T�P CHÍ Y D��C H�C C�N TH� � S� 26/2020 142 kh�p d�ng th�p t�i B�nh vi�n Ch� R�y", N�i khoa (Chuyên �� H�i ngh� khoa h�c toàn qu�c l�n th� VIII), (4), tr 12 18 10 Ph�m Th��ng V� (2015), B��c ��u �ánh[.]
T P CHÍ Y D C H C C N TH S 26/2020 kh p d ng th p t i B nh vi n Ch R y", N i khoa (Chuyên H i ngh khoa h c toàn qu c l n th VIII), (4), tr 12-18 10 Ph m Th ng V (2015), B c u ánh giá hi u qu tính an tồn c a Tcilizumab (Actemra) ph i h p v i Methotrexate i u tr viêm kh p d ng th p, Lu n v n th c s Y h c, Tr ng i h c Y Hà N i 11 Ankoor Shah a and E William St Clair (2012), "Rheumatoid Arthritis", Harrison' s Principles Of Internal Medicine, Mc Graw Hill Medical, pp 2738-2751 12 Ankooshah a, William E., and Clair St (2017), "Rheumatoid arthritis", Harrison's Rheumatology, Mc Graw Hill Education, pp 100-116 13 Florian MP Meier f, Marc Frerix, and Walter Hermann (2013), "Current immunotherapy in rheumatoid arthritis", Future Medicine, (9), pp 955–974 14 Hospital For Special Surgery Ho (2006), "Rheumatoid Arthritis", Manual of Rheumatology and Outpatient Orthopedic Disorder, Lippincott Williams & Wilkins, pp 206-222 (Ngày nh n bài:02/10/2019 - Ngày t ng bài:11/4/2020) T I U HÓA QUY TRÌNH T NG H P T P B VÀ E C A ALLOPURINOL B NG MƠ HÌNH BOX-BEHNKEN L Thi n Phúc1*, Cao Th Kim Tuy n1, Nguy n M Hân1, Nguy n M nh Quân1 Tr ng Ng c Tuy n2, Tr n Vi t Hùng3, Nguy n c Tu n2 Tr ng i h c Y D c C n Th Tr ng i h c Y D c TPHCM Vi n Ki m Nghi m Thu c TP.HCM *Email: luthienphucpharma@yahoo.com.vn TÓM T T t v n : T ng h p t p B E c a allopurinol có ý ngh a quan tr ng ngành ki m nghi m thu c Tuy nhiên hi n t i ch a có cơng trình ngồi n c nghiên c u v t i u hóa t ng h p t p B E c a allopurinol Các quy trình t ng h p hi n t i hi u su t ch a cao nên vi c áp d ng vào th c t h n ch Nghiên c u kh o sát t i u hóa i u ki n ph n ng trình t ng h p t p B E nh m t ng hi u su t t ng h p b ng mơ hình Box-Behnken, ti n hành ki m tra tinh t s n ph m b ng k thu t HPLC–DAD h ng n vi c thi t l p ch t chu n i chi u M c tiêu nghiên c u: Kh o sát t i u hóa quy trình t ng h p t p B E c a allopurinol i t ng ph ng pháp nghiên c u: t p B E c a allopurinol; ph ng pháp: t i u hóa quy trình t ng h p t p B E c a allopurinol b ng mơ hình Box-Behnken K t qu : Các y u t nh h ng n hi u su t t ng h p s mol ch t tham gia ph n ng, nhi t th i gian, ng th i c nh y u t l i Xác nh i u ki n t i u hóa b ng mơ hình BoxBehnken; t p B: t l mol t p A/formamid (1/35); s mol formamid (0,1 mol), nhi t (95oC), th i gian (60 phút) cho hi u su t cao nh t; t p E: t l mol t p D/acid formic (23/1891), th tích acid formic (10 mL), nhi t (90oC), th i gian (4 gi ) cho hi u su t cao nh t K t lu n: Thi t k thí nghi m theo mơ hình Box-Behnken t i u hóa b ng ph n m m JMP 13.0 giúp ánh giá c nh h ng c a y u t n hi u su t t ng h p d oán c i u ki n cho ph n ng t i u T khóa: Allopurinol; Box-Behnken; t p B, t p E 142 T P CHÍ Y D C H C C N TH S 26/2020 ABSTRACT BOX-BEHNKEN DESIGN FOR THE OPTIMIZATION OF SYNTHESIS IMPURITIES B AND E OF ALLOPURINOL Lu Thien Phuc1, Cao Thi Kim Tuyen 1, Nguyen My Han1, Nguyen Manh Quan1 Truong Ngoc Tuyen2, Tran Viet Hung3, Nguyen uc Tuan2 Can Tho University of Medicine and Pharmacy University of Medicine and Pharmacy at HCMC Institute of Drug Quality Control Ho Chi Minh city Background: Synthetic impurities B and E of allopurinol are important in the field of drug quality control However, at present, there are no domestic and foreign studies on the optimization of impurities B and E of allopurinol The current synthesis processes are not high efficiency, so the application in practice is limited Survey research and optimize reaction parameters in the impurities B and E synthesis process to increase synthesis efficiency, conduct product purity testing by HPLC-DAD technique towards establishing reference substances Survey research and optimize reaction parameters in the synthesis of impurities B and E to increase synthesis efficiency by Box-Behnken model, conduct product purity testing by HPLC-DAD aims to establish a reference substance Objectives: Survey and optimize the impurities B and E synthesis process of allopurinol Materials and methods: impurities B and E of allopurinol; Method: Optimizing the impurities B and E synthesis process of allopurinol by Box-Behnken design Results: The main factors affecting the synthesis efficiency are the number of moles of substances involved in the reaction, the temperature and the time, and the remaining factors are fixed Determining optimal parameters by Box-Behnken design; impurity B: the mole ratio A/formamide (1/35), number of moles of formamide (0.1 mol), temperature (95oC), time (60 minutes) for highest efficiency; impurity E: the mole ratio D/ formic acid: 23/1891, volume of formic acid (10 mL), temperature (90°C), time (4 hours) for the highest efficiency Conclusions: Experimental design based on BoxBehnken design and optimized by JMP 13.0 software help assess the impact of factors on the yield synthesis and predict the optimal reaction parameters Keywords: Allopurinol, Box-Behnken design, impurity B, impurity E I TV N Theo chuyên lu n d c i n Vi t Nam V (D VN V) [1] d c i n tiên ti n th gi i khác nh d c i n Anh 2018 (BP 2018) [4] d c i n M 41 (USP 41) [10] u yêu c u ki m nghi m t p ch t liên quan B E, có kh n ng gây c c th ng i gen HLA-B c ng nh gây h i ch ng Steven Johnson, h i ch ng tiêu th ng bì nhi m c ph n ng nghiêm tr ng da [5], [8] Tuy nhiên ch a có cơng trình th gi i nghiên c u v t i u hóa t ng h p t p B E c a allopurinol Các quy trình t ng h p hi n t i hi u su t tinh t ch a cao nên vi c áp d ng vào th c t h n ch , ch a áp ng c ch t l ng nhu c u s d ng t p B E công tác m b o ch t l ng thu c Nghiên c u t i u hóa quy trình t ng h p t p B E c a allopurinol c th c hi n nh m t ng hi u su t t ng h p b ng mơ hình Box-Behnken, ng th i ánh giá tinh t c a s n ph m t ng h p b ng k thu t HPLC–DAD nh m h ng n vi c thi t l p ch t i chi u Vì v y th c hi n nghiên c u v i m c tiêu “Kh o sát t i u hóa quy trình t ng h p t p B E c a allopurinol” 143 T P CHÍ Y D II IT NG VÀ PH C H C C N TH S 26/2020 NG PHÁP NGHIÊN C U 2.1 i t ng nghiên c u T p ch t 5-(formylamino)-1H-pyrazol-4- carboxamid (t p B) T p ch t ethyl 5-(formylamino)-1H-pyrazol-4-carboxylat (t p E) Hoá ch t dung môi: Methanol (Trung Qu c), Ethanol (Trung Qu c), Acid formic (Merck), Formamid (Fisher) t tiêu chu n tinh t hoá h c Acetonitril (Merck), Acid phosphoric (Merck), Methanol (Merck) t tiêu chu n dùng cho s c ký l ng B n m ng silica gel GF254 (Merck) 2.2 Ph ng pháp nghiên c u 2.2.1 Kh o sát tác nhân nh h ng n trình t ng h p t p B E [2],[3], [9] T pA T pB T pD T pE S 1: Quy trình t ng h p t p B t p E Nguyên t c: Kh o sát y u t tham gia ph n ng t ng h p, ánh giá nh ng y u t nh h ng n hi u su t, c nh y u t l i Ch n y u t quy trình t ng h p cho hi u su t ph n ng cao nh t a vào mơ hình Box-Behnken 2.2.2 T i u hóa quy trình t ng h p t p B E c a allopurinol b ng mơ hình Box-Behnken [6] ng d ng ph ng pháp b m t áp ng mơ hình Box-Behnken ti n hành l a ch n bi n nh h ng t i hi u su t t ng h p Thi t k thí nghi m ti n hành th c hi n thí nghi m theo ma tr n (15 ph n ng) c a mơ hình Box-Behnken (ph n m m JMP 13.0) T s li u th c nghi m, ph n m m x lý th ng kê d li u thu c thông qua s t ng thích c a hàm a th c: Y = b + a1X1 + a2X2 + a3X3 + a4X1X2 + a5X1X3 + a6X2X3+ a7X12 + a8X22 + a9X32 144 T P CHÍ Y D C H C C N TH S 26/2020 V i Y hi u su t ph n ng X1, X2, X3 tác nhân nh h ng n hi u su t ph n ng Ch tiêu ánh giá: Giá tr Y cao nh t có l p l i Xác nh h s t ng quan nh h ng c a y u t n hi u su t c a s n ph m t ng h p t k t qu c a ph n m m Box-Behnken.T k t qu ph n m m d báo, ti n hành ph n ng t ng h p i u ki n t i u ki m tra l p l i 2.2.3 Xác nh tinh t s n ph m t ng h p b ng k thu t HPLC-DAD T p B t p E tinh t c a t p B c xác nh b ng ph ng pháp HPLC quy v 100% di n tích pic [7] i u ki n s c ký: c t Phenomenex Gemini NX C18 (150 x 4,6 mm; µm), t p B: pha ng ACN-n c acid phosphoric pH 2,5 (2:98 tt/tt); t p E: pha ng ACN-n c acid phosphoric pH (10:90 tt/tt) , t c dòng ml/phút, u dị DAD v i b c sóng phát hi n 220 nm, th tích tiêm m u 10 µL, nhi t c t: 250C M u th có n ng 500 µg/mL III K T QU NGHIÊN C U 3.1 K t qu kh o sát tác nhân nh h ng n trình t ng h p t p B E T pB T l mol formamid:acid formic 100:1 th tích n c c t 30 mL cho hi u su t cao nh t Hi u su t không t ng thêm t l mol formamid:acid formic l ng n c t ng Nguyên nhân acid formic ch t xúc tác n c ch óng vai trị dung môi D a vào b n ch t ph n ng, y u t s c nh quy trình t ng h p t p B là: t l mol formamid/acid formic 100:1 th tích n c 30 mL v i l ng t p A kh o sát 0,5 g (2,85 mmol) Kh o sát s mol formamid (mol) S mol formamid kh o sát l n l t 0,05; 0,075; 0,1, 0,125 mol Nh n xét: i u ki n th i gian ph n ng t = gi , nhi t 95 oC K t qu cho th y s mol formamid 0,075 mol cho hi u su t ph n ng cao nh t Khi t ng s mol ph n ng hi u su t khơng t ng thêm Kh o sát nhi t ph n ng (oC) Nhi t ph n ng kh o sát l n l t 75; 85; 95; 105 oC Nh n xét: i u ki n th i gian ph n ng t = gi , s mol formamid = 0,075 mol K t qu cho th y nhi t ph n ng 85 oC cho hi u su t ph n ng cao nh t Khi t ng nhi t ph n ng hi u su t không t ng Kh o sát th i gian ph n ng (phút) Th i gian ph n ng kh o sát l n l t 60; 90; 120; 150 phút Nh n xét: i u ki n nhi t ph n ng 85 oC, s mol formamid = 0,075 mol K t qu cho th y th i gian ph n ng 90 phút cho hi u su t ph n ng cao nh t Khi t ng th i ph n ng hi u su t không t ng K t lu n: Các y u t c n a vào mơ hình Box - Behnken: s mol formamid, nhi t , th i gian 145 T P CHÍ Y D C H C C N TH S 26/2020 75 65 55 45 S N C T Hi u su t ph n ng (%) Hình 1: Kh o sát s mol formamid (mol), nhi t ph n ng (oC), th i gian ph n ng (phút) t ng h p t p B T pE Th tích cloroform 10 mL cho hi u su t cao nh t Hi u su t không t ng thêm th tích cloroform t ng D a vào b n ch t ph n ng, y u t s c nh quy trình t ng h p t p E th tích cloroform l ng t p D kh o sát 0,5 g (3,23 mmol) Kh o sát th tích acid formic (mL) Th tích kh o sát l n l t 0,5; 0,75; 1; 1,25 mL Nh n xét: i u ki n th i gian ph n ng t = gi , nhi t 90 oC K t qu cho th y th tích 0,75 mL cho hi u su t ph n ng cao nh t Khi th tích ph n ng t ng hi u su t không t ng Kh o sát nhi t ph n ng (oC) Nhi t ph n ng kh o sát l n l t 70; 80; 90; 100 oC Nh n xét: i u ki n th i gian ph n ng t = gi , th tích acid formic = 0,75 mL K t qu cho th y nhi t ph n ng 80 oC cho hi u su t ph n ng cao nh t Khi t ng nhi t ph n ng hi u su t khơng t ng Kh o sát th i gian ph n ng (phút) Th i gian ph n ng kh o sát l n l t 4; 5; 6; gi Nh n xét: i u ki n nhi t ph n ng 80 oC, th tích acid formic = 0,75 mL K t qu cho th y th i gian ph n ng gi cho hi u su t ph n ng cao nh t Khi t ng th i ph n ng hi u su t khơng t ng K t lu n: Các y u t c n a vào mơ hình Box - Behnken: th tích acid formic, nhi t , th i gian 80 60 40 20 T N C T Hình 2: Th tích acid formic (mL), nhi t ph n ng (oC), th i gian ph n ng (gi ) t ng h pt pE 146 T P CHÍ Y D C H C C N TH S 26/2020 3.2 T i u hóa quy trình t ng h p t p B E c a allopurinol b ng mơ hình BoxBehnken D a vào k t qu kh o sát y u t nh h ng n hi u su t ph n ng trên, quy trình t ng h p t p B E ã c t i u hoá b ng ph n m m JMP 13.0 v i mơ hình Box-Behnken Ti n hành mã hố y u t kh o sát b trí thí nghi m theo B ng B ng T pB Các y u t bi n thiên kh o sát: s mol formamid (X1), nhi t (X2), th i gian (X3) B ng Mã hóa y u t kh o sát quy trình t ng h p t p B Y u t kh o sát Mã hóa M cd i M c gi a M c (-1) (0) (+1) Formamid (mol) X1 0,05 0,075 0,1 Nhi t (oC) X2 75 85 95 Th i gian (phút) X3 60 90 120 Ma tr n th c nghi m: ch n mơ hình Box – Behnken th c hi n t i u hóa Ti n hành thí nghi m nh B ng 1, m i ph n ng th c hi n l n, l y k t qu trung bình, sau ó nh p d li u thu c vào ph n m m JMP 13.0 Hình minh ho m i t ng tác gi a y u t kh o sát lên hi u su t ph n ng Hình 3: B m t áp ng hi u su t tồn quy trình theo y u t kh o sát Ph ng trình b m t áp ng v i hi u su t c thi t l p nh sau Y = 61,8 + 1,05X1 – 0,6X3 + 1,35X1X2 – 1,9X1X3 + 3,075X12 + 5,275X22 + 3,975X32 Hình 4: Hi u su t d ốn, ý ngh a c a ph ng trình h s ki m ch ng quy trình t ng h p t p B t i u, ti n hành th c nghi m l n v i i u ki n d ốn B ng trình bày hi u su t ph n ng t ng h p t p B 147 T P CHÍ Y D C H C C N TH S 26/2020 B ng Hi u su t ph n ng t ng h p t p B theo i u ki n d oán n S mol Nhi t Th i Hi u su t Kh i l ng s n ph m (g) formamid gian 0,1 (mmol) 79,92% 0,354 0,1 (mmol) 78,34% 0,347 95oC 60 phút 0,1 (mmol) 76,54% 0,339 Trung bình 78,20% 0,347 Hi u su t d oán 79,35% hi u su t th c t 78,2% khác khơng có ý ngh a th ng kê (p=0,832>0,05) T pE Các y u t bi n thiên kh o sát: s mL acid formic (X1), nhi t (X2), th i gian (X3) B ng Mã hóa y u t kh o sát quy trình t ng h p t p E Y u t kh o sát Mã hóa M cd i M c gi a M c (-1) (0) (+1) Th tích X1 0,5 0,75 acid formic (mL) Nhi t (oC) X2 70 80 90 Th i gian (gi ) X3 Ma tr n th c nghi m: ch n mơ hình Box – Behnken th c hi n t i u hóa Ti n hành thí nghi m nh B ng 3, m i ph n ng th c hi n l n, l y k t qu trung bình, sau ó nh p d li u thu c vào ph n m m JMP 13.0 Hình minh ho m i t ng tác gi a y u t kh o sát lên hi u su t ph n ng Hình 5: B m t áp ng hi u su t toàn quy trình theo y u t kh o sát Ph ng trình b m t áp ng v i hi u su t c thi t l p nh sau: Y = 48,5 + 1,1X1 + 1,35X1X2 –2X1X3 + 3,125X12 + 5,225X22 + 4,025X32 Hình 6: Hi u su t d oán, ý ngh a c a ph ng trình h s ki m ch ng quy trình t ng h p t p E t i u, ti n hành th c nghi m l n v i i u ki n d oán B ng trình bày hi u su t ph n ng t ng h p t p E 148 T P CHÍ Y D C H C C N TH S 26/2020 B ng Hi u su t ph n ng t ng h p t p E theo i u ki n d n Th tích acid formic (mL) (mL) (mL) Nhi t Th i gian 90oC gi Trung bình Hi u su t oán Kh i l 66,12% 64,81% 63,03% 64,66% ng s n ph m (g) 0,3901 0,3824 0,3717 0,3814 Hi u su t d oán 66,3% hi u su t th c t 64,66% khác ý ngh a th ng kê (p =0,207>0,05) 3.3 K t qu xác nh tinh t s n ph m t ng h p b ng HPLC-DAD ng d ng quy trình xác nh tinh t b ng HPLC-DAD ã c th m nh K t qu tinh t t p B t 99,32%, t p E t 99,87% theo ph ng pháp quy v 100% di n tích pic 2000 2000 DAD-CH1 220 nm 210220_tapB_lan1_ACN_H3PO4_pH2.5_f1 Name T pB mAU T pB 1000 1000 0 10 Minutes Hình 7: S c kí 1000 12 14 ph DAD ki m tra tinh t t p B 1000 Spectrum Max Plot 240220_E15_ACN.AP_10.90_F1 Name T pE 500 T pE mAU 500 0 10 15 Minutes 20 Hình 8: S c kí 25 30 ph DAD ki m tra tinh t t p E IV BÀN LU N Hi u su t quy trình t ng h p t p B E, nh h ng l n b i y u t : T l ch t tham gia ph n ng, nhi t th i gian ph n ng S dùng mô hình Box-Behnken tìm i u ki n t i u, t ó th c nghi m l i nh m xác nh i u ki n cho hi u su t ph n ng cao nh t V i k t qu nghiên c u ã trình bày cho th y nhóm nghiên c u ã t ng hi u su t t p B thành công so v i nghiên c u tr c [2], [3]: t p B t ban u 71,12% [3] t ng lên 78,20%, t p E t ban u 52,9% [2] t ng lên 64,66% K t qu th c nghi m l i t mơ hình Box-Behnken cho th y phù h p v i d oán, khác bi t khơng có ý ngh a th ng kê v i p > 0,05 V K T LU N 149 T P CHÍ Y D C H C C N TH S 26/2020 T p B E c t ng h p t t p A D c a allopurinol T ng h p i u ki n t i u s mol ph n ng, nhi t , th i gian cho hi u su t ph n ng cao nh t t p B t 78,20%, t p E t 64,66% v i t ng kh i l ng 900 mg m i t p tinh t cao (trên 99%) HPLC-DAD S n ph m t ng h p i u ki n thi t l p ch t chu n i chi u TÀI LI U THAM KH O B Y t (2018), D c i n Vi t Nam V, Nhà xu t b n Y h c, Hà N i, tr 55-58 Anh D ng (2019), T ng h p t p ch t liên quan E (ethyl 5-formylamino-1h-pyrazol-4carboxylat) c a Allopurinol, Khóa lu n t t nghi p D c s i h c, i h c Y D c C n Th Nguy n Th Thanh Tuy n (2019), Nghiên c u t ng h p t p ch t liên quan B (5(formylamino)-1h-pyrazol-4-carboxamid) c a Allopurinol, Khóa lu n t t nghi p D c s i h c, Tr ng i H c Y D c C n Th British Pharmacopoeia (2018), Software Debabrata Sanyal, Jitendra Verdia, Narendra Mangal Joshi (2015), "Gentoxic impurities in active pharmaceutical ingredients"; European Journal of Pharmaceutical and Medical Research, vol 2, p 973-989 Ferreira, S L C., Bruns, R E., Ferreira, H S., Matos, G D., David, J Met al(2007),"Box-Behnken design: An alternative for the optimization of analytical methods"; Analytica chimica acta, vol 597, p 179-86 Guideline I.H.T (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology Q2 (R1), International conference on harmonization, Geneva, Switzerland Osabe, M., Tohkin, M., & Hirayama, N (2016), "In silico Analysis of Interactions between HLA-B* 58: 01 and Allopurinol-related Compounds"; Chem-Bio Informatics Journal, vol 16, p 1-4 Tao Changyuan, Zheng Xixia, Liu Zuohua, Sun Dagui (2011), "Microwave assisted synthesis of new substituted pyrazole derivatives"; Huaxue Shiji, vol 33(2); p 164-166 10 United States Pharmacopeia 41 (2018), USP Monographs: Allopurinol, CD-ROMs (Ngày nh n bài: 18/03/2020 - Ngày t ng bài:11/4/2020) PHÂN TÍCH S B THÀNH PH N HÓA H C VÀ KH O SÁT HO T TÍNH CH NG OXY HĨA IN VITRO C A M T S GI NG NHO (VITIS VINIFERA) T I NINH THU N, VI T NAM Tr n Trung Tr nh, Võ Th Bích Ng c, Lý H ng H ng H * i H c Qu c T H ng Bàng * Email: halhh@hiu.vn TÓM T T t v n : Nho (Vitis vinifera L Vitaceae) c ch ng minh có tác d ng ch ng oxy hóa v i nhi u l i ích tim m ch, kháng khu n, nâng cao h th ng mi n d ch Nghiên c u v tác d ng d c lý c a nho tr ng t i Vi t Nam h n ch M c tiêu: Phân tích s b thành ph n hóa h c, nh l ng hàm l ng polyphenol toàn ph n, kh o sát ho t tính ch ng oxy hóa in vitro c a m t s gi ng nho t i Ninh Thu n i t ng ph ng pháp nghiên c u: D ch ép qu gi ng NH.01.48 (nho NH); Red Cardinal (nho Red) thu t i Ninh Thu n c phân tích thành ph n hóa th c v t theo ph ng pháp Ciuley c i ti n; nh l ng hàm l ng polyphenol b ng ph ng pháp Folin – Ciocalteu; kh o sát ho t tính ch ng oxy hóa b ng ph ng pháp DPPH K t qu : Thành 150 ... vào mơ h? ?nh Box- Behnken 2.2.2 T i u h? ?a quy trình t ng h p t p B E c a allopurinol b ng mô h? ?nh Box- Behnken [6] ng d ng ph ng pháp b m t áp ng mơ h? ?nh Box- Behnken ti n h? ?nh l a ch n bi n nh h ng... allopurinol by Box- Behnken design Results: The main factors affecting the synthesis efficiency are the number of moles of substances involved in the reaction, the temperature and the time, and the remaining... the synthesis of impurities B and E to increase synthesis efficiency by Box- Behnken model, conduct product purity testing by HPLC-DAD aims to establish a reference substance Objectives: Survey