Đề tài thu nhận inulinase

Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Mục lục Trang I Giới thiệu 1.1 Inulin 1.2 Định nghĩa 1.3 Công thức cấu tạo 1.4 Nguồn thu nhận 1.5 Ứng dụng Enzyme inulinase 2.1 Định nghĩa 2.2 Phân loại 2.3 Các bậc cấc trúc chế xúc tác 2.4 Ứng dụng Vi sinh vật 3.1 Nhóm vi sinh vật sử dụng sinh tổng hợp inulinase 3.2 Đặc điểm sinh lý II Quy trình cơng nghệ III Giải thích quy trình cơng nghệ Chuẩn bị môi trường Tiệt trùng môi trường Chuẩn bị giống Nhân giống Cấy giống Lên men Tinh 7.1 Ly tâm lần 7.2 Kết tủa 7.3 Ly tâm lần 7.4 Hòa tan kết tủa 7.5 Thẩm tách 7.6 Trao đổi sắc ký ion 7.7 Trao đổi sắc ký lực 7.8 Sấy IV.Sản phẩm V Thành tựu công nghệ VI.Tài liệu tham khảo Trang 5 5 7 7 11 11 12 14 16 16 16 18 18 20 20 28 28 29 30 31 31 32 35 36 38 38 56 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn MỤC LỤC BẢNG Bảng Bảng 1: Một số vi sinh vật sử dụng để sinh tổng hợp inulinase Bảng 2: Một vài tính chất inulinase từ loài vi sinh vật… Bảng 3: Sự ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính enzyme Bảng 4: Sự kết hợp thành phần tối ưu môi trường Bảng 5: Các thành phần mơi trường dựa mơ hình… Bảng 6: Mơ hình thực nghiệm sử dụng phương pháp Plackett – burman Bảng 7: Bảng 8: Thành phần dinh dưỡng bổ sung vào mơi trường chất rắn Bảng 9: Mơ hình thực nghiệm cho tối ưu hóa nồng độ thành phần… Bảng 10: Phân tích kết biến số thực nghiệm mơ hình … Bảng 11: Phương pháp cố định không cố định tế bào sản xuất… Bảng 12: So sánh hoạt tính inulinase đạt điều kiện khác Trang Trang 10 11 25 27 40 41 41 43 43 44 53 55 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn MỤC LỤC HÌNH Hình Hình 1: Cơng thức cấu tạo inulin Hình 2: Quy trình sản xuất inulin Hình : Cấu trúc enzyme inulinase Hình 4: Cơ chế thủy phân inulin inulinase Hình 5: Vi sinh vật Kluyvermyces marxianus Hình 6: Sơ đồ khối quy trình cơng nghệ sản xuất inulinase Hình 7: Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20 Hình 8: Thiết bị nhân giống Hình 9: Thiết bị lên men Hình 10: Ảnh hưởng nguồn carbon inulin(a), Ảnh hưởng nguồn carbon khác(b) với inulin chất cảm ướng cho sản xuất inulinase Hình 11: Ảnh hưởng nguồn nitơ Hình 12: Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính bề mặt tới hoạt tính inulinase Hình 13: Thiết bị li tâm lắng Hình 14: Thiết bị kết tủa Hình 15: Cơ chế thẩm tách Hình 16: Cơ chế sắc ký trao đổi ion Hình 17: Thiết bị trao đổi ion Trang 12 15 17 19 21 22 Hình 18: Sắc ký lực Hình 19: May sấy phun chân khơng giai đoạn Hình 20: Ảnh hưởng inulin… Hình 21: Ảnh hưởng dịch bắp… 36 37 45 45 Hình 22: Ảnh hưởng inulin … Hình 23: Hoạt tính inulinase số tế bào sống theo thời gian Hình 24: Ảnh hưởng pH… 46 47 51 Trang 24 26 28 30 32 34 34 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn I GIỚI THIỆU Inulin 1.1 Định nghĩa Inulin polysaccharide có nguồn gốc từ thực vật,là nguồn chất phong phú cho trình sản xuất HFS từ vi sinh vật, tan nước.đây thành tựu quan trọng thực phẩm, đồ uống y dược 1.2 Công thức cấu tạo - Về mặt hóa học, Inulin – thuộc loại fructan polymer mạch thẳng với monomer chủ yếu carbohydrate, liên kết b - (2,1) fructosyl - fructose Fructose loại monomer cấu trúc Inulin Bắt đầu nửa phân tử a-D-glucose tồn không cần thiết Gpy Fn [glucopyranosyl-(fructofuransoyl)n -fructose] Fpy F n [fructopyranosyl-(fructofuranosyl)n -fructose] hợp chất kể đến danh pháp; chúng hỗn hợp oligomer polymer tốt đặc trưng mức độ polymer hóa ( DP), giá trị trung bình (DPav ) tối đa (DPmax) - Công thức phân tử C H10n+2O5n+1 6n Các đơn vị fructosyl inulin liên kết với chuỗi polymer kết thúc gốc glucose cuối mạch Inulin Hình Cơng thức cấu tạo inulin 1.3 Nguồn thu nhận - Inulin thu nhận từ Jerusalem artichoke, rau diếp xoăn, thược dược… - Inulin thủy phân enzyme inulinase Trang Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình Quy trình sản xuất inulin 1.4 Ứng dụng - Inulin coi nguồn carbohydrate tốt Tại Hoa Kỳ, gọi GRAS, an toàn cho người mức tiêu thụ trung bình hàng ngày ước tính từ đến 11 g Châu Âu từ đến g Hoa Kỳ Trong y học, Inulin chống lại thủy phân acid tương tác enzym tuyến tụy, khơng thay đổi đường ruột, nơi sử dụng nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn probiotic Điều lý giải Inulin khơng làm tăng glycaemia, khơng có ảnh hưởng đến hàm lượng insulin máu, có mặt thể bệnh nhân tiểu đường tốt - Vì lợi ích sức khỏe nó, sử dụng thành phần thực phẩm nhiều loại thực phẩm chế biến Nó có nhiều chức như: giúp cải thiện hấp thu cân chất khoáng, làm giảm tăng lượng đường máu Lý để inulin sử dụng thực phẩm chế biến thay chất béo làm giàu chất xơ Như thay chất béo, cải thiện mùi vị, kết cấu, vị việc giảm bớt chất béo sản phẩm sữa nghèo chất béo Các sản phẩm ngũ cốc bánh ngọt, bánh mì, ngũ cốc dùng ăn sáng cải tiến cấu trúc độ giòn Sản phẩm thủy phân Inulin, oligofructose, không cải thiện kết cấu vị mà giúp tăng cường hương vị mùi vị trái sử dụng sữa chua nghèo chất béo kết hợp với độ cao Nó dùng đồ uống sữa giàu dinh dưỡng để nâng cao lượng chất xơ - Inulin ngày sử dụng phổ biến thực phẩm có tính dinh dưỡng thay đổi Mùi vị khoảng từ khơng vị đến (khoảng 10% vị đường / sucrose) Nó dùng để thay đường, chất béo, bột Điều đặc biệt thuận lợi inulin chiếm 1/3 tới 1/4 lượng đường Trang Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn carbohydrate khác 1/6 đến / lượng chất béo Nó làm tăng hấp thu Ca tăng hấp thu Mg đồng thời thúc đẩy phát triển vi khuẩn đường ruột Về mặt dinh dưỡng, coi dạng chất xơ hòa tan đơi xem probiotic, có khả ngăn ngừa ung thư ruột kết - Ngày công nghiệp, người ta sản xuất High fructose syrup từ inulin với hiệu suất thủy phân cao, sản phẩm quan trọng ngành thức uống nói riêng thực phẩm nói chung Enzyme inulinase 2.1 Định nghĩa - Enzyme inulinase (β-D-fructan fructanohydrolases) enzyme thủy phân liên kết β-2,1 liên kết β–2,6 inulin 2.2 Phân loại - Có loại enzyme inulinase: Exoinulinase (β-D-fructan fructohydrolase, EC 3.2.1.80) Endoinulinase (β -2,1-D-fructan fructanohydrolase, EC 3.2.1.7) Bảng Một vài tính chất inulinase từ lồi vi sinh vật khác 2.3 Các bậc cấu trúc chế xúc tác Hình Cấu trúc enzyme inulinase - Quá trình thủy phân inulin thành fructose: inulin hỗn hợp nhiều polyme với giá trị DP khác nồng độ khó xác định Cho nên để đánh giá trình thủy phân, người ta dựa vào hàm lượng đường fructose glucose tạo Trong trình thủy phân inulin xảy đồng thời chế hệ enzyme: exoinulinase, endoinulinase, invertase - Trong exoinulinase công vào liên kết β-2,1-fruto cắt fructose tận inulin cho fructosevà endoinulinase công vào liên kết β-2,6inulooligosaccharides (IOSs) (hình ) Trang Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình Cơ chế thủy phân inulin inulinase 2.4 Ứng dụng a Sản xuất Ultra-high-fructose syrup (UHFS) từ inulin - Fructose syrup có lợi bệnh nhân tiểu đường, làm tăng hấp thu sắt trẻ em, có độ cao, sử dụng để bổ sung vào phần ăn người béo Trang Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn phì, kích thích hấp thụ canxi phụ nữ mãn kinh, kích thích tăng trưởng hệ vi khuẩn Bifidobacteria ruột già ruột non, ngăn ngừa bệnh ung thư ruột kết, sử dụng thay cho chất béo người ăn kiêng Fructose sử dụng rộng rãi nhiều loại thực phẩm, dược phẩm, đồ uống nhẹ thay cho sucrose Tuy nhiên, phương pháp hóa học để sản xuất fructose bị hạn chế Fructose sản xuất từ tinh bột phương pháp enzym bao gồm: α-amylase, amyloglucosidase, glucose isomerase Và người ta thấy cách tốt sử dụng vi sinh vật inulinase, phương pháp thủy phân bậc inulin, hiệu suất thu sau trình thủy phân 95% fructose Vì vậy, exoinulinase từ nhiều lồi vi sinh vật khác sử dụng để sản xuất Ultra high - fructose syrup (UHFS) từ inulin từ nguyên liệu có chứa inulin - Có điều thú vị đáng ý có monosaccharide (glucose fructose) thu nhận từ inulin hoạt tính inulinases từ hai chủng nấm men C aureus G7a and P guilliermondii Vì vậy, inulinases từ hai chủng nấm men có tiềm lớn việc thủy phân trực tiếp inulin thực phẩm ngành công nghiệp lên men Các monosaccharide oligosaccharide phát sau thủy phân inulin exoinulinase sản xuất K marxianus var bulgaricus b Sản xuất ethanol từ inulin - Ethanol ứng dụng làm nhiên liệu sinh học khí đốt Nó nguyên liệu lý tưởng cho hóa tổng hợp - Jerusalem artichoke nguyên vật liệu tốt để sản xuất nhiên liệu ethanol Chủng Saccharomyces cerevisiae sử dụng cho việc sản xuất đồng thời ethanol fructose từ hỗn hợp glucose/fructose từ dịch thủy phân Jerusalem artichoke Điều cho phép sản xuất 5g ethanol/lít 48g đường/lít chứa đến 99% fructose từ pha lỗng dịch thủy phân Jerusalem artichoke có chứa 60g đường/lít - Ethanol sản xuất từ Jerusalem artichoke cách sử dụng K fragilis với hoạt tính inulinase, từ nấm men thương mại S cerevisiae, từ vi khuẩn Zymomonas mobilis Công nghiệp sản xuất ethanol S cerevisiae vi khuẩn, Z mobilis trình lên men trộn với nấm men có hoạt tính inulinase, cụ thể K fragilis, hàm lượng sản phẩm thu nhận tăng lên 12% so với phương pháp sử dụng loại vi sinh vật c Sản xuất Oligofructan từ inulin - Fructooligosaccharide thành phần phổ biến cấu thành nên thực phẩm chức có tính chất tăng cường hệ vi sinh vật bifidogenic đường ruột Inulin thủy phân cách chọn lọc inulinase tạo IOSs inulotriose and inulotetraose Các Inulooligosaccharide có cấu trúc chức tương tự fructooligosaccharide, tác động có lợi người động vật Trang Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn - Khi endoinulinase sử dụng cho thủy phân Inulin, fructooligosaccharide sản xuất q trình thủy phân bậc, suất 80% - Ngoài ứng dụng trên, inulinase sử dụng để sản xuất chất khác như: gluconic acid, sorbitol, pupulan, acetone butanol Vi sinh vật Có nhiều loại vi sinh vật sử dụng để sản xuất inulinase: nấm men, nấm mốc, vi khuẩn Bảng Một số vi sinh vật sử dụng để sinh tổng hợp inulinase Trang 10 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Bảng Một vài tính chất inulinase từ loài vi sinh vật khác Sự ảnh hưởng vi sinh vật lên khối lượng phân tử inulinin: - Hầu hết inulinases từ nấm mốc có khối lượng phân tử lớn 50,0 kDA (Pandey et al 1999) Ví dụ, khối lượng phân tử inulinase tinh từ canh trường lên men nấm men C aureus G7a ước tính 60,0 kDA (Sheng et al 2008b) khối lượng phân tử inulinase tinh từ P guilliermondii ước tính 50,0 kDA (Gong et al 2008) Tuy nhiên, inulinase ngoại bào từ nấm men K fragilis có khối lượng phân tử 250 kDA - Khối lượng phân tử exoinulinase tinh từ vi khuẩn ước tính khoảng 54,0 KDA (Tsujimoto et al 2003; Kwon et al 2000) Điều cho thấy khối lượng phân tử exoinulinases từ vi khuẩn gần giống với khối lượng phân tử exoinulinases từ nấm men - Các endoinulinases từ nấm mốc vi khuẩn tinh mơ tả Ví dụ, endoinulinase sản xuất Penicillium sp TN-88 có khối lượng phân tử 68,0 kDA (Nakamura et al 1997) Trong khối lượng phân tử endoinulinase ngoại bào từ Arthrobacter sp S37 75 kDA (Kang et al 1998) 3.1 Nhóm vi sinh vật sử dụng để sản xuất inulinase Chủng : Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Trang 11