoạn thứ lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật White nuôi cấy thành công rễ cà chua môi trường lỏng có chứa đường, muối khống, dịch chiết nấm men Các thí nghiệm ơng thay -3- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ dịch chiết nấm men hỗn hợp vitamin nhóm B : thiamin (B1), nicotinic acid (B3), pyridioxin (B6) Sau lâu Went Thimann tìm chất kích thích sinh trưởng IAA Năm năm sau Gautheret thông báo tái sinh cà rốt, lần phát triển mô sẹo không bị giới hạn Bằng cách thêm IAA vào mơi trường ni cấy, ơng kích thích phát triển mơ biệt hóa vết cắt bề mặt mẫu cấy vô trùng Sau người ta thấy callus trực tiếp nuôi cấy vô thời hạn Đến năm 1948, Steward xác nhận tác dụng nước dừa mô sẹo cà rốt Trong thời gian nhiều chất sinh trưởng thuộc nhóm auxin tổng hợp naphthylacetiic acid (NAA), 2,4-Diclophenoxyacetic acid (2,4D) Nhiều tác giả nhận thấy với nước dừa, NAA 2,4 D giúp tạo mô sẹo gây phân chia tế bào thành công nhiều đối tượng thực vật trước khó ni cấy Năm 1955, Miller Skoog xác định vai trò chất kích thích sinh trưởng 6-Furfuryl aminopurin (kinetin) Việc phát chất kích thích sinh trưởng, vitamin nước dừa bước tiến quan trọng giai đoạn thứ Năm 1957, Miller Skoog công bố kết nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ auxin/kinetin môi trường nuôi cấy hình thành quan, tỷ lệ auxin/kinetin thấp, mơ sẹo có khuynh hướng tạo chồi, ngược lại tỷ lệ auxin/kinetin tăng, mơ sẹo có khuynh hướng tạo rễ Hiện nay, kết quan sát thấy nhiều loại khác đóng góp nhiều vào việc điều khiển trình sinh trưởng, phát triển phát sinh quan mô tế bào nuôi cấy Thành công Miller Skoog mở đầu cho giai đoạn thứ ba lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật Những thành công sở bùng nổ ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế báo thực vật sản xuất Morel Martin phát triển kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo giống bệnh khoai lang hoa lan Chính hai nhà khoa học mở đầu cho hướng nuôi cấy mô tế bào thực vật, vi nhân giống -4- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ Từ năm 1960, ngồi hướng trên, ni cấy bao phấn hạt phấn, nuôi cấy tế bào đơn tế bào trần phát triển mạnh Các kỷ thuật lai soma dung hợp tế bào trần kỷ thuật chuyển gen phát triển thu thành tựu đáng kể Chúng ta bước vào giai đoạn thứ ni cấy mơ tế bào thực vật Đó giai đoạn nuôi cấy mô tế bào ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, sản xuất chất thứ cấp có hoạt tính sinh học vao nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao 1.3 Cơ sở lý luận nuôi cấy mô tế bào thực vật Cơ sở lý luận phương pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro học thuyết tính tồn (totipotence) tế bào Theo Haberlandt G (1902), nhà thực vật người Đức, tất tế bào mang toàn lượng thông tin di truyền thể, gặp điều kiện thích hợp, tế bào có khả tái sinh phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Thực tế chứng minh khả tái sinh thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng rẽ Hàng trăm loài trồng nhân giống qui mô thương mại cách nuôi cấy môi trường nhân tạo vô trùng tái sinh chúng thành với hệ số nhân giống vô lớn (Murashige, 1980) Quá trình phát sinh hình thái nuôi cấy in vitro thực vật thực chất kết q trình phân hóa phản phân hóa Tất tế bào quan khác thể thực vật bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự chuyển tế bào phơi sinh thành tế bào chun hóa để đảm nhiệm chức khác gọi phân hóa tế bào Cịn q trình phản phân hóa ngược lại với q trình phân hóa, có nghĩa tế bào phân hóa thành mơ chức khơng hồn tồn khả phân chia mà điều kiện thích hợp chúng trở dạng phôi sinh tái phân chia Bản chất q trình q trình hoạt hóa, ức chế gen Trong trình phát triển cá thể, thời điểm định có số gen định hoạt hóa cho ta tính trạng mới, số gen khác lại bị đình hoạt động Điều -5- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ xảy theo chương trình mã hóa cấu trúc phân tử DNA tế bào khiến trình sinh trưởng phát triển thể thực vật ln hài hịa Mặt khác, nằm khối mơ bình thường, tế bào ln bị chi phối tế bào xung quanh Khi tế bào tách riêng rẽ, tác dụng ức chế tế bào xung quanh khơng cịn gen hoạt hóa q trình phân hóa xảy theo trình định sẵn 1.4 Ưu, nhược điểm phương pháp nhân giống in vitro Phương pháp nhân giống in vitro có khả khắc phục nhiều trở ngại mà phương pháp nhân giống khác thường gặp Sau ưu điểm : - Cây trẻ hóa bệnh, có tiềm sinh trưởng, phát triển suất cao - Tạo đồng mặt di truyền, bảo tồn tính trạng chọn lọc - Tạo dòng tạp giao - Tạo có genotip (đa bội, đơn bội) - Bảo quản lưu giữ tập đồn gen - Có khả sản xuất quanh năm - Có thể nhân nhanh nhiều khơng kết hạt điều kiện sinh thái định hạt nảy mầm - Hệ số nhân giống cao (thường đạt lồi khác phạm vi từ 36 - 1012/năm), rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất đại trà Trong công tác giống trồng, vấn đề quan tâm hàng đầu chất lượng số lượng giống Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta tạo giống hoàn toàn virus Limasset Cornel (1945) chứng minh rằng, nồng độ virus thực vật giảm dần phận gần đỉnh sinh trưởng, riêng đỉnh sinh trưởng hồn tồn virus (Morel Martin, 1952) Ngun nhân tượng là: -6- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ - Đỉnh sinh trưởng hệ mơ dẫn, làm cho virus vi sinh vật khơng có khả thâm nhập - Đỉnh sinh trưởng nơi sinh tổng hợp auxin nên hàm lượng auxin cao, auxin có tác dụng ức chế sinh sản virus - Quá trình phân chia tế bào phôi sinh (ở đỉnh sinh trưởng) không kéo theo phân chia virus Về phương diện hệ số nhân, nhân giống in vitro phương pháp không so sánh kịp, kể phương pháp nhân giống hạt Ni cấy in vitro coi cách mạng hệ số nhân Nhược điểm phương pháp ni cấy in vitro đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền kỹ thuật cao nên có hiệu có giá trị cao khó nhân giống phương pháp khác (Nickell, 1973) Ngoài ra, phương pháp cịn có bất lợi sau: - Mặc dù số lượng giống thu cao có kích thước nhỏ, địi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt giai đoạn sau ống nghiệm - Cây có đặc tính không mong muốn - Khả tạo đột biến tăng - Khả tái sinh bị cấy truyền callus hay huyền phù tế bào nhiều lần - Cây giống bị nhiễm bệnh đồng loạt Tuy phương pháp nhân giống in vitro ngày sử dụng rộng rãi để phục vụ cho mục đích sau: - Nhân nhanh trì cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống loại trồng khác lương thực có củ, rau, hoa, cảnh dược liệu thuộc nhóm than thảo - Nhân nhanh kinh tế kiểu gen quí giống lâm nghiệp gốc ghép nghề trồng ăn quả, cảnh thuộc nhóm than gỗ - Nhân nhanh điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với làm virus -7- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ - Bảo quản lưu giữ tập đồn giống nhân giống vơ tính lồi giao phấn ngân hàng gen 1.5 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro Kỹ thuật nuôi cấy in vitro chia thành bước sau: - Lựa chọn đối tượng (cây trồng, giống, phận cây) thích hợp Ngun liệu sử dụng cho ni cấy mơ tế bào thực vật phận cây: đoạn rễ, thân, phần (cuống lá, phiến lá…), cấu trúc phôi mầm, trụ trên, trụ mầm, hạt phấn, nỗn… chí mẫu thân ngầm hay quan dự trữ mặt đất (củ, hành…) dùng cho nuôi cấy - Khử trùng mẫu tiến hành nuôi cấy Nguyên liệu để nuôi cấy in vitro chọn từ cá thể ưu tú lồi, khỏe bệnh, nhiều có nhiễm vi sinh vật nấm tùy thuộc vào tiếp xúc chúng với môi trường xung quanh Có số phận phơi hạt, mơ quả, dịng lúa non… bị nhiễm vi sinh vật phận khác, ngược lại phận nằm mặt đất rễ, củ, thân ngầm, có lượng vi khuẩn nấm cao Phương pháp thông dụng để loại bỏ hệ vi sinh vật khỏi vật liệu nuôi cấy sử dụng hóa chất có hoạt tính diệt khuẩn nấm Khả tiêu diệt nấm vi sinh vật hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ, thời gian xử lý mức độ xâm nhập chúng vào ngõ ngách bề mặt mô cấy Để làm tăng hiệu quả, người ta thường nhúng mẫu vào ethanol 70 80% 30 giây, sau xử lý dung dịch diệt khuẩn Đối với mẫu có bề mặt bao phủ lớp sáp, muốn đạt kết tốt cần cho them vào dung dịch khử trùng vài giọt Tween 20, Tween 80 hay teapol…vì chất làm tăng tính bám dính hóa chất khử trùng Với mẫu bẩn phải rửa kỹ nước xà phòng để vòi nước chảy từ 20 đến 30 phút có tác dụng làm giảm đáng kể hệ vi khuẩn khỏi mẫu cấy Tác nhân khử trùng, tác dụng diệt vi sinh vật cịn ảnh hưởng đến mơ cấy việc lực chọn loại hóa chất phải vào mức độ nhiễm khuẩn độ -8- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ mẫn cảm mẫu Trong số hóa chất hay sử dụng để khử trùng Calcium hypoclorite natri hypoclorite hay sử dụng có tính độc thấp mơ xử lý, khơng gây ức chế sinh trưởng hiệu diệt khuẩn tốt Nồng độ Calcium hypoclorit natri hypoclorit tương ứng thường 15% 0,5 - 2% thời gian 15 - 30 phút Tuy nhiên, chất không bền nên thực tế HgCl2 hay dùng để thay - Xác định điều kiện nuôi cấy (môi trường dinh dưỡng, nhiệt độ, ánh sáng) để điều khiển q trình phát triển ni cấy theo định hướng Thành công phương pháp nuôi cấy in vitro phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi cấy Nhu cầu dinh dưỡng cho sinh trưởng phát triển tối ưu lồi khơng giống nhau, phận thể nhiều khác Sự lựa chọn mơi trường nuôi cấy bao gồm chất lượng số lượng hóa chất sử dụng đóng vai trị định thân phân hóa chiều hướng phân hóa tế bào Cho đến nay, có nhiều loại mơi trường dinh dưỡng tìm : môi trường Murashige Skoog (1962), môi trường Linsmaer Skoog (1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974)… Đây môi trường cải tiến thành nhiều loại môi trường khác phù hợp với đối tượng nghiên cứu mục đích thí nghiệm Trong số đó, mơi trường MS (Murashige Skoog, 1962) đánh giá phù hợp cho đa số lồi thực vật Murashige (1974) dung mơi trường để ni cấy nhiều lồi trồng Thành phần chủ yếu tất loại mơi trường gồm nhóm chất sau : muối khoáng đa lượng vi lượng (muối chloride, nitrate, sulphate, chất tham gia điều chỉnh phân hóa rễ, chồi… Các auxin có hiệu sinh lý nồng độ thấp, thường sử dụng với nồng độ từ 10-1 M đến 10-6 M tùy theo chất, mục đích đối tượng nghiên cứu Auxin thêm vào môi trường nuôi cấy kết hợp với auxin nội sinh để điều khiển chiều hướng cường độ q trình sinh trưởng Hàm lượng auxin -9- Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ thấp kích thích phân hóa rễ, ngược lại hàm lượng cao phát động tạo mô sẹo Các auxin thường sử dụng nuôi cấy mô IBA (indol butyric acid), α-NAA (a-naphtylacetic acid), 2,4-D (2,4 diclorophenoxy acetic acid), IAA (indool acetic acid) Cytokinin nhóm phytohormone dẫn xuất adenine, có vai trị sinh lý tương tự Cytokinin liên quan chặt chẽ với phân bào, trì trẻ hóa quan, làm giảm ưu ngọn, kích thích phân hóa chồi từ mơ sẹo ni cấy… Nồng độ cytokinin cao kìm hãm hình thành phát triển rễ Các cytokinin thường sử dụng nuôi cấy kinetin, BAP (benzylaminopurin) với nồng độ 10-4 - 10-7 M Nhiều tác giả tổng kết biệt hóa quan thực vật in vitro kết tác động qua lại hai nhóm auxin cytokinin Cân tỷ lệ auxin/cytokinin nghiêng phía auxin kích thích hình thành rễ, ngược lại cân nghiêng phía cytokinin thúc đẩy tạo chồi Ở tỷ lệ trung gian, mơ sẹo hình thành Đây nguyên tắc chung để điều khiển trình phát sinh hình thái mơ ni cấy Các mơ khác có phản ứng khơng giống Vì vậy, với loại mô giai đoạn sinh trưởng khác nhau, việc tìm tổ hợp nồng độ auxin/cytokinin thích hợp có ý nghĩa quan trọng - Đưa tái sinh trở lại điều kiện tự nhiên Đây giai đoạn quan trọng bao gồm việc huấn luyện in vitro thích nghi với điều kiện thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, nước, sâu bệnh chuyển từ trạng thái di dưỡng sang tự dưỡng hoàn tồn Q trình thích nghi hiểu trình thay đổi đặc điểm sinh lý giải phẫu in vitro Thời gian tối thiểu cho thích nghi - tuần - 10 - ... hoa Huệ Hương - 14 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ Cây hoa Huệ Hương ưa nhiệt độ mát mẻ (20 - 25oC), chịu nóng tốt, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới nhiệt đới, cho hoa tốt vào mùa hè Tuy... hóa hoa - 15 - Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ 1.8.4.4 Đất Cây hoa Huệ Hương trồng loại đất nào, sinh trưởng tốt, cho hoa đẹp loại đất kiềm (pH = - 7), có cấu trúc mịn, giữ ẩm tốt Tuy vậy,.. .Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Lê Ngọc Mỹ trồng tạo ngân hàng giống bệnh, khỏe mạnh cho suất cao, phẩm chất tốt cung cấp cho sản xuất Mục đích nghiên cứu