THÔNG TIN TÀI LIỆU
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM 09 CAO ĐẲNG SINH HỌC LUẬN ÁN VI SINH Thành viên Võ Mạnh Thanh TUấn TRần Quốc BÌnh Huỳnh Quốc Việt Trần Thị Mỹ DIệu Lê Trọng NHàn HUỳnh Diệp BẢo LÂm Mục lục HÌnh thái- cấu trúc Sự xếp gene nhiễm sắc thể phage 14 Lập đồ cấu trúc tinh vi vùng rII phage T4 .15 Chu trình tiềm tan Phage T4 .18 Quá trình hoạt động virus T4 –Sinh trưởng phát triển ( chu trình sinh tan) .20 Ứng dụng 24 Tài liệu Tham Khảo 26 VÀI NÉT LỊCH SỬ Thực khuẩn thể (phage) thể “ăn” vi khuẩn, hay nói cho đúng: virus vi khuẩn, gây bệnh tiêu diệt vi khuẩn Thực khuẩn thể khơng phải phát Nó biết đến từ lâu Twort phát năm sau (1917) d’He’relle nghiên cứu kỹ Từ nhiều cơng trình nghiên cứu thực nghiệm d’He’relle nhận xét: nguyên nhân tượng thực khuẩn thể loại vi sinh vật nhỏ, có khả gây bệnh cho vi khuẩn với triệu chứng dung giải Sau đó, ngày tìm nhiều loại thực khuẩn thể khác tương ứng với loại vi khuẩn như: phẩy khuẩn tả, thực khuẩn thương hàn, dịch hạch, tụ cầu khuẩn, liên cầu, Brucella, Mycobacteria Về chất tan vỡ tế bào vi khuẩn, tác dụng loại thực khuẩn thể tương ứng Thí dụ mơi trường lỏng có vi khuẩn phát triển, người ta cho vào thực khuẩn thể tương ứng, mơi trường trước đục ngầu có vi khuẩn trở thành suốt sau vài Trên bề mặt môi trường thạch đặc vừa cấy vi khuẩn, người ta rỏ giọt thực khuẩn thể tương ứng vào điểm, sau thời gian để tủ ấm 370C, chỗ rỏ giọt thực khuẩn thể trơ thạch ra, bề mặt lại vi khuẩn mọc kín hết Nhà văn Sinclair Lewis người nói liệu pháp thực khuẩn thể chữa bệnh nhiễm trùng, tiểu thuyết mang tên Arrowsmith xuất vào năm 1925 ông Các nước Đông Âu Liên Xô cũ, nhiều thập kỷ ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể vào điều trị có hiệu cao, người biết đến Đặc biệt xuất nhiều loại thuốc kháng sinh với thắng lợi rực rỡ nó, coi sử dụng đơn giản hiệu quả, thực khuẩn thể bị người lãng quên HÌNH THÁI- CẤU TRÚC Cấu trúc đối xứng phức hợp Thể thực khuẩn T4 cấu tạo phận: đầu , cổ, Đầu có cấu trúc đối xứng 20 mặt cịn lại có đối xứng xoắn Chính mà người ta gọi đối xứng phức hợp Đầu dài 95nm, rộng 65nm, kính hiển vi điện tử thấy rõ 20 mặt Capsid cấu tạo loại protein, lựơng chứa protein chiếm 76-81% thể thực khuẩn Mỗi capsome có đường kính 8nm Có 212 capsome Bên đầu có sợi ds DNA Đầu nối với qua cổ Đó đĩa hình lục giác , đường kính 37.5nm, có tua cổ (cảnh tu) mọc từ cổ Đuôi gồm bao đuôi, ống đuôi, đĩa gốc mấu ghim sợi Bao dài 95nm, có 24 vịng xoắn cấu tạo 144 capsome (mỗi capsome có khối lượng phân tử 55000) cấu tạo nên.Ống đuôi dài 95nm, đường kính 8nm, có lỗ thủng đường kính 2.5-3.5nm Đây đường để dẫn DNA đầu thể thực khuẩn xâm nhiễm vào tế bào vật chủ Ống cấu tạo 24 vịng xoắn, tương ứng 24 vịng xoắn bao Đĩa gốc tương tự đĩa cổ, đĩa hình lục giác, rỗng đường kính đĩa gốc 30.5nm, mọc sợi mấu ghim Mấu ghim dài 20nm có chức hấp phụ Sợi dài 140nm gấp lại giữa, đường kính 2nm Sợi cấu tạo laoị phân tử protein lớn loại phân tử protein nhỏ Nó có tác dụng hấp phụ chuyên hoá vùng mẫn cảm bê mặt tế bào vật chủ Sau sợi đuôi hấp phụ đĩa gốc bị kích thích, dẫn đến việc co rút bao đuôi làm cho ống đuôi đâm vào tế bào vật chủ Khi 144 capsome bao đuôi phát sinh phản ứng thay đổi vị trí phức tạp làm cho chiều dài co lại 50%, giống với co protein sợi *Vỏ capsid: Capsid vỏ protein bao bọc phần đầu chưua DNA virus,được cấu tạo đơn vị hình thái gọi capsome Capsome lại cấu tạo từ đơn vị cấu trúc gọi protome Protome monome (chỉ có phân tử protein) polyme (có nhiều phân tử protein) - Pentame (penton) có protome nằm đỉnh khối đa diện, hexame (hexon) tạo thành cạnh bề mặt hình tam giác. - Capsid có khả chịu nhiệt, pH yếu tố ngoại cảnh nên có chức bảo vệ lõi acid nucleic - Trên mặt capsid chứa thụ thể đặc hiệu, gai glicoprotein, giúp cho virus bám vào thụ thể bề mặt tế bào Đây kháng nguyên (KN) kích thích thể tạo đáp ứng miễn dịch (ĐƯMD). - Vỏ capsid có kích thước cách xếp khác khiến cho virus có hình dạng khác Có thể chia ba loại cấu trúc: đối xứng xoắn, đối xứng hình khối cấu trúc phức tạp (Hình 1) Hình Kích thước hình thái số virus điển hình Theo Presscott L M et al , Microbiology 6th ed Intern Ed 2005 2.2.1 Cấu trúc đối xứng xoắn: Sở dĩ virus có cấu trúc capsome xếp theo chiều xoắn acid nucleic Tuỳ loại mà có chiều dài, đường kính chu kỳ lặp lại nucleocapsid khác Cấu trúc xoắn thường làm cho virus có dạng hình que hay hình sợi ví dụ virus đốm thuốc (MTV), dại (rhabdo), quai bị, sởi (paramyxo), cúm (orthomyxo) virus cúm nucleocapsid bao vỏ ngồi nên quan sát kính hiển virus điện tử thấy chúng có dạng cầu 2.2.2 Cấu trúc đối xứng dạng khối đa diện 20 mặt Hình phịng thí nghiệm Robert M Bock Đại học University of Wisconsin-Madison Ở virus loại này, capsome xếp tạo vỏ capsid hình khối đa diện với 20 mặt tam giác đều, có 30 cạnh 12 đỉnh Đỉnh nơi gặp cạnh thuộc loại gồm virus adeno, reo, herpes picorna Gọi đối xứng so sánh xếp capsome theo trục Ví dụ đối xứng bậc 2, bậc 3, bậc 5, ta xoay với góc 1800 (bậc 2), 1200 (bậc 3) 720 (bậc 5) thấy cũ Các virus khác có số lượng capsome khác Virus lớn, số lượng capsome nhiều Dựa vào số lượng capsome cạnh tính tổng số capsome vỏ capsid theo công thức sau: N= 10(n-1)2+2 Trong N- tổng số capsome vỏ capsid, n-số capsome cạnh Hình A Sơ đồ virus hình que với cấu trúc đối xứng xoắn (virus khảm thuốc lá) Capsome xếp theo chiều xoắn acid nucleic B- Sơ đồ virus đa diện đơn giản Mỗi mặt tam giác Đỉnh cạnh hợp lại Mỗi cạnh chứa capsome C- Sự đối xứng hình đa diện thể quay theo trục bậc (1800), bậc (1200) bậc (720) Theo J Nicklin et al., Instant Notes in Microbiology, Bios Scientific Publisher, 1999 Trong nguồn tài liệu khác chi tiết thì: Có phần cấu trúc nên Phage T4: phần đầu , phần thân với sợi đuôi Phần đầu: Phần đầu bacteriophage T4 có trọng lượng khoảng 194 Mda, chiều dài khoảng 1150 Ǻ chiều rộng khoảng 850 Ǻ Phần đầu khối đa diện 20 mặt bao gồm 160 phân tử có chứa tiểu đơn vị Gp23( protein capsid chính), 11 phân tử có chứa tiểu đơn vị Gp24 (các protein góc) phân tử có 20 tiểu đơn vị Gp20 Trong suốt trình định hình phần đầu , protein nâng đỡ trải qua phân giải Gp21 amin protein gp23 , gp24, IPI, IPII, IPIII, gpalt phân cắt, protein gp22, gp21, gp67, gp68 tiêu hóa Khoảng cách trung tâm gp23 ~ 140Ǻ protein tạo thành vỏ khoảng 30-Ǻ bảo vệ acid nucleic Góc chiếm Gp24 chúng tương tác với phần viền Gp23 Một yếu tố cấu trúc capsid T4 loại protein nhỏ tên Soc Nó tạo lưới gần liên tục bề mặt gp23 Nó liên kết tiểu đơn vị Gp23, khơng thể liên kết quanh Gp24 khoảng Gp23 Gp24 Kết mạng lưới tạo Gp Soc bao quanh gp23, bỏ qua Gp24 Hầu phân tử Gp23 kết nối với protein Soc, ngoại trừ phân tử nằm gần với Gp24 Mặc dù chức Soc chưa xác định đầy đủ, coi ổn định thể thực khuẩn capsid chống lại biến tính nhiệt tiếp xúc với kiềm ,chất tẩy rửa, đó, có trách nhiệm bảo tồn sinh tồn thể thực khuẩn điều kiện không thuận lợi Gene (kDa) Kích thước (số lượng aminoacid) 21 18.5 ♦ 22 2.5 ♦ 23 24 67 68 Alt Học 48.7 46.0 3.9 15,7 75.9 39.1 422 407 ♦ ♦ 682 376 Số Địa điểm lượng đầu trưởng thành ♦ Lõi ♦ Lõi, protein 930 vỏ,capsid 55 vỏ, đỉnh ♦ lõi ♦ lõi 40 lõi 155 vỏ, bên ngồi bề mặt 10 khơng thay đổi suốt q trình co lại của bao (Leiman cộng năm 2003) Ở hai đầu ống (vịng cổ) sợi Vòng cổ cấu trúc đa protein,những protein cấu tạo thành nêm( WHISKER) bao quanh trục trung tâm nhờ giúp đỡ protein (gp9)3 (gp12)3 Gp11, gp10, gp7, gp8, gp6, gp53, gp25 kết hợp liên tiếp để tao nên vòng nêm Gp5, gp27, gp29, gp26 ,gp28 tạo nên trục nêm Gp5 có lysozyme cần cho tiêu hố lớp peptidoglycan vi khuẩn suốt trình xâm nhập Một phận hữu dụng bacteriophage T4 sợi đuôi Sợi đuôi dài râu ngắn (mọc từ vùng cổ áo-còn gọi tua cổ) gắn vào đầu ống thân (Coley Wood năm 1975) Những sợi đuôi dài đảm nhận trách nhiệm việc liên kết với thụ thể đặc biệt bề mặt vi khuẩn Mỗi sợi đuôi bao gồm phần: nửa gần mã hoá gen 34 phần xa mã hoá gen 36 37 Cả hai phần kết nối Gp35, đồng thời tương tác với Gp34 Gp36 Protein liên kết sợi đuôi với mặt tiếp xúc Gp9 Sự kết hợp phần đuôi gần với Gp9 giúp đỡ Gp63 Gp9 có vai trị quan trọng trình lây nhiễm Sau liên kết sợi đuôi tới LPS (lipopolysaccharide) thành tế bào vi khuẩn, khởi động q trình biến đổi cấu trúc nơi tiếp xúc , sau bao đuôi co lại cho phép thể thực khuẩn tiêm DNA vào tế bào Bên cạnh , Gp9 đảm bảo chức chuyển động tổng hợp tất sợi đuôi ngăn cản chống đỡ thành tế bào Các đuôi ngắn (tua cổ) Gp12 gắn vào mặt tiếp xúc Gp11,chúng có cấu trúc thu hẹp giữa-nơi cho phép sợi uốn cong lên Các tua cổ đảm nhiệm chức liên kết phần đầu Phage với bề mặt vi khuẩn Trong suốt trình xâm nhập phân tử gp12 liên kết với khu vực cốt lõi receptor bề mặt tế bào LPS (Mesyanzhinov cộng 2004) 12 Cấu trúc PRPTEIN phần thân sợi đuôi phage t4 (xác định Mesyanzhinov và cộng 2004 , Leimann cộng 2003) Gene Kích (kDa) thước (số lượng aminoacid ) 19.7 176 63.7 575 74.4 660 119.2 1032 38.0 334 31.0 288 10 66.2 602 11 23.7 219 12 55.3 527 15 31.4 272 18 71.2 659 19 18.5 163 25 15.1 132 26 23.4 208 27 44.4 208 28 24.0 177 29 64.4 391 34 140.0 1289 35 30.0 372 36 23.0 221 37 109.0 1026 48 39.7 177 53 23.0 196 54 35.0 590 Frd 21.7 320 Td 33.1 364 wac 51.9 89 Số mẫu tồn 12 12 18 18 18 3* 144 144 n.d n.d 3* 1* 3* 3* 6 6 3* Vị trí ống thân Trục trung tâm Phần nêm bao ống thân Phần nêm bao ống thân Phần nêm bao ống thân phần đầu Mấu ghim Mấu ghim Mặt tiếp xúc (Tấm nền) Thân Bao đuôi(thân) Ống (thân) Lớp nêm mặt tiếp xúc Chaperone Trục trung tâm Trục trung tâm Ống Phần đuôi gần Phần cổ Phần đuôi xa Phần đuôi xa Lớp nêm mặt tiếp xúc Lớp nêm mặt tiếp xúc Lớp nêm mặt tiếp xúc Lớp nêm mặt tiếp xúc Trục trung tâm Phần liên kết đầu thân n.d : Không xác định 13 *: số mẫu protein cho sợi đi. Có sáu sợi virion T4 bám vào ,bao đuôi xoắn lại Sự xếp gene nhiễm sắc thể phage Tần số tái tổ hợp sử dụng để xác định khoảng cách đồ Eukaryote Các thí nghiệm lập đồ cho thấy đột biến T4 lập đồ thành cụm riêng biệt Cả ba cụm có liên kết với cụm khác George Streisinger cộng (1964) chứng minh đồ di truyền phage T4 có dạng vịng trịn Trong phép lai, lập ba đến bốn điểm đánh dấu ( MARKER) di truyền với nhóm tiến hành qua toàn genome T4 Nhiều gene khác xác định và lập bản đồ đầy đủ trên phân tử vòng tròn Những vùng vòng tròn bên cụm điểm đánh dấu T4 xác định lập đồ di truyền Vịng ngồi có mặt nhiều đánh dấu lớn tạo thành tồn vịng trịn đồ di truyền Bản đồ di truyền phage T4 cho thấy gene phage T4 tạo cụm mở rộng theo chức chúng Chẳng hạn có cụm lớn gene dùng cho chép DNA vị trí phần tư bên phía phải có cụm gene tổng hợp cấu phần tạo nên đầu phage phía vịng tròn Phân tử DNA phage T4 phân tử sợi đơn dạng thẳng, đầu tận cùng của DNA phage T4 được nhân lên hoặc lặp đoạn ở đầu cuối (terminal redundant) Do vậy, phân tử DNA có kích thước tăng thêm 2% Khi DNA chép tế bào, tái tổ hợp phần đầu tận gen T4 với trình tự tương đồng gen T4 khác, kết quả tạo ra sản phẩm DNA có kích thước lớn hơn khả năng chứa phần đầu. Những phân tử chứa lặp đoạn được tạo thành vì sự tái tổ hợp gen phage T4 xảy thường xun, trung bình có khoảng 20%sự kiện tái tổ hợp xảy nhiễm sắc thể Khi phân tử DNA gói vào phần đầu, nó được cắt bằng enzyme chỉ còn chứa khoảng 102% của chiều dài gen phage T4, có chứa đoạn lặp lại phần đầu 14 Bản đồ di truyền T4 với marker Lập đồ cấu trúc tinh vi vùng rII phage T4 Các nghiên cứu chi tiết đột biến rII phage T4 làm sáng tỏ cấu trúc gene Phage T4 dạng hoang dại r+ có khả nhiễm đồng thời hai nòi E.coliB K Các đột biến rII nhiễm nịi B khơng nhiễm nịi K. Seymour Benzer (1955) đã nhận được 2400 đột biến rII có nguồn gốc độc lập với Ông cho lai đột biến với vào xuất dạng tái tổ hợp hoang dại r+ mà lập đồ điểm đột biến Mỗi đột biến có thể tái tổ hợp với các đột biến khác. Đột biến đoạn ngăn cản tái tổ hợp với hai nhiều đột biến điểm vị trí khác gene Mỗi đoạn làm phần gene phage bao gồm vùng rII Sử dụng đột biến 15 đoạn phương pháp đơn giản để lập đồ hàng ngàn đột biến Bản đồ đoạn (Deletion mapping) dựa có khơng có dạng tái tổ hợp Trong phép lai đột biến điểm chưa biết đột biến đoạn, xuất dạng hoang dại cho thấy đột biến điểm nằm vùng đoạn Ngược lại, đột biến điểm xuất vùng đoạn, không xuất dạng tái tổ hợp kiểu hoang dại hệ sau Đột biến đoạn sử dụng để chia locus rII bacteriophage T4 thành vùng 47 tiểu vùng nhỏ Nhiều phép lai thực để lập đồ đột biến chi tiết gene rII Khoảng cách từ A1 đến A6 B trình bày hình 8.4 Một đột biến đặc biệt kiểm tra định vị vùng A4 Đột biến không tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại phép lai với đột biến đoạn lớn r1272, r1241, rJ3 rPT1 tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại phép lai với rPB242, rA105 và r638. Các đột biến được tạo ra bởi cùng khuôn, kết lai với đột biến đoạn lớn xếp vào vùng A4 Bản đồ di truyền vùng A4 tạo đột biến đoạn trình bày phần hình Xác định tiểu vùng A4 (từ a qua g) 16 Xác định vùng rII liên quan với marker di truyền dạng thẳng đồ di truyền phage T4 Ví dụ, đột biến vùng A4 kết tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại với đột biến đoạn r1368, lại thực với đột biến r221 vào tiểu vùng c Ở mức độ chi tiết hơn, đột biến tiểu vùng xếp nhờ lai chúng với Ở phage T4, điểm đột biến gần nhau, tách nhờ tái tổ hợp 1% tái tổ hợp tương ứng với khoảng cách khoảng 100 bp Vì vậy, hai đột biến khơng thể tái tổ hợp với xếp vào vị trí gene. Bản đồ di truyền cho số lớn các đột biến rII có nguồn gốc độc lập mơ tả hình Nghiên cứu đột biến vùng rII lập đồ di truyền có vai trị quan trọng, qua rút kết luận sau: + Sự trao đổi di truyền có thể xảy trong gene có thể giữa nucleotide gần + Các đột biến không tạo tần số với tất điểm gene, chúng phân bố không Chẳng hạn, 2400 đột biến rII xác định 304 điểm Một điểm có đến 474 đột biến Nhũng điểm có tần số đột biến cao gọi điểm nóng (hotspot mutation) Ở điểm khác, đột biến phục hồi lần vài lần 17 Bản đồ di truyền locus rII phage T4 Kết phân tích vùng rII quan trọng, giúp cho phân biết 3 khái niệm gene. Phổ biến nhất, gene liên quan với một đơn vị chức Điều tương ứng với đoạn DNA mã hóa cho phân tử protein. Benzer đưa ra thuật ngữ cistron để chỉ chức năng này, thuật ngữ cistron sử dụng Đơn vị chức xác định qua thử nghiệm bổ sung (complementation test), xác định được 2 đột biến có allele với khơng Trước thí nghiệm ơng rII coi locus Thí nghiệm cho thấy đột biến xếp thành hai nhóm rIIA rIIB Lai đột biến rIIA x rIIB có r+, lai rIIA ´ rIIA rIIB ´ rIIB thu kiểu hình đột biến r Ngồi nghĩa đơn vị chức năng, gene đơn vị tái tổ hợp (recon) đơn vị đột biến (muton) Cả hai đơn vị này, tương ứng với nucleotide riêng lẽ gene CHU TRÌNH TIỀM TAN Ở PHAGE T4 18 Chu trình tiềm tan bắt đầu khi phân tử DNA của phage gắn vào nhiễm sắc thể vi khuẩn tiến hành chép phần nhiễm sắc thể vi khuẩn Các hạt phage không tạo thành Phân tử DNA phage gắn vào gen vi khuẩn gọi prophage, tế bào vi khuẩn sống sót được gọi là tế bào tiềm tan (lysogen). Phân tử DNA của phage có đầu các đầu cuối chứa 12 nucleotide khơng kết cặp, mà dạng sợi đơn tạo đầu dính (cohesive end) bổ sung Khi vào tế bào, đầu cuối bổ sung gắn lại tạo phân tử vòng tròn Sự tạo vịng trịn xảy sớm chu trình tan chu trình tiềm tan Có khoảng 75% tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage, phân tử DNA vòng trịn chép chu trình tan xảy tiếp theo Còn khoảng 25% tế bào bị nhiễm, phân tử DNA vòng tròn phage l phân tử DNA vòng tròn E colitương tác xảy tái tổ hợp điểm chuyên biệt (site-specific recombination) DNA phage gắn vào nhiễm sắc thể vi khuẩn Vị trí tái tổ hợp điểm chuyên biệt DNA vi khuẩn phage được gọi là điểm gắn vào của vi khuẩn và phage (bacterial and phage attachment sites) Mỗi điểm gắn có chứa đoạn: đoạn trung tâm có trình tự nucleotide vị trí gắn vùng mà tái tổ hợp thực xảy Điểm gắn vào phage ký hiệu POP’ (P: phage) điểm gắn vào vi khuẩn biểu diễn BOB’ (B: bacteria) So sánh đồ di truyền phage prophage POP’ nằm gần vùng trung tâm phân tử DNA dạng thẳng Một protein phage, integrase, xúc tác cho tái tổ hợp điểm chuyên biệt Enzyme integrase nhận điểm gắn vào phage vi khuẩn, gây trao đổi vật lý, kết phân tử DNA phage gắn vào phân tử DNA vi khuẩn Kết tái tổ hợp làm đồ di truyền của prophage khác với bản đồ di truyền của phage. Bản đồ di truyền prophage chuyển đổi vòng tròn đồ di truyền phage tự 19 Prophage chèn vào nhiễm sắc thể E coli gene gal gene bio Sự chèn vào phage làm tăng khoảng cách gene gal gene bio Khi tế bào tiềm tan, gene phage trở thành phần nhiễm sắc thể của vi khuẩn vì vậy có thể làm kiểu hình của vi khuẩn bị thay đổi Nhưng hầu hết gene phage prophage giữ trạng thái bất hoạt nhờ protein repressor – sản phẩm gene phage Protein repressor bắt đầu tổng hợp nhờ nhiễm vào phage tiếp tục tổng hợp nhờ prophage. Gene mã hóa cho repressor thường chỉ là gene prophage biểu chu trình tiềm tan Nếu tế bào tiềm tan bị nhiễm phage giống với prophage, có mặt repressor prophage ngăn cản sự biểu hiện các gene của phage nhiễm vào. Tính kháng với phage giống với prophage gọi tính miễn nhiễm (immunity) Đây tiêu chuẩn để xác định tế bào vi khuẩn chứa phage đặc biệt. Chẳng hạn phage l không tạo đốm vi khuẩn chứa prophage lamda Trong tế bào tiềm tan, chép khơng giải phóng phage Tuy nhiên, prophage đơi trở nên có hoạt tính, trải qua chu trình tan, tạo số lượng lớn phage hệ sau Hiện tượng gọi cảm ứng prophage (prophage induction), nó được bắt đầu bằng sự hư hại DNA của vi khuẩn. Đơi prophage tách khỏi DNA vi khuẩn cách ngẫu nhiên thường gây tác nhân môi trường hóa chất chiếu xạ Khả bị cảm ứng thuận lợi cho phage DNA phage khỏi tế bào bị hư hại Cơ chế sinh hóa cảm ứng phức tạp thoát phage xảy dễ dàng Sự cắt phage tái tổ hợp điểm chuyên biệt khác, ngược với quá trình gắn vào. Sự cắt này yêu cầu enzyme của phage, integrase thêm protein phage 20 excisionase Nghiên cứu di truyền gắn vật lý cho thấy escisionase gắn với integrase và sau đó nhận ra điểm gắn vào prophage BOP’ POB’, gắn với điểm Integrase cắt trình tự O tạo lại BOB’ POP’ Quá trình tách diễn ngược lại với gắn vào 5.Quá trình hoạt động virus T4 –Sinh trưởng phát triển * ký sinh E.coli ( chu trình sinh tan) Bao gồm giai đoạn:hấp phụ, xâm nhập, chép,thành thục, phóng thích SỰ hấp thụ:trong dung dịch thể thực khuẩn ngẫu nhiên gặp tế bào vật chủ tương ứng có tiếp xúc mút sợi với thụ thể đặc dị bề mặt tế bào CÓ tác giả cho q trình hố học hình thành gốc-NH2 sợi gốc – COOH thụ thể.Có thể chạm vào tua cổ mà búi sợi đuôi gỡ tung ra.Sau sợi đuôi bám thụ thể, , mấu ghim đĩa gốc áp sát bề mặt tế bào Người ta nhận thấy bề mặt vi khuẩn có khoảng 300 điểm hấp phụ Các thể thực khuẩn khác có vị trí khác điểm hấp phụ Ví dụ thể thực khuẩn t4 E.coli có điểm hấp phụ lipopolysaccharide, t2 lại có điểm hấp phụ lipoprotein Việc hấp phụ chịu nhiều tác động nhân tố nội ngoại cảnh, ví dụ: -Số lượng thể thực khuẩn: Vì số điểm hấp phụ bề mặt tế bào vật chủ có hạn số thể thực khuẩn hấp phụ có hạn Số lượng thể thưucj khuẩn tương ứng hấp phụ tế bào mẫn cảm gọi phức số cảm nhiễm M.O.I Phức số cảm nhiễm thường lớn, tới 250-360 Nếu lượng lớn thể thực khuẩn đồng thời hấp phụ tế bào mẫn cảm, đầu ống thể thực khuẩn có lizozyme làm cho bề mặt tế bào vật chủ có nghìn nhọt trăm lỗ khiến tế bào bị phá vỡ Đó M.O.I cao gây nên Trường hợp phá vỡ tế bào không làm sản sinh hệ thể thực khuẩn mới, ngườ ta gọi phá vỡ tự hoại -Các ion dương: Các ion Ca2+ , Mg2+ Ba2+… có tác dụng xúc tiến hấp phụ, ngược lại, ion Al3+ ,Fe3+ ,Cr3+… lại có tác dụng làm bất hoạt -Các nhân tố bổ trợ: Tritophan xúc tiến hấp phụ thể thực khuẩn T4, Biotin xúc tiến hấp phụ thể thực khuẩn vi khuẩn sinh acid glutamid(sản xuất bột ngọt, mì chính) -pH: mơi trường trung tính có lợi cho hấp phụ Khi pH10 thể thực khuẩn khó hấp phụ 21 -Nhiệt độ: Nhiệt độ thích hợp cho phát triển thích hợp cho hấp phụ SỰ xâm nhập Sau hấp phụ, đĩa gốc sợi nhận kích thích, làm cho 144 capsome bao có vận động phức tạp CHúng co lại nửa chiều dài đâm ống đuôi qua thành tế bào màng tế bào chất Trong trình men lizozyme đầu ống có tác dụng làm hoà tan peptidoglican phận thành tế bào Thời gian hấp phụ đến xâm nhập ngắn, nhiệt độ thích hợp với thể thực khuẩn T4 cần có 15 giây Nếu có từ thể thực khuẩn khác trở lên xâm nhập vào tế bào vậtc hủ cuối thực khuẩn sinh sản mà thơi Sự chép Q trình sinh sản xảy với chép acid nucleic sinh tổng hợp protein Đầu tiên thể thực khuẩn cung cấp thông tin di truyền cho tế bào vật chủ bắt tế bào tổng hợp “Nguyên liệu” dựa hệ thống trao đổi chất tế bào vật chủ Các nguyên liệu tiếp tục tạo thành phận thể thực khuẩn (vỏ protein lõi acid nucleic) Sau lắp ráp thành thể thưucj khuẩn hồn chỉnh, thể thực khuẩn hệ “con” có kích thước 22 Trong tế bào vật chủ DNA chuỗi thẳng Phage khép vòng nhờ chế tuỳ thuộc phân tử chuỗi thảng có đầu dính hay có đầu dư thừa Đầu dính vùng ngắn, có sợi đơn, bổ sung Bên tế bào vật chủ chúng khép lại tạo thành phân tử vòng, để lại chỗ hở sợi Những chỗ hở hàn gắn lại nhờ tác dụng ligaza Các phân tử DNA chuỗi thẳng có đầu dư thừa khép vịng nhờ có tái tổ hợp bên vùng tận đồng dạng Nhiễm sắc thể vòng virus mở đầu chép vị trí đặc biệt diễn theo hai hướng quanh phân tử theo trình tương tự nhiễm sắc thể vi khuẩn Những lần chép nhiều trường hợp diễn theo q trình gọi vịng xốy Một endonucleaza đặc biệt cắt sợi đầu 3’-OH cùa sợi bị cắt dùng làm ngòi để gắn thêm nucleotit khác Sợi nguyên vẹn bổ sung dùng làm khuôn Như đầu 5’ bị thay sau chép Theo cách phân tử sợi kép tổng hợp dài gấp nhiều lần nhiễm sắc thể virus Các phân tử gọi thể đa liên, sau bị cắt thành nhiễm sắc thể virus thường Trong số trường hợp khép vòng không diễn trước chép Phân tử dạng chuỗi chép nhiều lần thành số phân tử giống nhau, sau tái tổ hợp để tạo thể đa liên Cuối thể đa liên endonucleaza cắt thành nhiễm sắc thể có đầu dư thừa Sự thành thục Sự thành thục gọi lắp ráp giai đoạn thứ trình sinh sản virus Sau protein capsid acid nucleic virus tích luỹ phong phú tế bào vật chủ bắt đầu xảy trình lắp ráp (hay tập hợp-assembly) Ở virus thực vật virus có cấu trúc đối xứng xoắn ốc lắp ráp tương đối đơn giản Các protein capsid liên kết với nhiễm sắc thể virus cuộn lại thành dạng xoắn ốc Sự lắp ráp thể thực khuẩn có đối xứng phức tạp Khi q trình lắp ráp giải phóng virion thành thục liên quan với Việc tập hợp diễn mặt màng tế bào chất protein capsid gắn vào AND sợi virion sinh trưởng bị đẩy qua thành tế bào Việc lắp ráp virus có đối xứng 20 mặt thể thực khuẩn virus có đối xứng phức hợp (ví dụ có đầu đi) khác chút Trong đa số trường hợp protein capsid tập hợp tạo thành cấu trúc rỗng gọi procapsid hay tiền capsid có hình dạng kích thước capsid (hoặc đầu trường hợp thể thực khuẩn khơng có đi) 23 Sau acid nucleic virus vào cấu trúc kết hợp thành trạng thái chặt chẽ Với virus đối xứng 20 mặt procapsid hàn lại trở nên không thấm phân tử lớn Ở thể thực khuẩn gồm thành phần tập hợp riêng biệt sau gắn với đầu có chứa DNA Trong hầu hết trường hợp bước cuối giai đoạn lắp ráp cuả virus với vỏ việc tiếp nhận màng tế bào vật chủ bao bọc lấy lõi nucleocapsid virus qua màng tế bào chất vật chủ Trước diễn bước protein virus virus đọc mã tích tụ màng tế bào chất màng nhân Ở virus động vật có vỏ protein virus tổng hợp riboxom gắn vào mạng lưới nội chất thô màng bên cạnh bao lấy chúng tổng hợp Thương protein glycozyl hố enzyme có mặt mạng lưới nội chất Các virus có vỏ chứa DNA (T4) protein màng di chuyển đến màng nhân Ở nucleocapsid tập hợp nhân liên kết với vùng màng nhân gắn với protein màng virus Màng bao quanh lõi nucleoprotein virion tách khỏi nhân Virion thành thục chuyển tới lưới nội chất Sự phóng thích Virus DNA có vỏ di chuyển từ mạng lưới nội chất đến bào nang Từ chúng phóng thích nhờ trình đào thải khỏi tế bào qua trình xuất bào Ở số virus động vật khơng có vỏ (như adenovirus) virus trực tiếp phóng thích qua màng tế bào chất mà không mà không làm tổn hại đến tế bào vật chủ Tuy nhiên, nhiều virus động vật virus thực vật làm giết chết tế bào vật chủ ngồi sau tế bào chủ bị tự phân Trong phần lớn trường hợp thể thực khuẩn giải phóng thơng qua việc làm phân giải vi khuẩn Trong số trường hợp gen thể thực khuẩn biểu pha muộn đọc mã cho lyzozyme phân giải liên kết glycozit peptidoglican Trong số trường hợp khác gen thể thực khuẩn đọc mã cho enzyme phân giải liên kết chéo peptid peptidoglycan Tuy chưa rõ ngun nhân làm dung giải tế bào khơng trường hợp 6.Ứng dụng: Sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp 24 Trong thùc tÕ, c«ng nghƯ ADN tái tổ hợp dùng đồng nghĩa với thuật ngữ tách dòng phân tử (molecular/DNA cloning), hay kü tht di trun (genetic engineering) Nhng thùc chÊt c¸c thuật ngữ có khác Mc ớch Phõn lập gen từ hỗn hợp nhiều gen tế bào, để phân tích nghiên cứu gen riêng lẽ Nhân dòng gen phân lập lên số lượng lớn, để đáp ứng đủ cho nhu cầu nghiên cứu Khả tạo gen/tổ hợp gen *Cụ thể phage T4 ứng dụng ezyme công nghệ DNA tái tổ hợp, enzyme nối khung phân tử DNA ( nối đoạn DNA) : T4 DNA ligase +Các enzyme bổ sung loại nhóm phosphate đầu tận acid nucleic: T4 polynucleotide kinase +Các enzyme tổng hợp mối liên kết phosphodieste phân tử acid nucleic :T4 DNA polymerase -T4 DNA ligase: Mã hoá hệ gen phage T4, nối đoạn DNA sợi kép với nhau, không nối đoạn DNA mạch đơn DNA RNA Hoạt tính nối mạnh E coli DNA ligase, khơng cần trình tự đối diện , tạo vector tái tổ hợp nhân dòng ứng dụng: nối đoạn DNA sợi kép đầu dính tù 25 -T4 ARN ligase: có khả nối DNA-DNA , DNA-RNA, RNA-RNA Có thể gắn mchj đơn sợi kép ứng dụng: dùng để nối dài phân tử DNA RNA, gắn trình tự nucleic đánh dấu (vd:GFP) TÀI LIỆU THAM KHẢO www.google.com http://t4phage.com Leiman P.G., Kanamaru S., Mesyanzhinov V.V., Arisaka F., Rossmann M.G.: Structure and morphogenesis of bacteriophage T4. Cellular and Molecular Life Science 60 2356 � 2370 (2003) - Fokine A., Chipman P.R., Leiman P.G., Mesyanzhinow V.V., Rao V.B Molecular architecture of the prolate head of bacteriophage T4. PNAS Vol 101 No 16 6003-6008 (2004) - Mesyanzhinov V.V., Leiman P.G., Kostyuchenko V.A., Kurochkina L.P., Miroshnikov K.A., Sykilinda N.N., Shneider M.M.: Molecular Architecture of Bacteriophage T4. Biochemistry (Moscow) Vol 69 No 11 (2004) 26 ... vỏ, Phần Thân VÀ Các Sợi PHAGE T4 Thân sợi: Phần quan trọng với Phage T4 cơng cụ đắc lực để giúp Phage bám vào vật chủ Phần lớp vỏ xác định đặc tính khả lây nhiễm vào vi khuẩn Phage Phần thân... gen phage T4, có chứa đoạn lặp lại phần đầu 14 Bản đồ di truyền T4 với marker Lập đồ cấu trúc tinh vi vùng rII phage T4 Các nghiên cứu chi tiết đột biến rII phage T4 làm sáng tỏ cấu trúc gene Phage. .. định 304 điểm Một điểm có đến 474 đột biến Nhũng điểm có tần số đột biến cao gọi điểm nóng (hotspot mutation) Ở điểm khác, đột biến phục hồi lần vài lần 17 Bản đồ di truyền locus rII phage T4 Kết
Ngày đăng: 15/03/2023, 15:12
Xem thêm: