Luận văn tốt nghiệp đặc điểm phage t4 và ứng dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM 09 CAO ĐẲNG SINH HỌC LUẬN ÁN VI SINH Thành viên  Võ Mạnh Thanh TUấn      TRần Quốc BÌnh Huỳnh Quốc Việt Trần Thị Mỹ DIệu Lê Trọng NHàn HUỳnh Diệp BẢo LÂm  Mục lục HÌnh thái- cấu trúc Sự xếp gene nhiễm sắc thể phage 14 Lập đồ cấu trúc tinh vi vùng rII phage T4 .15 Chu trình tiềm tan Phage T4 .18 Quá trình hoạt động virus T4 –Sinh trưởng phát triển ( chu trình sinh tan) .20 Ứng dụng 24 Tài liệu Tham Khảo 26 VÀI NÉT LỊCH SỬ Thực khuẩn thể (phage) thể “ăn” vi khuẩn, hay nói cho đúng: virus vi khuẩn, gây bệnh tiêu diệt vi khuẩn Thực khuẩn thể khơng phải phát Nó biết đến từ lâu Twort phát năm sau (1917) d’He’relle nghiên cứu kỹ Từ nhiều cơng trình nghiên cứu thực nghiệm d’He’relle nhận xét: nguyên nhân tượng thực khuẩn thể loại vi sinh vật nhỏ, có khả gây bệnh cho vi khuẩn với triệu chứng dung giải Sau đó, ngày tìm nhiều loại thực khuẩn thể khác tương ứng với loại vi khuẩn như: phẩy khuẩn tả, thực khuẩn thương hàn, dịch hạch, tụ cầu khuẩn, liên cầu, Brucella, Mycobacteria Về chất tan vỡ tế bào vi khuẩn, tác dụng loại thực khuẩn thể tương ứng Thí dụ mơi trường lỏng có vi khuẩn phát triển, người ta cho vào thực khuẩn thể tương ứng, mơi trường trước đục ngầu có vi khuẩn trở thành suốt sau vài Trên bề mặt môi trường thạch đặc vừa cấy vi khuẩn, người ta rỏ giọt thực khuẩn thể tương ứng vào điểm, sau thời gian để tủ ấm 370C, chỗ rỏ giọt thực khuẩn thể trơ thạch ra, bề mặt lại vi khuẩn mọc kín hết Nhà văn Sinclair Lewis người nói liệu pháp thực khuẩn thể chữa bệnh nhiễm trùng, tiểu thuyết mang tên Arrowsmith xuất vào năm 1925 ông Các nước Đông Âu Liên Xô cũ, nhiều thập kỷ ứng dụng liệu pháp thực khuẩn thể vào điều trị có hiệu cao, người biết đến Đặc biệt xuất nhiều loại thuốc kháng sinh với thắng lợi rực rỡ nó, coi sử dụng đơn giản hiệu quả, thực khuẩn thể bị người lãng quên HÌNH THÁI- CẤU TRÚC Cấu trúc đối xứng phức hợp Thể thực khuẩn T4 cấu tạo phận: đầu , cổ, Đầu có cấu trúc đối xứng 20 mặt cịn lại có đối xứng xoắn Chính mà người ta gọi đối xứng phức hợp Đầu dài 95nm, rộng 65nm, kính hiển vi điện tử thấy rõ 20 mặt Capsid cấu tạo loại protein, lựơng chứa protein chiếm 76-81% thể thực khuẩn Mỗi capsome có đường kính 8nm Có 212 capsome Bên đầu có sợi ds DNA Đầu nối với qua cổ Đó đĩa hình lục giác , đường kính 37.5nm, có tua cổ (cảnh tu) mọc từ cổ Đuôi gồm bao đuôi, ống đuôi, đĩa gốc mấu ghim sợi Bao dài 95nm, có 24 vịng xoắn cấu tạo 144 capsome (mỗi capsome có khối lượng phân tử 55000) cấu tạo nên.Ống đuôi dài 95nm, đường kính 8nm, có lỗ thủng đường kính 2.5-3.5nm Đây đường để dẫn DNA đầu thể thực khuẩn xâm nhiễm vào tế bào vật chủ Ống cấu tạo 24 vịng xoắn, tương ứng 24 vịng xoắn bao Đĩa gốc tương tự đĩa cổ, đĩa hình lục giác, rỗng đường kính đĩa gốc 30.5nm, mọc sợi mấu ghim Mấu ghim dài 20nm có chức hấp phụ Sợi dài 140nm gấp lại giữa, đường kính 2nm Sợi cấu tạo laoị phân tử protein lớn loại phân tử protein nhỏ Nó có tác dụng hấp phụ chuyên hoá vùng mẫn cảm bê mặt tế bào vật chủ Sau sợi đuôi hấp phụ đĩa gốc bị kích thích, dẫn đến việc co rút bao đuôi làm cho ống đuôi đâm vào tế bào vật chủ Khi 144 capsome bao đuôi phát sinh phản ứng thay đổi vị trí phức tạp làm cho chiều dài co lại 50%, giống với co protein sợi *Vỏ capsid: Capsid vỏ protein bao bọc phần đầu chưua DNA virus,được cấu tạo đơn vị hình thái gọi capsome Capsome lại cấu tạo từ đơn vị cấu trúc gọi protome Protome monome (chỉ có phân tử protein) polyme (có nhiều phân tử protein) - Pentame (penton) có protome nằm đỉnh khối đa diện, hexame (hexon) tạo thành cạnh bề mặt hình tam giác.  - Capsid có khả chịu nhiệt, pH yếu tố ngoại cảnh nên có chức bảo vệ lõi acid nucleic  - Trên mặt capsid chứa thụ thể đặc hiệu, gai glicoprotein, giúp cho virus bám vào thụ thể bề mặt tế bào Đây kháng nguyên (KN) kích thích thể tạo đáp ứng miễn dịch (ĐƯMD).  - Vỏ capsid có kích thước cách xếp khác khiến cho virus có hình dạng khác Có thể chia ba loại cấu trúc: đối xứng xoắn, đối xứng hình khối cấu trúc phức tạp (Hình 1) Hình Kích thước hình thái số virus điển hình Theo Presscott L M et al , Microbiology 6th ed Intern Ed 2005 2.2.1 Cấu trúc đối xứng xoắn: Sở dĩ virus có cấu trúc capsome xếp theo chiều xoắn acid nucleic Tuỳ loại mà có chiều dài, đường kính chu kỳ lặp lại nucleocapsid khác Cấu trúc xoắn thường làm cho virus có dạng hình que hay hình sợi ví dụ virus đốm thuốc (MTV), dại (rhabdo), quai bị, sởi (paramyxo), cúm (orthomyxo) virus cúm nucleocapsid bao vỏ ngồi nên quan sát kính hiển virus điện tử thấy chúng có dạng cầu           2.2.2 Cấu trúc đối xứng dạng khối đa diện 20 mặt Hình phịng thí nghiệm  Robert M Bock Đại học University of Wisconsin-Madison Ở virus loại này, capsome xếp tạo vỏ capsid hình khối đa diện với 20 mặt tam giác đều, có 30 cạnh 12 đỉnh Đỉnh nơi gặp cạnh thuộc loại gồm virus adeno, reo, herpes picorna Gọi đối xứng so sánh xếp capsome theo trục Ví dụ đối xứng bậc 2, bậc 3, bậc 5, ta xoay với góc 1800 (bậc 2), 1200 (bậc 3) 720 (bậc 5) thấy cũ Các virus khác có số lượng capsome khác Virus lớn, số lượng capsome nhiều Dựa vào số lượng capsome cạnh tính tổng số capsome vỏ capsid theo công thức sau: N= 10(n-1)2+2 Trong N- tổng số capsome vỏ capsid, n-số capsome cạnh Hình A Sơ đồ virus hình que với cấu trúc đối xứng xoắn (virus khảm thuốc lá) Capsome xếp theo chiều xoắn acid nucleic B- Sơ đồ virus đa diện đơn giản Mỗi mặt tam giác Đỉnh cạnh hợp lại Mỗi cạnh chứa capsome C- Sự đối xứng hình đa diện thể quay theo trục bậc (1800), bậc (1200) bậc (720) Theo J Nicklin et al., Instant Notes in Microbiology, Bios Scientific Publisher, 1999   Trong nguồn tài liệu khác chi tiết thì: Có phần cấu trúc nên Phage T4: phần đầu , phần thân với sợi đuôi Phần đầu: Phần đầu bacteriophage T4 có trọng lượng khoảng 194 Mda, chiều dài khoảng 1150 Ǻ  chiều rộng khoảng 850 Ǻ  Phần đầu khối đa diện 20 mặt bao gồm 160 phân tử có chứa tiểu đơn vị Gp23( protein capsid chính), 11 phân tử có chứa tiểu đơn vị Gp24 (các protein góc) phân tử có 20 tiểu đơn vị Gp20 Trong suốt trình định hình phần đầu , protein nâng đỡ trải qua phân giải Gp21 amin protein gp23 , gp24, IPI, IPII, IPIII, gpalt phân cắt, protein gp22, gp21, gp67, gp68 tiêu hóa Khoảng cách trung tâm gp23 ~ 140Ǻ protein tạo thành vỏ khoảng 30-Ǻ bảo vệ acid nucleic Góc chiếm Gp24 chúng tương tác với phần viền Gp23 Một yếu tố cấu trúc capsid T4 loại protein nhỏ tên Soc Nó tạo lưới gần liên tục bề mặt gp23 Nó liên kết tiểu đơn vị Gp23, khơng thể liên kết quanh Gp24 khoảng Gp23 Gp24 Kết mạng lưới tạo Gp Soc bao quanh gp23, bỏ qua Gp24 Hầu phân tử Gp23 kết nối với protein Soc, ngoại trừ phân tử nằm gần với Gp24 Mặc dù chức Soc chưa xác định đầy đủ, coi ổn định thể thực khuẩn capsid chống lại biến tính nhiệt tiếp xúc với kiềm ,chất tẩy rửa, đó, có trách nhiệm bảo tồn sinh tồn thể thực khuẩn điều kiện không thuận lợi Gene (kDa) Kích thước (số lượng aminoacid) 21 18.5 ♦ 22 2.5 ♦ 23 24 67 68 Alt Học 48.7 46.0 3.9 15,7 75.9 39.1 IPI 8.5 IPII 9.9 IPIII 20.4 422 407 ♦ ♦ 682 376 ♦ ♦ ♦ Số Địa điểm lượng đầu trưởng thành ♦ Lõi ♦ Lõi, protein 930 vỏ,capsid 55 vỏ, đỉnh ♦ lõi ♦ lõi 40 lõi 155 vỏ, bên bề mặt ♦ lõi ♦ lõi ♦ lõi 10 Gene Kích (kDa) thước (số lượng aminoacid ) 19.7 176 63.7 575 74.4 660 119.2 1032 38.0 334 31.0 288 10 66.2 602 11 23.7 219 12 55.3 527 15 31.4 272 18 71.2 659 19 18.5 163 25 15.1 132 26 23.4 208 27 44.4 208 28 24.0 177 29 64.4 391 34 140.0 1289 35 30.0 372 36 23.0 221 37 109.0 1026 48 39.7 177 53 23.0 196 54 35.0 590 Frd 21.7 320 Td 33.1 364 wac 51.9 89 Số mẫu tồn 12 12 18 18 18 3* 144 144 n.d n.d 3* 1* 3* 3* 6 6 3* Vị trí ống thân Trục trung tâm Phần nêm bao ống thân Phần nêm bao ống thân Phần nêm bao ống thân phần đầu Mấu ghim Mấu ghim Mặt tiếp xúc (Tấm nền) Thân Bao đuôi(thân) Ống (thân) Lớp nêm mặt tiếp xúc Chaperone Trục trung tâm Trục trung tâm Ống Phần đuôi gần Phần cổ Phần đuôi xa Phần đuôi xa Lớp nêm mặt tiếp xúc Lớp nêm mặt tiếp xúc Lớp nêm mặt tiếp xúc Lớp nêm mặt tiếp xúc Trục trung tâm Phần liên kết đầu thân n.d : Không xác định *: số mẫu protein cho sợi đi. Có sáu sợi virion T4 13 bám vào ,bao đuôi xoắn lại Sự xếp gene nhiễm sắc thể phage Tần số tái tổ hợp sử dụng để xác định khoảng cách đồ Eukaryote Các thí nghiệm lập đồ cho thấy đột biến T4 lập đồ thành cụm riêng biệt Cả ba cụm có liên kết với cụm khác George Streisinger cộng (1964) chứng minh đồ di truyền phage T4 có dạng vịng trịn Trong phép lai, lập ba đến bốn điểm đánh dấu ( MARKER) di truyền với nhóm tiến hành qua toàn genome T4 Nhiều gene khác xác định và lập bản  đồ  đầy đủ  trên  phân tử vòng  tròn   Những vùng vòng tròn bên cụm điểm đánh dấu T4 xác định lập đồ di truyền Vịng ngồi có mặt nhiều đánh dấu lớn tạo thành tồn vịng trịn đồ di truyền Bản đồ di truyền phage T4 cho thấy gene phage T4 tạo cụm mở rộng theo chức chúng Chẳng hạn có cụm lớn gene dùng  cho chép DNA  vị trí phần tư bên phía phải có cụm gene tổng hợp cấu phần tạo nên đầu phage phía vịng tròn Phân tử DNA phage T4 phân tử sợi đơn dạng thẳng, đầu tận  cùng  của  DNA  phage  T4  được  nhân  lên  hoặc  lặp  đoạn  ở  đầu  cuối (terminal redundant) Do vậy,  phân tử DNA có kích thước tăng thêm 2% Khi DNA chép tế bào, tái tổ hợp phần đầu tận gen T4 với trình tự tương đồng gen T4 khác, kết  quả  tạo  ra  sản  phẩm  DNA  có  kích  thước  lớn  hơn  khả  năng  chứa  phần  đầu.  Những  phân  tử  chứa  lặp  đoạn  được  tạo  thành  vì  sự  tái  tổ  hợp gen phage T4 xảy thường xun, trung bình có khoảng 20%sự kiện tái tổ hợp xảy nhiễm sắc thể Khi phân tử DNA gói vào  phần  đầu,  nó  được  cắt  bằng  enzyme  chỉ  còn  chứa  khoảng  102%  của  chiều dài gen phage T4, có chứa đoạn lặp lại phần đầu 14 Bản đồ di truyền T4 với marker Lập đồ cấu trúc tinh vi vùng rII phage T4 Các nghiên cứu chi tiết đột biến rII phage T4 làm sáng tỏ cấu trúc gene Phage T4 dạng hoang dại r+ có khả nhiễm đồng thời hai nòi   E.coliB K Các đột biến rII nhiễm nịi B khơng nhiễm  nịi  K.  Seymour  Benzer  (1955)  đã  nhận  được  2400  đột  biến  rII  có nguồn gốc độc lập với Ông cho lai đột biến với vào xuất dạng tái tổ hợp hoang dại r+ mà lập đồ điểm đột biến Mỗi  đột  biến  có  thể  tái  tổ  hợp  với  các  đột  biến  khác.  Đột  biến  đoạn ngăn cản tái tổ hợp với hai nhiều đột biến điểm vị trí khác gene Mỗi đoạn làm phần gene phage bao gồm vùng rII Sử dụng đột biến đoạn phương pháp đơn giản để lập đồ hàng ngàn đột biến Bản đồ 15 đoạn (Deletion mapping) dựa có khơng có dạng tái tổ hợp Trong phép lai đột biến điểm chưa biết đột biến đoạn, xuất dạng hoang dại cho thấy đột biến điểm nằm vùng đoạn Ngược lại, đột biến điểm xuất vùng đoạn, không xuất dạng tái tổ hợp kiểu hoang dại hệ sau Đột biến đoạn sử dụng để chia locus rII bacteriophage T4 thành vùng 47 tiểu vùng nhỏ Nhiều phép lai thực để lập đồ đột biến chi tiết gene rII Khoảng cách từ A1 đến A6 B trình bày hình 8.4 Một đột biến đặc biệt kiểm tra định vị vùng A4 Đột biến không tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại phép lai với đột biến đoạn lớn r1272, r1241, rJ3 rPT1 tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại phép lai  với  rPB242,  rA105  và  r638.  Các  đột  biến  được  tạo  ra  bởi  cùng  khuôn, kết lai với đột biến đoạn lớn xếp vào vùng A4 Bản đồ di truyền vùng A4 tạo đột biến đoạn trình bày phần hình Xác định tiểu vùng A4 (từ a qua g) 16 Xác định vùng rII liên quan với marker di truyền dạng thẳng đồ di truyền phage T4 Ví dụ, đột biến vùng A4 kết tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại với đột biến đoạn r1368, lại thực với đột biến r221 vào tiểu vùng c Ở mức độ chi tiết hơn, đột biến tiểu vùng xếp nhờ lai chúng với Ở phage T4, điểm đột biến gần nhau, tách nhờ tái tổ hợp 1% tái tổ hợp tương ứng với khoảng cách khoảng 100 bp Vì vậy, hai đột biến khơng thể tái tổ hợp với xếp vào vị trí gene.  Bản  đồ  di  truyền  cho  số  lớn  các  đột  biến  rII  có  nguồn  gốc  độc  lập mơ tả hình Nghiên cứu đột biến vùng rII lập đồ di truyền có vai trị quan trọng, qua rút kết luận sau: + Sự  trao  đổi di truyền  có thể  xảy trong  gene có  thể giữa  nucleotide gần + Các đột biến không tạo tần số với tất điểm gene, chúng phân bố không Chẳng hạn, 2400 đột biến rII xác định 304 điểm Một điểm có đến 474 đột biến Nhũng điểm có tần số đột biến cao gọi điểm nóng (hotspot mutation) Ở điểm khác, đột biến phục hồi lần vài lần 17 Bản đồ di truyền locus rII phage T4 Kết phân tích vùng rII quan trọng, giúp cho phân biết 3  khái  niệm  gene.  Phổ  biến  nhất,  gene liên  quan với  một  đơn vị chức Điều tương ứng với đoạn DNA mã hóa cho phân tử protein.  Benzer  đưa  ra  thuật  ngữ  cistron  để  chỉ  chức  năng  này,  thuật  ngữ cistron sử dụng Đơn vị chức xác định qua thử  nghiệm  bổ  sung  (complementation  test),  xác  định  được  2  đột  biến  có allele với khơng Trước thí nghiệm ơng rII coi locus Thí nghiệm cho thấy đột biến xếp thành hai nhóm rIIA rIIB Lai đột biến rIIA x rIIB có r+, lai rIIA ´ rIIA rIIB ´ rIIB thu kiểu hình đột biến r Ngồi nghĩa đơn vị chức năng, gene đơn vị tái tổ hợp (recon) đơn vị đột biến (muton) Cả hai đơn vị này,  tương ứng với nucleotide riêng lẽ gene CHU TRÌNH TIỀM TAN Ở PHAGE T4 Chu  trình  tiềm  tan  bắt  đầu  khi  phân  tử  DNA  của  phage  gắn  vào nhiễm sắc thể vi khuẩn  tiến hành chép phần nhiễm sắc thể vi khuẩn Các hạt phage không tạo thành Phân tử DNA phage gắn vào gen vi khuẩn gọi prophage, tế bào vi khuẩn sống  sót  được  gọi  là  tế  bào  tiềm  tan  (lysogen).  18 Phân  tử  DNA  của  phage   có  đầu  các  đầu  cuối  chứa  12  nucleotide khơng kết cặp, mà dạng sợi đơn tạo đầu dính  (cohesive end) bổ sung Khi vào tế bào, đầu cuối bổ sung gắn lại tạo phân tử vòng tròn Sự tạo vịng trịn xảy sớm chu trình tan chu trình tiềm tan Có khoảng 75% tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage, phân tử DNA vòng trịn chép chu trình tan xảy tiếp  theo Còn khoảng 25%  tế bào bị nhiễm, phân tử DNA vòng tròn phage l phân tử DNA vòng tròn E colitương tác xảy tái  tổ hợp điểm chuyên  biệt (site-specific recombination)  DNA phage gắn vào nhiễm sắc thể vi khuẩn Vị trí tái tổ hợp điểm chuyên biệt DNA vi khuẩn phage được  gọi  là  điểm  gắn  vào  của  vi  khuẩn  và  phage  (bacterial  and  phage attachment sites) Mỗi điểm gắn có chứa đoạn: đoạn trung tâm có trình tự nucleotide vị trí gắn vùng mà tái tổ hợp thực xảy Điểm gắn vào phage ký hiệu POP’ (P: phage) điểm gắn vào vi khuẩn biểu diễn BOB’ (B: bacteria) So sánh đồ di truyền phage prophage POP’ nằm gần vùng trung tâm phân tử DNA dạng thẳng Một protein phage, integrase, xúc tác cho tái tổ hợp điểm chuyên biệt Enzyme integrase nhận điểm gắn vào phage vi khuẩn, gây trao đổi vật lý, kết phân tử DNA phage gắn vào phân tử DNA vi khuẩn Kết tái tổ hợp làm đồ di truyền của  prophage  khác  với  bản  đồ  di  truyền  của  phage.  Bản  đồ  di  truyền prophage chuyển đổi vòng tròn đồ di truyền phage tự Prophage chèn vào nhiễm sắc thể E coli gene gal gene bio Sự chèn vào phage làm tăng khoảng cách gene gal gene bio 19 Khi tế bào tiềm tan, gene phage trở thành phần nhiễm sắc thể  của  vi  khuẩn  vì  vậy  có  thể  làm  kiểu  hình  của  vi  khuẩn  bị  thay  đổi Nhưng hầu hết gene phage prophage giữ trạng thái bất hoạt nhờ protein repressor – sản phẩm gene phage Protein repressor bắt đầu tổng hợp nhờ nhiễm vào phage tiếp tục tổng hợp  nhờ  prophage.  Gene  mã  hóa  cho  repressor  thường  chỉ  là  gene  prophage biểu chu trình tiềm tan Nếu tế bào tiềm tan bị nhiễm phage giống với prophage, có mặt repressor prophage ngăn cản  sự  biểu  hiện  các  gene  của  phage  nhiễm  vào.  Tính  kháng  với  phage giống với prophage gọi tính miễn nhiễm (immunity) Đây tiêu  chuẩn  để  xác  định  tế  bào  vi  khuẩn  chứa  phage  đặc  biệt.  Chẳng  hạn phage l không tạo đốm vi khuẩn chứa prophage lamda Trong tế bào tiềm tan, chép khơng giải phóng phage Tuy nhiên, prophage đơi trở nên có hoạt tính, trải qua chu trình tan, tạo số lượng lớn phage hệ sau Hiện tượng gọi cảm ứng prophage (prophage induction),  nó  được  bắt  đầu  bằng  sự  hư  hại  DNA  của  vi  khuẩn.  Đơi  prophage tách khỏi DNA vi khuẩn cách ngẫu nhiên thường gây tác nhân môi trường hóa chất chiếu xạ Khả bị cảm ứng thuận lợi cho phage DNA phage khỏi tế bào bị hư hại Cơ chế sinh hóa cảm ứng phức tạp thoát phage xảy dễ dàng Sự cắt phage tái tổ hợp điểm chuyên biệt khác, ngược với quá  trình  gắn vào.  Sự  cắt  này  yêu  cầu  enzyme  của  phage,  integrase thêm protein phage excisionase Nghiên cứu di truyền gắn vật lý cho thấy  escisionase  gắn  với  integrase  và  sau  đó  nhận  ra  điểm  gắn  vào  prophage BOP’ POB’, gắn với điểm Integrase cắt trình tự O tạo lại BOB’ POP’ Quá trình tách diễn ngược lại với gắn vào 20 ... gen phage T4, có chứa đoạn lặp lại phần đầu 14 Bản đồ di truyền T4 với marker Lập đồ cấu trúc tinh vi vùng rII phage T4 Các nghiên cứu chi tiết đột biến rII phage T4 làm sáng tỏ cấu trúc gene Phage. .. định 304 điểm Một điểm có đến 474 đột biến Nhũng điểm có tần số đột biến cao gọi điểm nóng (hotspot mutation) Ở điểm khác, đột biến phục hồi lần vài lần 17 Bản đồ di truyền locus rII phage T4 Kết... trí gắn vùng mà tái tổ hợp thực xảy Điểm gắn vào phage ký hiệu POP’ (P: phage) điểm gắn vào vi khuẩn biểu diễn BOB’ (B: bacteria) So sánh đồ di truyền phage prophage POP’ nằm gần vùng trung tâm