Nghiên cứu định danh tác nhân bệnh đốm lá vi khuẩn cây cải ngọt docx

Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 2/2008 14 Nghiên cứu định danh tác nhân bệnh đốm lá vi khuẩn cây cải ngọt IDENTIFICATION PATHOGEN CAUSED BACTERIAL LEAF SPOT DISEASE ON CHINENSISE CABBAGE ( Brassica sinensis ) Hoàng Xuân Quang 1 , Trần Văn Kỳ (1) , Nguyễn Văn Lẫm 2 , Lê Đình Đôn 2 Abstract Bacterial leaf spot was one the most important disease which caused severely loss to yield of chinensise cabbage (Brassica sinensis) in Hồ Chí Minh city. The disease symptom is often water-soaked spot on lesion margin of abaxial leaf surface. The identification of bacterial strains was followed by Schaad (1988) including experiments of Gram stain, color colonies on YDC medium and MS medium, growth at 35 o C, gelatin hydrolysis, protein digestation on skimmed-milk, acid production from arabinose, mannose, and glucose. The result indicated that bacteria were belong to negative Gram group. Colonies were convex, entire margin and yellow on YDC medium and. The bacteria were fast growth between 25-35 o C but not growth above 35 o C and slow growth below 20 0 C. The bacteria were able to growth on MS medium with blue colonies, gelatin hydrolysis, protein digestation with clear zone around the colonies. Yellow color around colonies on medium C of dye was a consequence of acidification activities of bacteria on arabinonse, manose and glucose. The causal agent of leaf spot disease on chinensise cabbage caused by Xanthomonas campestris. I. ĐặT VấN đề Cải ngọt (Brassica sinensis L.) được coi là cây rau ăn lá chủ lực ở Tp.HCM và một số tỉnh phụ cận. Bệnh đốm lá vi khuẩn là nguyên nhân chính gây tổn thất đến năng suất rau của những năm gần đây. Triệu chứng của bệnh là các đốm bệnh xuất hiện trên rải rác trên lá (hình bìa 2-1). Tác nhân gây bệnh đốm lá trên cải bắp, cải rổ ở Mỹ được xác định là do các dòng vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. armoraciae (Lowell, 2001; Gaetan và Lopez, 2005). Youfu và ctv (2002) cho rằng bệnh đốm lá cây súp lơ ở Mỹ do Psedomonas syringae pv. maculicola. Theo Vicente và ctv (2006), bệnh đốm lá vi khuẩn họ hoa thập tự là do các vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. raphani và Xanthomonas campestris pv. armoraciae, Xanthomonas campestris 1. Viện KHKTNN Miền Nam; 2 . Đại học Nông Lâm Tp. HCM Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 2/2008 15 pv. campestris gây nên. Phạm Văn Biên và Mai Thị Vinh (1985) đã xác định bệnh đốm lá súp lơ ở Bình Chánh (Tp.HCM) là do vi khuẩn Pseudomonas sp. gây nên. Nghiên cứu này là xác định tên loài của tác nhân gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt ở Tp. HCM. II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu bệnh đốm lá được thu thập từ Củ Chi, Hoóc Môn và quận 12 Tp.HCM. Vi khuẩn từ các mẫu bệnh mới được phân lập trên môi trường PDA. Xác định vi khuẩn gây bệnh theo quy tắc Koch. Việc định danh đến giống và loài vi khuẩn gây bệnh bằng các phản ứng sinh lý, sinh hóa được thực hiện theo phương pháp của Schaad (1988). Cụ thể: nhuộm Gram, đặc tính khuẩn lạc trên môi trường YDC agar, môi trường MS, sự hóa lỏng Gelatin, sự phân giải sữa mất chất béo trên môi trường YNA, phản ứng tạo axít từ nguồn hyđrat carbon trên môi trường Dye’s C và khoảng nhiệt độ sinh trưởng, nhiệt độ tối cao, tối thấp của vi khuẩn gây bệnh. III. KếT QUả Và THảO LUậN Phân lập vi khuẩn gây bệnh Trên môi trường PDA, khuẩn lạc của vi khuẩn từ mẫu lá bệnh có mầu vàng tròn, hơi lồi, bề mặt nhẵn bóng và rìa nhẵn (hình bìa 2-2). Phản ứng nhuộm Gram của khuẩn lạc phân lập từ đốm lá cải ngọt Kết quả nhuộm Gram cho thấy khuẩn lạc có màu đỏ tươi (hình bìa 2 - 3A), khác biệt rõ so với mầu tím của vi khuẩn Gram dương Bacillus subtilis (Hình bìa 3 - 3B). Theo Schaad (1988), vi khuẩn nhuộm Gram âm thường có màu hồng hoặc đỏ tươi và vi khuẩn nhuộm Gram dương có mầu tím hoặc xanh đen, kết luận này cũng tương tự Jame và ctv (1992). Như vậy vi khuẩn khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt thuộc nhóm Gram âm. Phản ứng của vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt trên các môi trường nuôi cấy khác nhau Nhóm vi khuẩn Gram (-) gây bệnh cho cây trồng gồm các giống Pseudomonas, Xanthomonas, Erwinia, và Agrobacterium. Theo Schaad (1988), sử dụng môi trường YDC để phân biệt các giống trên là phù hợp. Sau cấy 48 giờ ở nhiệt độ 28 o C thấy rằng khuẩn lạc của các dạng vi khuẩn có màu vàng trên môi trường này (hình bìa 2-4). Như vậy, vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt có thể là Xanthomonas hoặc Erwinia. Kết quả này phù hợp với Vauterin và ctv (1995) khi nghiên cứu bệnh đốm lá sắn do vi khuẩn Xanthomonas gây nên. Để phân biệt hai giống Xanthomonas và Erwinia, vi khuẩn được cấy trên môi trường MS. Đây là môi trường có tính chọn lọc cao để phân biệt vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae (Schaad, 1988). Trong điều kiện pH của môi Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 2/2008 16 trường là 7,4 và nhiệt độ 28 o C, sau cấy 48 giờ thì khuẩn lạc của vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt và vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. citri đều có màu hơi xanh. Trong khi đó, vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối nhũn cây cải ngọt có mầu vàng da cam (hình bìa 2-5). Như vậy, có thể khẳng định rằng bệnh đốm lá cải ngọt do vi khuẩn giống Xanthomonas gây nên. ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển của vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt Trên môi trường PDA, sau 48 giờ có sự khác nhau về sinh trưởng của các dòng vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt. Hầu hết các dòng đều sinh trưởng phát triển mạnh ở nhiệt độ 30 o C; ở 20 o C vi khuẩn mọc chậm hơn và ngừng sinh trưởng phát triển hoàn toàn ở nhiệt độ 40 o C trở lên. Trong thí nghiệm này, nếu kích thước đốm khuẩn lạc lớn hơn được xem là có sự sinh trưởng phát triển (hình bìa 2-6b); nếu đốm khuẩn lạc không thay đổi so với ban đầu hoặc lớn hơn chút ít được xem là sinh trưởng chậm (hình bìa 2-6a) và nếu đốm khuẩn lạc không mọc thì được coi là ngừng sinh trưởng phát triển (hình bìa 2-6c). Theo Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân (1999), đại bộ phận vi khuẩn có nhiệt độ thích hợp từ 20 - 30 o C, tối đa khoảng 35 - 37 o C. Như vậy, vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt thuộc nhóm ưa nhiệt trung bình. Theo Schaad (1988), vi khuẩn gây bệnh cây thuộc giống Xanthomonas có 3 loài campestris, albilineans và axonopodis có khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ 35 o C. Do đó, loài vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt có thể là một trong ba loài trên. Sự hoá lỏng Gelatin của vi khuẩn Sau 48 giờ nuôi cấy ở điều kiện 25 o C và khi nhuộm môi trường bằng dung dịch HgCl 2 thì vòng phân giải trong suốt xuất hiện xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt và dòng đối chứng Xanthomonas campestris pv. citri. Như vậy, đã xảy ra phản ứng hoá lỏng Gelatin của vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt (Hình bìa 2-7). Theo Schaad (1988), trong các loài vi khuẩn gây bệnh cây giống Xanthomans, chỉ có 2 loài Xanthomonas campestris và Xanthomonas fragariae gây hoá lỏng Gelatin. Như vậy, vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt là một trong hai loài trên. Sự phân giải sữa mất chất béo Với phương pháp cấy vi khuẩn thành điểm trên môi trường đặc chứa sữa mất chất béo, ở nhiệt độ 28 o C sau 48 giờ thì vòng phân giải hình thành xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt và dòng đối chứng Xanthomonas campestris pv. citri. Điều này chứng tỏ có sự hoạt động của enzyme protease của vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt (hình bìa 2-8). Theo Ahaad (1988) và Goszczynska (2000), chỉ có vi khuẩn Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 2/2008 17 loài X. campestris có khả năng thuỷ phân protein, các loài khác thuộc giống Xanthomonas gây bệnh cây không thuỷ phân protein. Như vậy, vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt thuộc loài Xanthomonas campestris. Phản ứng của vi khuẩn tạo axít từ các hyđrat carbon Phản ứng tạo axít từ các hyđrat carbon là quá trình lên men dưới sự xúc tác của nhóm enzyme nội bào để tạo ra năng lượng cho hoạt động sống của vi khuẩn. Trong quá trình này đã hình thành một số sản phẩm trao đổi chất và chúng được tế bào tiết ra ngoài môi trường. Dựa vào các chất tiết ra môi trường để xác định được các enzyme đặc trưng và từ đó định danh được vi khuẩn gây bệnh (Jame, 1992). Vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt được thực hiện các thí nghiệm tạo axít từ các đường đơn như glucose, arabinose, manose. Dưới tác dụng của men catalase ở vi khuẩn, đường bị lên men tạo ra axít acetic, axít lactic khuyếch tán vào môi trường tạo thành mầu vàng. Thí nghiệm cho thấy vi khuẩn gây bệnh đốm lá ở cải ngọt và vi khuẩn đối chứng X. campestris pv. citri đều xuất hiện vòng phân giải mầu vàng xung quanh khuẩn lạc trên môi trường: có phản ứng dương tính tạo axít từ đường glucose (hình bìa 2-9a), arabinose (hình bìa 2-9b) và manose (hình bìa 2-9c). Trong khi đó, dòng đối chứng với Pseudomonas spp. không hình thành vòng phân giải mầu vàng, tức là không sinh axít từ các đường này. Theo Schaad (1988), trong các loài vi khuẩn thuộc giống Xanthomonas gây bệnh cây chỉ có loài vi khuẩn Xanthomonas campestris tạo axít trên từ cả ba loại đường arabinose, glucose và manose. Các loài Xanthomonas fragariae, X. albilineans, X. axonopodis không tạo axít từ đường arabinose, loài X. ampelina tạo axít từ đường arabinose, nhưng không tạo axít từ đường glucose và manose. Kết quả của các phản ứng sinh lý và sinh hóa khẳng định vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt có triệu chứng như mô tả phần (1) là do Xanthomonas campestris gây nên. IV. KẾT LUẬN Bệnh đốm lá cải ngọt là do vi khuẩn Xanthomonas campestris gây nên, thuộc nhóm Gram âm, khuẩn lạc tròn, lồi, rìa nhẵn, màu vàng trên môi trường PDA và YDC. Hóa lỏng Gelatin, phân huỷ protein, tạo axít từ các đường glucose, arabinose và manose. Vi khuẩn thuộc nhóm ưa nhiệt trung bình, nhiệt độ thích hợp từ 25-35 o C, sinh trưởng chậm dưới 20 o C, ngừng sinh trưởng từ 40 o C trở lên. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Gaetan, S. and Lopez. N., 2005. First outbreak of bacterial leaf spot caused by Xanthomonas campestris on Canola in Argentina. Plant Disease 89: 683. Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 2/2008 18 2. Goszczynska, T., Serfontein. J. J., and Serfontein, S., 2000. Introduction to practical phytobacterology. A safrinet manual for phytobacteriology, sponsored by SDC, Switzerland. 83 pages. 3. James, G., Cappuccino and Sherman, N., 1992. Microbiology a laboratory manual. Third edition. The Benjamun/Cummings publishing company. 462 pages. 4. Lê Lương Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và vi rút hại cây trồng. NXB Giáo dục Hà Nội, trang 99-100. 5. Lowell, L. B., 2000. Crucifer diseases. Vegetable diseases a practical guid. AVRDC publication, 15-28. 6. Mai Thị Vinh và Phạm Văn Biên, 1985. Bệnh hại rau cải ở một số vùng rau ngoại thành Tp. Hồ Chí Minh. Báo cáo khoa học, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam, 15 trang. 7. Schaad, N. W., 1988. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Second edition. APS Express. 164 pp. 8. Vicente, J. G., Everett, B. and Robert. S. J., 2006. Identification of isolates that cause leaf spot of brassica as Xanthomonas campestris pv. raphani and pathogenic and genetic comparison with related pathovars. Phytopathology 96: 735-745. 9. Youfu, Z., John, P. D., and Carol L. B., 2002. Detection survival and sources of inoculation for bacterial diseases. Plant Disease 8: 883-888. . Kết quả nghiên cứu khoa học BVTV - Số 2/2008 14 Nghiên cứu định danh tác nhân bệnh đốm lá vi khuẩn cây cải ngọt IDENTIFICATION PATHOGEN CAUSED BACTERIAL. khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt thuộc nhóm Gram âm. Phản ứng của vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt trên các môi trường nuôi cấy khác nhau Nhóm vi khuẩn Gram (-) gây bệnh cho cây trồng gồm. khuẩn lạc của vi khuẩn gây bệnh đốm lá cải ngọt và vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. citri đều có màu hơi xanh. Trong khi đó, vi khuẩn Erwinia spp. gây bệnh thối nhũn cây cải ngọt có mầu