BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN HỒNG SƠN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ, ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHÔ HÀNH ĐEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2023 BỘ GIÁO[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN HỒNG SƠN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ, ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHÔ HÀNH ĐEN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2023 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN HỒNG SƠN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ, ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHÔ HÀNH ĐEN Chuyên ngành: Công nghệ dược phẩm và Bào chế thuốc Mã số: 9720202 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Vũ Bình Dương PGS.TS Hồ Anh Sơn HÀ NỘI - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan là công trình nghiên cứu riêng tơi với hướng dẫn khoa học tập thể cán hướng dẫn Các số liệu, kết nêu luận án là trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Hồng Sơn LỜI CẢM ƠN Trong q trình nghiên cứu hồn thành luận án này, quan tâm, hướng dẫn giúp đỡ tận tình thầy cô, nhà khoa học, với động viên bạn bè đồng nghiệp người thân gia đình Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng đặc biệt biết ơn sâu sắc tới: PGS.TS Vũ Bình Dương PGS.TS Hồ Anh Sơn Những người Thầy tận tâm hướng dẫn, ln động viên, khích lệ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi, giúp đỡ tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô, anh chị kỹ thuật viên, anh chị học viên, bạn sinh viên Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng sản xuất thuốc, Viện Đào tạo Dược, Bộ môn Sinh lý bệnh - Học viện Quân y, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Trân trọng cảm ơn thầy Viện Hóa Sinh biển, Trung tâm phương pháp phổ ứng dụng, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học & Cơng nghệ Việt Nam tạo điều kiện tốt nhất để tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc, phòng Sau đại học quan tâm giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Học viện Quân y Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Viện Y học cổ truyền Quân đội, anh/chị đồng nghiệp, người thân gia đình bạn bè ln động viên giúp đỡ tạo điều kiện để tơi yên tâm học tập, nghiên cứu Hà Nội, Ngày tháng năm 2023 Nguyễn Hồng Sơn MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ, ký hiệu viết tắt luận án Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY HÀNH TA 1.1.1 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.2 Thành phần hóa học 1.1.3 Tác dụng sinh học và dược lý 13 1.2 TỔNG QUAN VỀ LÊN MEN DƯỢC LIỆU 16 1.2.1 Đặc điểm 16 1.2.2 Phân loại 18 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình lên men dược liệu 19 1.2.4 Thay đổi thành phần hóa học tác dụng sinh học sau trình lên men dược liệu chi Allium 22 1.3 CÁC GIAI ĐOẠN BÀO CHẾ CAO KHÔ DƯỢC LIỆU 27 1.3.1 Chuẩn bị dung môi, dược liệu 27 1.3.2 Chiết xuất dược liệu 27 1.3.3 Loại bớt tạp chất 28 1.3.4 Cô đặc, sấy khô 30 1.4 MỘT SỐ MƠ HÌNH ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC 31 1.4.1 Các mơ hình thực nghiệm in vivo 31 1.4.2 Các mơ hình thực nghiệm in vitro 34 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 37 2.1.1 Dược liệu nghiên cứu 37 2.1.2 Động vật thí nghiệm 37 2.1.3 Các dòng tế bào chủng vi sinh vật kiểm định cho nghiên cứu in vitro 37 2.1.4 Thuốc thử, hóa chất dung mơi 38 2.1.5 Thiết bị nghiên cứu 40 2.1.6 Địa điểm thực nghiên cứu 41 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41 2.2.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình lên men tạo hành đen và tiêu chuẩn chất lượng hành đen 41 2.2.2 Nghiên cứu bào chế xây dựng tiêu chuẩn cao khô hành đen 48 2.2.3 Nghiên cứu đánh giá độc tính tác dụng sinh học cao khô hành đen 53 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 59 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 61 3.1 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH LÊN MEN TẠO HÀNH ĐEN VÀ TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HÀNH ĐEN 61 3.1.1 Kết thẩm định phương pháp định lượng cycloalliin hành đen sắc ký lỏng hiệu cao 61 3.1.2 Kết xây dựng tiêu chuẩn sở dược liệu hành ta làm nguyên liệu bào chế hành đen 65 3.1.3 Kết xây dựng quy trình lên men tạo hành đen 69 3.1.4 Kết nghiên cứu thành phần hóa học hành đen 78 3.1.5 Xây dựng tiêu chuẩn sở hành đen 83 3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO KHÔ HÀNH ĐEN 86 3.2.1 Kết xây dựng quy trình bào chế cao khơ hành đen 86 3.2.2 Kết xây dựng tiêu chuẩn sở cao khô hành đen 101 3.2.3 Kết đánh giá độ ổn định cao khô hành đen 102 3.3 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHƠ HÀNH ĐEN 103 3.3.1 Kết đánh giá độc tính cao khô hành đen 103 3.3.2 Kết đánh giá số tác dụng sinh học cao khô hành đen 108 CHƯƠNG BÀN LUẬN 116 4.1 VỀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH LÊN MEN TẠO HÀNH ĐEN VÀ TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG HÀNH ĐEN 116 4.1.1 Về việc lựa chọn cycloalliin làm chất đánh dấu 116 4.1.2 Về tiêu chuẩn sở hành ta 117 4.1.3 Về xây dựng quy trình lên men tạo hành đen 117 4.1.4 Về nghiên cứu thành phần hóa học hành đen 123 4.1.5 Về xây dựng tiêu chuẩn sở hành đen 128 4.2 VỀ NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VÀ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CAO KHÔ HÀNH ĐEN 128 4.2.1 Về điều chế dịch chiết hành đen 128 4.2.2 Bào chế cao khô hành đen phương pháp phun sấy 132 4.2.3 Xây dựng tiêu chuẩn sở bột cao khô hành đen 138 4.2.4 Đánh giá độ ổn định cao khô hành đen 138 4.3 VỀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHÔ HÀNH ĐEN 139 4.3.1 Đánh giá độc tính cao khơ hành đen 139 4.3.2 Đánh giá số tác dụng sinh học cao khô hành đen 141 KẾT LUẬN 146 KIẾN NGHỊ 148 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT STT Viết tắt AAS ABTS ACSO AE ALP ALT AOAC ASEAN 10 11 AST ATCC BP 12 13 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 CI CR/DP CYC DĐVN DM/DL DMSO DMEM DPPH ĐTĐ GLUT GSPC GS1PC 25 C-NMR H-NMR Phần viết đầy đủ Atomic Absorption Spectrophotometric 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid) S-alky(en)yl-cystein sulfoxyd Aerosil Alkalin phosphatase Aspartate Amino Transferase Association of Official Analytical Chemists (Hiệp hội nhà hóa học phân tích thức) Association of Southeast Asian Nations (Hiệp hội quốc gia Đông Nam Á) Aspartate Transaminase American Type Culture Collection British Pharmacopoeia (Dược điển Anh) Carbon-13 nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ carbon 13) Carr's compressibility index (Chỉ số nén Carr) Chất rắn/dịch phun Cycloalliin Dược điển Việt Nam Dung môi/dược liệu Dimethyl sulfoxyd Dulbecco's Modified Eagle's Medium 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Đái tháo đường Glucose-transporter γ-glutamyl peptit γ-glutamyl-S-1-propenyl-L-cystein Hydro-1 nuclear magnetic resonance (Phổ cộng hưởng từ proton) STT Viết tắt 26 HDL-C 27 HMBC 28 HPLC 29 30 HPMC E6 HSPS 31 IC50 32 33 34 35 36 KLRbk LD50 LDH LDL-C Mal 37 MIC 38 MTT 39 PVP K30 40 RSD 41 42 43 44 45 46 47 48 49 SD SAC SSHL STT STZ TCCS TD/CR USP WHO Phần viết đầy đủ High Density Lipoprotein Cholesterol Heteronuclear multiple bond correlationspectroscopy (Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết) High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) Hydroxypropyl methylcellulose E6 Hiệu suất phun sấy Half maximal inhibitory concentration (Nồng độ ức chế tối đa nửa) Khối lượng riêng biểu kiến Lethal Dose 50 (Liều gây chết 50% số vật thử) Lactat Dehydrogenase Low Density Lipoprotein Cholesterol Maltodextrin Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid Polyvinyl pyrrolidon K30 Relative standard deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) Standard deviation (Độ lệch chuẩn) S-allyl-L-cystein So sánh hàm lượng Số thứ tự Streptozocin Tiêu chuẩn sở Tá dược/Chất rắn United States Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ) World Health Organization (Tổ chức y tế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Các hợp chất flavonoid hành ta 1.2 Các hợp chất lưu huỳnh hữu hành ta 11 1.3 Các hợp chất saponin hành ta 12 1.4 Kết thử hoạt tính chống ung thư hành đen và hành ta 26 2.1 Danh mục thuốc thử, hóa chất dung mơi sử dụng 38 2.2 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 40 2.3 Chế độ ăn bình thường giàu chất béo tính 100 g thức ăn 57 3.1 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống sắc ký 61 3.2 Diện tích pic dãy dung dịch cycloalliin chuẩn 63 3.3 Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp 64 3.4 Kết khảo sát độ hệ thống sắc ký 65 3.5 Kết xác định hàm lượng nước mẫu hành ta 66 3.6 Kết xác định hàm lượng tro toàn phần hành ta 66 3.7 Kết định lượng CYC mẫu hành ta 68 3.8 Tóm tắt tiêu chất lượng hành ta 69 3.9 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men 70 3.10 Kết khảo sát ảnh hưởng độ ẩm lên men 72 3.11 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên men 73 3.12 Kết khảo sát ảnh hưởng loại, nồng độ enzym thời gian ngâm ủ 75 3.13 Kết khảo sát ảnh hưởng enzym protease nồng độ 0,03%, ngâm ủ ngày đến hàm lượng CYC theo thời gian lên men 76 3.14 Kết định lượng flavonoid toàn phần 78 3.15 Kết định lượng polyphenol toàn phần 78 3.16 Kết định lượng cycloalliin 79 3.17 Kết định lượng đường khử 79 3.18 Kết định lượng acid amin 80 3.19 Kết xác định độ ẩm hành đen 84 3.20 Kết định lượng CYC mẫu hành đen 85 3.21 Tóm tắt tiêu chất lượng TCCS hành đen 86 tháng tháng tháng Hình PL 12.2 Sắc ký đồ định lượng CYC điều kiện lão hóa cấp tốc Lơ PL 12 Bảng PL 12.3 Kết đánh giá độ ổn định điều kiện lão hóa cấp tốc Lô Chỉ tiêu Thời gian (tháng) Tính chất: Bột khơ tơi, màu vàng nâu, mùi thơm, vị Mất khối lượng làm khô: Khơng q 5% Định tính cycloalliin: Pic CYC sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử phải có thời gian lưu giống Định lượng: Hàm lượng CYC khơng 120 mg/g tính theo chế phẩm khô kiệt Đúng Đúng Đúng 3,59% 3,82% 4,28% Đúng Đúng Đúng 136,43 133,06 128,02 mg/g mg/g mg/g Dưới mức phát máy Giới hạn kim loại nặng PL 12 tháng tháng tháng Hình PL 12.3 Sắc ký đồ định lượng CYC điều kiện lão hóa cấp tốc Lơ PL 12 Bảng PL 12.4 Kết đánh giá độ ổn định điều kiện dài hạn Lô Thời gian (tháng) Chỉ tiêu Tính chất: Bột khơ tơi, màu vàng nâu, mùi thơm, vị Mất khối lượng làm khô: Khơng q 5% Định tính cycloalliin: Pic CYC sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử phải có thời gian lưu giống Định lượng: Hàm lượng CYC khơng 120 mg/g tính theo chế phẩm khô kiệt 12 Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng 3,62% 3,79% 4,01% 4,10% 4,75% Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng 135,78 134,95 134,10 132,58 130,54 mg/g mg/g mg/g mg/g mg/g Dưới mức phát máy Giới hạn kim loại nặng PL 12 Hình PL 12.4 Sắc ký đồ định lượng CYC điều kiện dài hạn Lô PL 12 Bảng PL 12.5 Kết đánh giá độ ổn định điều kiện dài hạn Lô Chỉ tiêu Thời gian (tháng) Tính chất: Bột khơ tơi, màu vàng nâu, đồng nhất, mùi thơm, vị Mất khối lượng làm khô: Khơng q 5% Định tính cycloalliin: Pic CYC sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử phải có thời gian lưu giống Định lượng: Hàm lượng CYC khơng 100 mg/g tính theo chế phẩm khô kiệt Giới hạn kim loại nặng 12 Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng 3,28% 3,58% 4,04% 4,27% 4,41% Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng 135,99 mg/g 135,37 mg/g 134,77 mg/g 133,30 mg/g 131,81 mg/g Dưới mức phát máy PL 12 Hình PL 12.5 Sắc ký đồ định lượng CYC điều kiện dài hạn Lô PL 12 Bảng PL 12.6 Kết đánh giá độ ổn định điều kiện dài hạn Lô Chỉ tiêu Ban đầu Tính chất: Bột khơ tơi, màu vàng nâu, đồng nhất, mùi thơm, vị Mất khối lượng làm khơ: Khơng q 5% Định tính cycloalliin: Pic CYC sắc ký đồ mẫu chuẩn mẫu thử phải có thời gian lưu giống Định lượng: Hàm lượng CYC khơng 100 mg/g tính theo chế phẩm khô kiệt Giới hạn kim loại nặng Thời gian (tháng) 12 Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng 3,44% 3,59% 3,89% 4,27% 4,70% Đúng Đúng Đúng Đúng Đúng 136,22 mg/g 135,14 mg/g 134,21 mg/g 133,04 mg/g 131,09 mg/g Dưới mức phát máy PL 12 Hình PL 12.6 Sắc ký đồ định lượng CYC điều kiện dài hạn Lô PL 12 Phụ lục 13 Hình ảnh thỏ thử nghiệm độc tính bán trường diễn cao khơ hành đen 13.1 Hình ảnh thỏ 13.1.1 Hình ảnh thỏ lơ chứng sinh học Hình PL 13.1 Hình ảnh thỏ lơ chứng sinh học (Thỏ số đực) PL 13 13.1.2 Hình ảnh thỏ lơ uống cao khơ hành đen liều Hình PL 13.2 Hình ảnh thỏ, lô uống cao khô hành đen liều (Thỏ số đực) PL 13 13.1.3 Hình ảnh thỏ lơ uống cao khơ hành đen liều Hình PL 13.3 Hình ảnh thỏ, lơ uống cao khơ hành đen liều (Thỏ số 11 đực) PL 13 13.2 Hình ảnh mô bệnh học gan, thận, lách lô thỏ nghiên cứu 13.2.1 Hình ảnh mơ bệnh học thỏ lô chứng sinh học Gan thỏ lô chứng sinh học (Thỏ số đực) Thận thỏ lô chứng sinh học (Thỏ số cái) Lách thỏ lô chứng sinh học (Thỏ số cái) Hình PL 13.4 Hình ảnh mơ bệnh học gan, thận, lách thỏ lô chứng sinh học (HE x 400) PL 13 13.2.2 Hình ảnh mơ bệnh học thỏ lô uống cao khô hành đen liều Gan thỏ lô uống cao khô hành đen liều (Thỏ số cái) Thận thỏ lô uống cao khô hành đen liều (Thỏ số đực) Lách thỏ lô uống cao khô hành đen liều (Thỏ số đực) Hình PL 13.5 Hình ảnh mơ bệnh học gan, thận, lách thỏ lô uống cao khô hành đen liều (HE x 400) PL 13 13.2.3 Hình ảnh mơ bệnh học thỏ lơ uống cao khô hành đen liều Gan thỏ lô uống cao khô hành đen liều (Thỏ số cái) Thận thỏ lô uống cao khô hành đen liều (Thỏ số 13 cái) Lách thỏ lô uống cao khô hành đen liều (Thỏ số 13 đực) Hình PL 13.6 Hình ảnh mơ bệnh học gan, thận, lách thỏ lô uống cao khô hành đen liều (HE x 400) PL 13 ...BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y NGUYỄN HỒNG SƠN NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ, ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHƠ HÀNH ĐEN Chun ngành: Cơng nghệ dược phẩm và Bào. .. 4.2.4 Đánh giá độ ổn định cao khô hành đen 138 4.3 VỀ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CAO KHÔ HÀNH ĐEN 139 4.3.1 Đánh giá độc tính cao khô hành đen 139 4.3.2 Đánh giá. .. học hay tìm kiếm tác dụng mới; nghiên cứu biến đổi thành phần hóa học; nghiên cứu chiết xuất bào chế cao khô dược liệu công nghệ để tiện sử dụng, tăng tính ổn định sản phẩm, đến nghiên cứu đánh