TIẾP CẬN VẤN ĐỀ PHÁT HIỆN TỒN DƯ KHÁNG SINH TRONG CÁC THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT (Phần 1) doc

p Ảnh hưởng kỹ thuật chế biến, bảo quản sản phẩm: ức chế sự lên men sản xuất acidn Bảo vệ người tiêu dùng n Bảo vệ môi trường: kháng thuốc à thú y, nhân y Tại sao lại phải kiểm tra tồn d

PHẠM KIM ĐĂNG

Khoa Chăn nuôi và Nuôi trồng thuỷ sản

Đại học Nông nghiệp Hà Nội

THỰC PHẨM CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT

Kháng sinh và chăn nuôi thâm canh

Chăn nuôi thâm canh

Mật độ cao

Tổn thương, ô nhiễm tiểu khí hậu

chuồng nuôi, mất vệ sinh

Tăng tỷ lệ chết, con non thường

yếu ớt, đề kháng kém,

Chậm sinh trưởng

Sản lượng giảm hay giảm năng

suất chăn nuôi

Tổn thất kinh tế rất quan trọng

Các nhóm kháng sinh chính sử dụng

trog chăn nuôi

§ β -lactam(penicilline, cephalosporine)

§ Tetracyclines (oxy- và chlortetracycline, …)

H H Benzylpenicilline (penicilline)

Cephalexine (cephalosporine)

H H O

NH

CH2CO

N S

CH3COOH O

S O O N N

NH2N N

O O O

HO OH

CH3N(CH3)2

(aminocyclitol)

Erythromycine(macrolide)

OCH3

CH3OH

CH3

CH3

H5C2

H3C HO

H3C CH3

OH

CH3O O O

H OH

H3CHN

HO NHCH3

H OH O

O O O

Streptomycine (aminoglycoside)

OHOHNHCH3

CH2OH

OH

NH2NH C

NH C NH NH HO

HO

CH3Sulphadimidine ou sulfamethazine

O

CH2OH OH

CH2O H

CH3

CH3O

HO

H3C H

CH3O O

OXOLINIC ACID

C2H5COOH

N O

CH2OH

N N O

O

O

CARBADOX

H O

O N

TIAMULIN

H3C

CH3H

H3C

H2C

HO CH3

O (C2H5)2N S

CHLORAMPHENICOL

NHCOCHCl2H

H OH

CH2OH C

p Ảnh hưởng kỹ thuật chế biến, bảo quản sản phẩm: ức chế sự lên men sản xuất acid

n Bảo vệ người tiêu dùng

n Bảo vệ môi trường: kháng thuốc à thú y, nhân y

Tại sao lại phải kiểm tra tồn dư kháng sinh

trong thực phẩm có nguồn gốc động vật?

p Ít độc cấp tính

p Kháng sinh cấm (ung thư, quái thai, bất thường … )

- xuất hiện các chủng vi khuẩn gây bệnh kháng nhiều loại kháng sinh (multi-resistante)

- Vô hiệu hoá các loại kháng sinh

- Nguy cơ ô nhiễm môi trường

Kháng sinh và tiềm tàng nguy hiểm

Nguồn gốc tồn dư tồn dư kháng sinh

Kháng sinh + lợi nhuận chăn nuôi

Sử dụng kháng sinh ( lạm dụng, bất hợp pháp )

- Điều trị bệnh cá thể

- Phòng bệnh cho đàn hoặc lô

- Kích thích sinh trưởng (Feed additives ????)

- Bảo quản ????

Tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi Ảnh hưởng xấu đến môi trường

và người tiêu dùng

Nguy ên nhân

§ Các sản phẩm chợ đen

§ Bảo quản ????

§ Sai nguyên tắc hoặc có chủ định

1. Không có đơn thuốc của BSTY,

2. Không tuân thủ liều

3. Thời gian dừng thuốc

Đặc biệt các Vùng dân trí thấp

LUẬT LIÊN QUAN TỒN DƯ

Cơ sở qui định MRL và MRPL????

Tác động có

thể quan sát

Tổng lượng kháng sinh

Mức không thể quan sát thấy tác động bất lợi

Hệ số an toàn

ADI = Acceptable Daily Intake

MRL=Maximum Residue Limit

Kháng sinh từ chuồng nuôi đến bàn ăn

•Kiểm soát vs giết mổ, dịch bệnh

•Bắt buộc có thông báo

•Kiểm soát thân thịt và nội tạng

Kiểm soát nhập khẩu Thú y cửa khẩu ????

•Traçability

•Kiểm soát MRL

Cơ quan thẩm quyền:

Cục thú y -Bộ nông nghiệp Cục VSATTP - Bộ y tế

Cục VSANTYTS - Bộ Thuỷ sản

Kiểm soát các kháng sinh

Khó khăn: chất cần tìm không biết trước

Liệu có Kháng sinh nào trong thực phẩm không?

Cách tiếp cận

theo lý thuyết

Cách tiếp cận theo phân tích

CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG

Mẫu

Sàng lọc

Phân tích định tính Phân tích định lượng

Kết quả có giá trị theo tiêu chí đặt ra

Nhanh, hạn chế tối thiểu dương tính giả, âm tính giả

CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG

CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG

1 Sàng lọc(screening)

Đạt tiêu chuẩn

2 Phân tích khẳng định

CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG

- Không cho kết quả âm tính giả

II Phương pháp khẳng định (lý hoá)

- Đặc hiệu

- Không cho kết quả dương tính giả

CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG

I. Phương pháp sàng lọc (screening)

- Test vsv ( “T est thận Bỉ ”, test 4 đĩa Châu Âu

Premitest, Delvotest, Copan, …)

n Test miễn dịch (ELISA, RIA …), Receptor-essais

CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC VÀ KHẲNG ĐỊNH

VSV ELISA

HPLC-UV HPLC-F LC/GC- MS MS-MS

Phù hợp để khẳng định các chất cấm

Thích hợp để sàng lọc

Phù hợp để khẳng định các chất có MRL

Các chủng vsv được dùng trong test VSV

kiểm tra tồn dư

1 BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS var CALIDOLACTIS

p IMPROVED AGAR DIFFUSION TEST DELVOTEST SP-NT

p CHARM AIM-96 DISK ASSAY PLATE METHOD

p DELVOTEST MCS COPAN MILK TEST

2 STREPTOCOCCUS SALIVARIUS ssp THERMOPHILUS

ACIDIFICATION TEST or ACIDIFICATION TEST + TMP VALIO T101 VALIO T102

LUMAC RAPID ANTIBIOTIC TEST KIT

3 BACILLUS CEREUS

BACILLUS CEREUS-TEST (tetracyclines)

4 ESCHERICHIA COLI

ESCHERICHIA COLI -TEST (quinolones)

5 BACILLUS SUBTILIS BGA

6 MICROCOCCUS LUTEUS

7 BACILLUS BRONCHESEPTICA

8 …

Ưu nhược điểm của test VSV

n Tương đối nhạy

n Tương đối nhanh

n Thời gian test quá lâu

n Không đặc hiệu

n Không định lượng

n Một số chất không phát hiện được

p CAP, nitrofurans, nitro-imidazoles

n Độ nhạy phụ thuộc điều kiện của chủngvSV sử dụng

C ác dạng test VSV

- Ức chế vi sinh vật tạo vòng vô khuẩn

- 1 chủng cùng 1 điều kiện môi trường

- 1 chủng điều kiện môi trường khác nhau (pH)

Enzym, receptor, miễn dịch

n PENZYM 100 PENZYM 100S

n TG (tetracycline galactosidase) – test

n SNAP (beta lactam en tetracycline test kit) • LacTek

n β_S.T.A.R • Delvo Press (II)

n Charm MRL-test (ROSA) (β -lactam, tetra or both)

n CHARM II (5 groups) • Twin Sensor

Ưu nhược điểm của ph ương pháp

Ưu nhược điểm của ph ương pháp

n Một số trường hợp thay đổi

độ thu hồi

Khả năng phân biệt và tiềm tàng các

chất gây nhiễu (interference)

VSV ELISA HPLC-UV HPLC-F LC/GC- MS

MS-MS

Tăng khả năng phân

biệt

Tăng tiềm

tàng các chất

gây nhiễu

CHIẾN LƯỢC PHÂN TÍCH CHUNG

Chiến lược phân tích cụ thể và các

phương pháp khác nhau

Các sản phẩm khác nhau ???

Kiểm tra kháng sinh trong thịt và thận ở Bỉ

Procéder à un test rénal

La carcasse est acceptée

Analyse de la lésion d’injection

La carcasse est acceptée

Concentration < LMR Concentration > LMR

Concentration > LMR Concentration < LMR

Kiểm tra kháng sinh trong thịt và thận ở Bỉ

Các công đoạn trong phân tích tồn dư

Ý tưởng phát triển phương pháp

Hình thành ý

tưởng

Dư luận

Phân tích điều tra

Yêu cầu theo luật

Yêu cầu thực tế

T ổ chức thực hiện

ý tưởng Kiểm tra kết quả

Giấy tẩm dịch vùng vỏ thận

Nguyên lý “Test thận Bỉ”

Ưu nhược điểm ????

Ý tưởng khắc phục nhược điểm

Không dùng dịch thận, mẩu thận mà

dùng mẫu tách chiết

Tách chiết thế nào?

Lượng mẫu bao nhiêu?

Làm thế nào để kiểm tra được chất lượng test??

Yêu cầu qui trình tách chiết thế nào?

Lượng mẫu bao nhiêu?

Xác định Độ mẫn cảm của

VSV với kháng sinh

Kiểm soát Chất lượng môi

trường, Đĩa cấy vsv

Làm thế nào để kiểm tra được chất

lượng test??

Đánh giá các tham số độ mạnh

(LOD, Độ nhạy, Độ đặc hiệu, độ chính xác)

Phạm Kim Đăng , Marie-Louise SCIPPO; Guy DEGAND;

Caroline DOUNY; Guy MAGHUIN-ROGISTER (2007):

Chuẩn hóa phương pháp sàng lọc định tính kiểm soát tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật theo qui

định số 2002/657/EC (bài tổng hợp) Tạp chí KHKT Nông

nghiệp, ĐHNN I, Tập V, Số 1/2007; Trang 24-30.

http://www.hua.edu.vn/tc_khktnn/default.asp?i d=11&ID_S=20

Chuẩn bị thực hiện

Nguyên liệu và hoá chât

- Dung dịch chuẩn (dung môi, chất chuẩn)

- Giống vi sinh vật: Bacillus subtilis BGA

- Môi trường nuôi cấy

Standard II Nutrient Agar for microbiology

Chuẩn bị môi trường (1 l ít)

§ Cân 25 g môi trường

§ Thêm 6 g dextrose = 0,6% (nếu dùng dung dịch 20% cần ?)

§ Hoà trong 1 lit nước cất (– số ml đường) (đun sôi, khuấy liên tục, cẩn thận khi sắp sôi)

§ Cho vào các lọ (4x250 ml) (nắp hơi lỏng)

§ Tiệt trùng trong 15 phút ở 121°C +/-0,1.

§ Làm nguồi về 47°C bằng nồi cách thuỷ (Nếu thạch dự

trữà90°C trong 3h, làm nguộià47°C khoảng 30 phút)

Chuẩn bị môi trường (1 l ít)

§ Môi trường đưa vào sử dụng sau khi hiệu chỉnh

pH=7,2±0,1 ở 25°C bằng HCl hoặc NaOH 1M

§ Mỗi lọ 100 ml môi trường: 20µl TMP (1mg/ml) + 100

µl dung dịch huyền phù B.subtilis được pha loãng theo hướng dẫn à lắc đều

§ Đổ 14 ml thạch/đĩa (dày 2,2 mm) à (200 ml = 14 đĩa)

§ Sau khi để thạch cứng, đĩa bao gói bao nilon plastic và được bảo quản ở 4°C tối đa 1 tuần (úp nắp xuống)

Kiểm tra chất lượng đĩa chuẩn bị

Độ rộng vòng vô khuẩn quanh đĩa giấy biến động tuỳ theo

lượng kháng sinh có trong 50 µl dung dịch chuẩn

Thu hồi Lớp trên được

Phần chất khô còn lại được thu hồi trong 200 µl methanol

Ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 15°C

3 gam t ôm/200 µl

methanol

50µl chứa 0,75 gam tôm

Xác định khối lượng mẫu tôm bé nhất

cần lấy cho một lần tách chiết

Khối lượng mẫu tôm bé

nhất cần lấy (QME)/phân

tích

Qui trình tách chiết

Giới hạn nồng độ tối đa (LMR)

Phương pháp hiểu chỉnh phương pháp

Chuẩn hoá theo QĐ 2002/657/CE - LCR, AFSSA, FOUGERES

NA (Âm tính theo qui định)

NGUYÊN LÝ CỦA KÍT ELISA

(FLUORO)QUINOLONES 2 HOURS

DO CER CUNG CẤP Gián tiếp - Canh tranh

(FLUORO)QUINOLONES 2 HOURS

CER _ BỈ

Thành phần của một Kit

1. Một plate 96 giếng có phủ KT tinh sạch của cừu kháng lại KT có nguồn

gốc thỏ

2. 7 lọ có chứa dung dịch chuẩn (KN): 1, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 và 0 ng/ml

3. Dung dịch chứa KN có gắn với men gây phản ứng tạo màu (Peroxide

cọnugated norfloxacin)

4. Lọ chứa KT có nguồn gốc từ thỏ đặc hiệu với KN được đông khô

5. 1 lọ 18 ml Substrate/chromogen (tham gia phản ứng tạo màu

1 Phủ kháng thể đã được tinh lọc lên bề mặt rắn (1 µg kháng thể cừu kháng

lại kháng nguyên có nguồn gốc thỏ IgG)

+ °C

Kháng thể

16/04/2008

2 a) Cho mẫu đã được tách chiết hoặc

Antigen

2 c) Cho kháng thể đặc hiệu thỏ vào

E EE E

5 Cho dung dịch phản ứng màu vào TMB/H 2 O 2 và ủ 30’ trong bóng tối

Chuẩn bị hoá chất

PBS pH 7.4 : 9g NaCl + 7,78g Na 2 HPO 4 2H 2 O+ 0,75 g KH 2 PO 4 trong 1 lít H 2 O

Methanol/PBS (50/50 V/V)

Pha loãng dung dịch đệm 10x

Pha loãng KN gắn enzyme 100x

Khôi phục KT đông khô (+ 6 ml dung dịch pha loãng)

!

Lượng hoá chất chuẩn bị số mẫu phân tích + đường chuẩn

QUI TRÌNH TÁCH CHIẾT MẪU

(*) PBS pH 7.4 :9 gam NaCl, 7,78 gam Na 2 HPO 4 .2H2O và 0,75 gam KH 2 PO 4 trong 1 lít nước cất

30’’

0,5 ml

4,5 ml d 2 đệm pha loãng

30 giây

( pha loãng 10x )

50 µl/giếng

QUI TRÌNH TEST

S8

1 1

H

S12S7

S7

0.5 0.5

G

S11S6

S6

0.3 0.3

F

S11S5

S5

0.2 0.2

E

S10S4

S4

0.1 0.1

D

S10S3

S3

.05 05

C

S9 S2

S2

0 0

B

S9 S1

S1 NS NS

A

12 11

10 9

8 7

6 5

4 3

2 1

Chuẩn bị Plate

B8 B7

B6 B5

B4 B3

B2 Bước 1

ô

- B, B0 tương ứng là mật độ quang của dung dịch chuẩn ở các nồng độ khác nhau và tại nồng độ bằng 0

- NS mật độ quang của dung dịch không đặc hiệu

QUI TRÌNH TEST

1,043 0,923 0,801 0,642 0,485 0,307 1,226 0,07

Mật độ quang

(OD) Dung dịch chuẩn

0,05 C6

0,1 C5

0,2 C4

0,3 C3

0,5 C2

1 C1

0 C0

0 NSB*

Mẫu 1: OD = 0,121 Mẫu 2: OD = 0,095 Mẫu 3: OD = 0,45

à Hãy tính Nồng độ thực ?? Và đưa ra kết luận??

CÁC DẠNG KÍT VÀ KHẢ NĂNG

PHÁT HIỆN

MÔ ĐÔNG VẬT

Kidney, Liver, Muscle Pig, Chicken,

Beef, Seafood, Fish, Eggs

MẬT ONG

CÁC DẠNG KÍT VÀ KHẢ NĂNG

PHÁT HIỆN

QUI TRÌNH TEST

ĐỌC VÀ GIẢI THÍCH KẾT QUẢ