Đề tài thu nhận inulinase

Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Mục lục Trang I Giới thiệu 1.1 Inulin 1.2 Định nghĩa 1.3 Công thức cấu tạo 1.4 Nguồn thu nhận 1.5 Ứng dụng Enzyme inulinase 2.1 Định nghĩa 2.2 Phân loại 2.3 Các bậc cấc trúc chế xúc tác 2.4 Ứng dụng Vi sinh vật 3.1 Nhóm vi sinh vật sử dụng sinh tổng hợp inulinase 3.2 Đặc điểm sinh lý II Quy trình cơng nghệ III Giải thích quy trình cơng nghệ Chuẩn bị môi trường Tiệt trùng môi trường Chuẩn bị giống Nhân giống Cấy giống Lên men Tinh 7.1 Ly tâm lần 7.2 Kết tủa 7.3 Ly tâm lần 7.4 Hòa tan kết tủa 7.5 Thẩm tách 7.6 Trao đổi sắc ký ion 7.7 Trao đổi sắc ký lực 7.8 Sấy IV Sản phẩm V Thành tựu công nghệ VI Tài liệu tham khảo Trang 5 5 7 7 11 11 12 14 16 16 16 18 18 20 20 28 28 29 30 31 31 32 35 36 38 38 56 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn MỤC LỤC BẢNG Bảng Bảng 1: Một số vi sinh vật sử dụng để sinh tổng hợp inulinase Bảng 2: Một vài tính chất inulinase từ loài vi sinh vật… Bảng 3: Sự ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính enzyme Bảng 4: Sự kết hợp thành phần tối ưu môi trường Bảng 5: Các thành phần mơi trường dựa mơ hình… Bảng 6: Mơ hình thực nghiệm sử dụng phương pháp Plackett – burman Bảng 7: Bảng 8: Thành phần dinh dưỡng bổ sung vào môi trường chất rắn Bảng 9: Mơ hình thực nghiệm cho tối ưu hóa nồng độ thành phần… Bảng 10: Phân tích kết biến số thực nghiệm mơ hình … Bảng 11: Phương pháp cố định không cố định tế bào sản xuất… Bảng 12: So sánh hoạt tính inulinase đạt điều kiện khác Trang Trang 10 11 25 27 40 41 41 43 43 44 53 55 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn MỤC LỤC HÌNH Hình Hình 1: Cơng thức cấu tạo inulin Hình 2: Quy trình sản xuất inulin Hình : Cấu trúc enzyme inulinase Hình 4: Cơ chế thủy phân inulin inulinase Hình 5: Vi sinh vật Kluyvermyces marxianus Hình 6: Sơ đồ khối quy trình cơng nghệ sản xuất inulinase Hình 7: Thiết bị tiệt trùng liên tục YHC-20 Hình 8: Thiết bị nhân giống Hình 9: Thiết bị lên men Hình 10: Ảnh hưởng nguồn carbon inulin(a), Ảnh hưởng nguồn carbon khác(b) với inulin chất cảm ướng cho sản xuất inulinase Hình 11: Ảnh hưởng nguồn nitơ Hình 12: Ảnh hưởng chất hoạt động bề mặt tới hoạt tính bề mặt tới hoạt tính inulinase Hình 13: Thiết bị li tâm lắng Hình 14: Thiết bị kết tủa Hình 15: Cơ chế thẩm tách Hình 16: Cơ chế sắc ký trao đổi ion Hình 17: Thiết bị trao đổi ion Trang 12 15 17 19 21 22 Hình 18: Sắc ký lực Hình 19: May sấy phun chân khơng giai đoạn Hình 20: Ảnh hưởng inulin… Hình 21: Ảnh hưởng dịch bắp… 36 37 45 45 Hình 22: Ảnh hưởng inulin … Hình 23: Hoạt tính inulinase số tế bào sống theo thời gian Hình 24: Ảnh hưởng pH… 46 47 51 Trang 24 26 28 30 32 34 34 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn I GIỚI THIỆU Inulin 1.1 Định nghĩa Inulin polysaccharide có nguồn gốc từ thực vật,là nguồn chất phong phú cho trình sản xuất HFS từ vi sinh vật, tan nước.đây thành tựu quan trọng thực phẩm, đồ uống y dược 1.2 Công thức cấu tạo - Về mặt hóa học, Inulin – thuộc loại fructan polymer mạch thẳng với monomer chủ yếu carbohydrate, liên kết b - (2,1) fructosyl - fructose Fructose loại monomer cấu trúc Inulin Bắt đầu nửa phân tử a-D-glucose tồn không cần thiết Gpy Fn [glucopyranosyl-(fructofuransoyl)n -fructose] Fpy Fn [fructopyranosyl-(fructofuranosyl)n -fructose] hợp chất kể đến danh pháp; chúng hỗn hợp oligomer polymer tốt đặc trưng mức độ polymer hóa ( DP), giá trị trung bình (DPav ) tối đa (DPmax) - Công thức phân tử C6nH10n+2O5n+1 - Các đơn vị fructosyl inulin liên kết với chuỗi polymer kết thúc gốc glucose cuối mạch Inulin Hình Cơng thức cấu tạo inulin 1.3 Nguồn thu nhận - Inulin thu nhận từ Jerusalem artichoke, rau diếp xoăn, thược dược… - Inulin thủy phân enzyme inulinase Trang Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình Quy trình sản xuất inulin 1.4 Ứng dụng - Inulin coi nguồn carbohydrate tốt Tại Hoa Kỳ, gọi GRAS, an toàn cho người mức tiêu thụ trung bình hàng ngày ước tính từ đến 11 g Châu Âu từ đến g Hoa Kỳ Trong y học, Inulin chống lại thủy phân acid tương tác enzym tuyến tụy, khơng thay đổi đường ruột, nơi sử dụng nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn probiotic Điều lý giải Inulin khơng làm tăng glycaemia, khơng có ảnh hưởng đến hàm lượng insulin máu, có mặt thể bệnh nhân tiểu đường tốt - Vì lợi ích sức khỏe nó, sử dụng thành phần thực phẩm nhiều loại thực phẩm chế biến Nó có nhiều chức như: giúp cải thiện hấp thu cân chất khoáng, làm giảm tăng lượng đường máu Lý để inulin sử dụng thực phẩm chế biến thay chất béo làm giàu chất xơ Như thay chất béo, cải thiện mùi vị, kết cấu, vị việc giảm bớt chất béo sản phẩm sữa nghèo chất béo Các sản phẩm ngũ cốc bánh ngọt, bánh mì, ngũ cốc dùng ăn sáng cải tiến cấu trúc độ giòn Sản phẩm thủy phân Inulin, oligofructose, không cải thiện kết cấu vị mà giúp tăng cường hương vị mùi vị trái sử dụng sữa chua nghèo chất béo kết hợp với độ cao Nó dùng đồ uống sữa giàu dinh dưỡng để nâng cao lượng chất xơ - Inulin ngày sử dụng phổ biến thực phẩm có tính dinh dưỡng thay đổi Mùi vị khoảng từ khơng vị đến (khoảng 10% vị đường / sucrose) Nó dùng để thay đường, chất béo, bột Điều đặc biệt thuận lợi inulin chiếm 1/3 tới 1/4 lượng đường Trang Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn carbohydrate khác 1/6 đến / lượng chất béo Nó làm tăng hấp thu Ca tăng hấp thu Mg đồng thời thúc đẩy phát triển vi khuẩn đường ruột Về mặt dinh dưỡng, coi dạng chất xơ hòa tan đơi xem probiotic, có khả ngăn ngừa ung thư ruột kết - Ngày công nghiệp, người ta sản xuất High fructose syrup từ inulin với hiệu suất thủy phân cao, sản phẩm quan trọng ngành thức uống nói riêng thực phẩm nói chung Enzyme inulinase 2.1 Định nghĩa - Enzyme inulinase (β-D-fructan fructanohydrolases) enzyme thủy phân liên kết β-2,1 liên kết β–2,6 inulin 2.2 Phân loại - Có loại enzyme inulinase: Exoinulinase (β-D-fructan fructohydrolase, EC 3.2.1.80) Endoinulinase (β -2,1-D-fructan fructanohydrolase, EC 3.2.1.7) Bảng Một vài tính chất inulinase từ lồi vi sinh vật khác 2.3 Các bậc cấu trúc chế xúc tác Hình Cấu trúc enzyme inulinase - Quá trình thủy phân inulin thành fructose: inulin hỗn hợp nhiều polyme với giá trị DP khác nồng độ khó xác định Cho nên để đánh giá trình thủy phân, người ta dựa vào hàm lượng đường fructose glucose tạo Trong trình thủy phân inulin xảy đồng thời chế hệ enzyme: exoinulinase, endoinulinase, invertase - Trong exoinulinase công vào liên kết β-2,1-fruto cắt fructose tận inulin cho fructosevà endoinulinase công vào liên kết β-2,6inulooligosaccharides (IOSs) (hình ) Trang Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình Cơ chế thủy phân inulin inulinase 2.4 Ứng dụng a Sản xuất Ultra-high-fructose syrup (UHFS) từ inulin - Fructose syrup có lợi bệnh nhân tiểu đường, làm tăng hấp thu sắt trẻ em, có độ cao, sử dụng để bổ sung vào phần ăn người béo Trang Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn phì, kích thích hấp thụ canxi phụ nữ mãn kinh, kích thích tăng trưởng hệ vi khuẩn Bifidobacteria ruột già ruột non, ngăn ngừa bệnh ung thư ruột kết, sử dụng thay cho chất béo người ăn kiêng Fructose sử dụng rộng rãi nhiều loại thực phẩm, dược phẩm, đồ uống nhẹ thay cho sucrose Tuy nhiên, phương pháp hóa học để sản xuất fructose bị hạn chế Fructose sản xuất từ tinh bột phương pháp enzym bao gồm: α-amylase, amyloglucosidase, glucose isomerase Và người ta thấy cách tốt sử dụng vi sinh vật inulinase, phương pháp thủy phân bậc inulin, hiệu suất thu sau trình thủy phân 95% fructose Vì vậy, exoinulinase từ nhiều lồi vi sinh vật khác sử dụng để sản xuất Ultra high - fructose syrup (UHFS) từ inulin từ nguyên liệu có chứa inulin - Có điều thú vị đáng ý có monosaccharide (glucose fructose) thu nhận từ inulin hoạt tính inulinases từ hai chủng nấm men C aureus G7a and P guilliermondii Vì vậy, inulinases từ hai chủng nấm men có tiềm lớn việc thủy phân trực tiếp inulin thực phẩm ngành công nghiệp lên men Các monosaccharide oligosaccharide phát sau thủy phân inulin exoinulinase sản xuất K marxianus var bulgaricus b Sản xuất ethanol từ inulin - Ethanol ứng dụng làm nhiên liệu sinh học khí đốt Nó nguyên liệu lý tưởng cho hóa tổng hợp - Jerusalem artichoke nguyên vật liệu tốt để sản xuất nhiên liệu ethanol Chủng Saccharomyces cerevisiae sử dụng cho việc sản xuất đồng thời ethanol fructose từ hỗn hợp glucose/fructose từ dịch thủy phân Jerusalem artichoke Điều cho phép sản xuất 5g ethanol/lít 48g đường/lít chứa đến 99% fructose từ pha lỗng dịch thủy phân Jerusalem artichoke có chứa 60g đường/lít - Ethanol sản xuất từ Jerusalem artichoke cách sử dụng K fragilis với hoạt tính inulinase, từ nấm men thương mại S cerevisiae, từ vi khuẩn Zymomonas mobilis Công nghiệp sản xuất ethanol S cerevisiae vi khuẩn, Z mobilis trình lên men trộn với nấm men có hoạt tính inulinase, cụ thể K fragilis, hàm lượng sản phẩm thu nhận tăng lên 12% so với phương pháp sử dụng loại vi sinh vật c Sản xuất Oligofructan từ inulin - Fructooligosaccharide thành phần phổ biến cấu thành nên thực phẩm chức có tính chất tăng cường hệ vi sinh vật bifidogenic đường ruột Inulin thủy phân cách chọn lọc inulinase tạo IOSs inulotriose and inulotetraose Các Inulooligosaccharide có cấu trúc chức tương tự fructooligosaccharide, tác động có lợi người động vật Trang Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn - Khi endoinulinase sử dụng cho thủy phân Inulin, fructooligosaccharide sản xuất q trình thủy phân bậc, suất 80% - Ngoài ứng dụng trên, inulinase sử dụng để sản xuất chất khác như: gluconic acid, sorbitol, pupulan, acetone butanol Vi sinh vật Có nhiều loại vi sinh vật sử dụng để sản xuất inulinase: nấm men, nấm mốc, vi khuẩn Bảng Một số vi sinh vật sử dụng để sinh tổng hợp inulinase Trang 10 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Bảng Một vài tính chất inulinase từ loài vi sinh vật khác Sự ảnh hưởng vi sinh vật lên khối lượng phân tử inulinin: - Hầu hết inulinases từ nấm mốc có khối lượng phân tử lớn 50,0 kDA (Pandey et al 1999) Ví dụ, khối lượng phân tử inulinase tinh từ canh trường lên men nấm men C aureus G7a ước tính 60,0 kDA (Sheng et al 2008b) khối lượng phân tử inulinase tinh từ P guilliermondii ước tính 50,0 kDA (Gong et al 2008) Tuy nhiên, inulinase ngoại bào từ nấm men K fragilis có khối lượng phân tử 250 kDA - Khối lượng phân tử exoinulinase tinh từ vi khuẩn ước tính khoảng 54,0 KDA (Tsujimoto et al 2003; Kwon et al 2000) Điều cho thấy khối lượng phân tử exoinulinases từ vi khuẩn gần giống với khối lượng phân tử exoinulinases từ nấm men - Các endoinulinases từ nấm mốc vi khuẩn tinh mơ tả Ví dụ, endoinulinase sản xuất Penicillium sp TN-88 có khối lượng phân tử 68,0 kDA (Nakamura et al 1997) Trong khối lượng phân tử endoinulinase ngoại bào từ Arthrobacter sp S37 75 kDA (Kang et al 1998) 3.1 Nhóm vi sinh vật sử dụng để sản xuất inulinase Chủng : Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Trang 11 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn độ ba nhân tố tăng lên mô hình Box-Behnken Bảng đưa mức thay đổi khác Bảng Thành phần dinh dưỡng bổ sung vào mơi trường chất rắn Bảng Mơ hình thực nghiệm cho tối ưu hóa nồng độ thành phần mơi trường Bảng đưa mơ hình kết thực nghiệm thực theo mô hình BoxBehnken Kết đạt được kiểm tra theo ANOVA gói SAS phương trình hồi quy đưa sau: Trang 43 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Trong Y1 – hiệu suất sản xuất inulinase, X1 – nồng độ inulin, X2 – nồng độ dịch bắp, X3 – nồng độ (NH4)2SO4 ANOVA mơ hình hồi quy cấp diễn tả rằng: phương trình * mơ hình quan trọng, chứng từ hệ số Fisher với giá trị xác suất thấp [(pmodel > F) = 0.001261](bảng 10) Tính chất phù hợp mơ hình kiểm tra hệ số tương quan (R2) Trong trường hợp (R2 = 0.978) có 2.2% biến đổi tồn khơng giải thích mơ hình.Giá trị hệ số xác định điều chỉnh (AdjR2 = 0.9385) cao để tán thành cho mức ý nghĩa cao mơ hình Cùng thời điểm, giá trị thấp hệ số biến thiên (CV = 1.68%) chứng tỏ độ xác độ tin cậy tốt thí nghiệm tiến hành Trong số hạng phương trình, X2, X3, X12, X22 X32 có mức ý nghĩa với xác suất 99%, X1 có mức ý nghĩa với xác suất 95% (bảng 10) Tương tác X1, X2, X3 ảnh hưởng không đáng kể đến hiệu suất sản suất inulinase Sự phản hồi phù hợp với mơ hình hồi quy thể hình1 Bảng 10 Phân tích kết biến số thực nghiệm mơ hình Box - Behnken Trang 44 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình 20 Ảnh hưởng Inulin ( X1) dịch bắp ( X2) lên trình sản xuất inulinase ( Y1) ( bổ sung 1.61% (NH4)2SO4 ) Hình 21 Ảnh hưởng dịch bắp ( X2) (NH4)2SO4 ( X3 ) lên trình sản xuất inulinase ( Y1 ) ( bổ sung 12.72% inulin ) Trang 45 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình 22 Ảnh hưởng inulin ( X1 ) (NH4)2SO4 ( X3 ) lên trình sản xuất inulinase ( Y1 ) ( bổ sung 10.76% dịch bắp ) Biểu đồ không gian ba chiều sinh cho kết hợp đôi yếu tố cố định yếu tố mức tối ưu cho trình sản xuất inulinase Biểu đồ nêu bật vai trò yếu tố khác nhấn mạnh vai trò ràng buộc vật lý với phương diện tổng hợp sinh học hiệu suất cuối sinh tổng hợp inulinase Hoạt tính tối đa inulinase 412.0 U/g chất khơ (gds) nhận từ nồng độ ban đầu chất inulin, dịch bắp (NH4)2SO4 lấn lượt 12.72%, 10.76%, 1.61% Hoạt tính inulinase (409.8U/gds) mơi trường tối ưu từ (ví dụ 410.2; 409.6; 409.6 U/gds) trùng hợp với giá trị tiên đốn mơ hình chứng tỏ ngược với lên men bề sâu Nó đạt hiệu suất cao tài liệu từ trước đến Nồng độ cuối môi trường tối ưu hóa với RSM 12.72% inulin, 10.76% dịch bắp, 1.61% (NH4)2SO4 Các hợp chất carbon nguồn carbon skelelon lượng tế bào vi sinh vật, nguồn nitơ cung cấp nguyên tố N với tế bào chất cấu trúc khác tế bào Inulin nguồn carbon quan trọng mà tác nhân sản xuất inulinase bẳng vi sinh vật Kluyvermyces S120 Tuy nhiên nồng độ inulin cao gây ức chế trình dị hóa, làm giảm hiệu suất tổng hợp enzyme Điều thể hình Inulin chất khơng đắt có nhiều Trong cơng nghiệp thay chất Trang 46 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn chiết từ Jerusalem artichoke, rau diếp, thược dược Dịch bắp cung cấp nguồn nitơ, vitamin dưỡng chất khác cho môi trường, nguồn nitơ quan trọng sản xuất inulinase vi sinh vật Kluyvermyces S120 Dịch bắp nguồn nitơ tốt sản xuất inulinase bẳng giống Actinomycete Kluyvermyces SP.Y85 theo đường lên men chìm Tuy nhiên nồng độ dịch bắp cao làm giảm khả sinh inulinase hình 2, điều chất phức tạp dịch bắp vài thành phần nồng độ cao gây độc ức chế sản xuất inulinase NH4+ nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp inulinase hiệu NO3- thể so sánh việc bổ sung (NH4)2SO4 NH4 NO3 (bảng 3) Tuy nhiên nồng độ ammonium kìm hãm tổng hợp inulinase, điều thể hình Vì vậy, tăng nồng độ inulin, dịch bắp hay (NH4)2SO4 môi trường gây ức chế sinh tổng hợp inulinase dù sinh trưởng tế bào tiếp tục tăng chậm Mặt khác giảm nồng độ thành phần môi trường sinh trưởng tế bào sinh tổng hợp inulinase giảm nhanh chóng Hình 23 Hoạt tính inulinase ( )và số tế bào sống( )theo thời gian Trang 47 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn  Thời gian lên men Thời gian lên men môi trường tối ưu điều chỉnh 120h ( hình 4) Sau khoảng 12h, sinh trưởng tế bào tăng nhanh đáng kể hình thành sinh khối, inulinase tạo thành tăng đột ngột sau 12h Số tế bào sống cực đại 4.3 109 CFU/gds sau 84h Sau số tế bào giảm mơi trường dinh dưỡng cạn kiệt ức chế q trình dị hóa suốt q trình ni cấy kéo dài Hoạt tính tối đa inulinase 409.2U/gds sau 96h Do giảm sinh trưởng tế bào sau 84h giảm inulinase enzyme tự phân, thời gian chọn để sản xuất inulinase bẳng Kluyvermyces S120 96h Kết luận Sử dụng RSM xác định mơi trường tối ưu để sản xuất inulinase với hiệu suất cao cho Kluyvermyces S120 Thành phần môi trường lên men bề mặt (SSF) 12.72% inulin, 10.76% dịch bắp, 1.61% (NH4)2SO4 chất rắn cám lúa mì Ứng dụng mơi trường RSM, suất cực đại đạt 409.2U/gds Đây hiệu suất cao từ trước đến Sinh tổng hợp inulinase cách cố định khuẩn ty ( hệ sợi) Aspergillus Niger  Bào tử đính Aspergillus Niger 20 Osm sản xuất inulinase ngoại bào cố định đá bọt vật liệu xốp polyurethane sử dụng trình lên men mẻ nhiều lần số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp inulinase cố định khuẩn ty Aspergillus Niger 20 Osm đá bọt nghiên cứu Lượng inulinase tối đa xảy 50 ml môi trường chứa 0.5g chất mang 300C, pH 6.0, tốc đậ khuấy trộn 200rpm Quá trình sản xuất sản xuất enzyme nhiều mẻ, lên men mẻ, mẻ 24h Đây báo cáo sinh tổng hợp inulinase cách cố định bào tử đính A niger vật liệu xốp polyurethan sử dụng bão hịa oxy khơng thơng thường canh trường đảm bảo nồng độ oxy hòa tan liên tục  Vật liệu phương pháp Giống môi trường - Biến thể Aspergillus Niger 20 Osm - Giống có đặc tính có khả sản xuất hoạt tính inulinase cao lên men chìm - Giống giữ trên môi trường thạch malt nghiêng 40C sinh trưởng môi trường với (g/l): sucrose 33.3, chất chiết nấm men 19.7, NaNO3 3.65, K2HPO4 2.6, MgSO4.7H2O 0.15 Trang 48 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Chuẩn bị bào tử Aspergillus Niger 20 Osm cho cố định tế bào Aspergillus Niger 20 Osm sinh trưởng môi trường malt Sau ngày phát triển 300C, bào tử thu nhận, rửa lần với đệm Mellvain 0.1M tiệt trùng, pH 5.0, lọc qua thủy tinh để lọc bỏ cặn Bào tử sau trạng thái lơ lửng pha lỗng dung dịch đệm để đạt 7.8 107 bào tử/ml Vật liệu cố định Hạt đá bọt (BDH Chemical Ltd, UK),10 – 24 mesh, vật liệu xốp polyurethane đường kính 9cm, dày 0.8cm đường kính trung bình lỗ xốp 0.3mm Thử nghiệm cố định Thử nghiệm Cố định bào tử A niger thực bình nón có lắc đảo 300ml, bình chứa 0.3 g đá bọt đĩa quay dán chặt với vật liệu xốp polyurethane tiệt trùng 30 phút nồi hấp tiệt trùng áp suất 0.075MPa sử dụng để cố định bào tử Huyền phù bào tử từ ống nghiêng (20ml 1.61 củ dung dịch đệm 0.1M Mellvaine, pH 5.0)được đổ vào thiết bị phản ứng chứa vật liệu xốp polyurethane Huyền phù ủ 300C 24h sau thời gian bào tử khơng hấp phụ tách khỏi chất mang, sau rửa hai lần với nước cất 1.6L môi trường cho vào thiết bị phản ứng Điều kiện sinh trưởng Bào tử đính A niger cố định đá bọt sinh trưởng bình lắc đảo 200 rpm đến ngày Môi trường thay môi trường tiệt trùng sau 24h suốt thời kì Được cố định vật liệu xốp polyurethane, bào tử đính sinh trưởng bình lên men thủy tinh 2L ( Biostat B, B Braun Biotech International GmbH, Germany) chứa đầy 1.6L môi trường 12 ngày 300C (200rpm) Môi trường thay môi trường tiệt trùng sau 48h lần suốt thời kì Sản lượng inulinase xác định sau 24h Lưu lượng oxy cung cấp (1 l /phút) khuấy trộn 200 rpm thiết bị phản ứng không cố định tế bào thực 96h 300C có thiết bị chống tạo bọt pH giữ 6.0 việc thêm NaOH 0.1M Nồng độ oxy hòa tan dịch lên men đo điện cực Ingold (Mettler – Toledo GmbH) Giá trị đọc phần trăm mức cua bão hòa Nồng độ oxy hịa tan mơi trường bão hịa oxy không thông thường điều khiển tự động dụng cụ nhân tạo mới, có khả đo liều lượng H2O2 oxy môi trường từ – 100% Hỗn hợp phản ứng chứa 0.1ml canh trường pha lỗng thích hợp 0.5% (w/v) inulin hịa tan dịch đệm acetate 0.1M (pH 5.0) ủ 500C sau 20 phút ủ tăng hàm lượng đường khử đánh giá phương pháp acid 3,5 – dinitrosalicylic Sự hấp thu Trang 49 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn đo bước sóng 550 nm Một đơn vị hoạt tính inulinase xác định lượng enzyme để sản xuất mol đường khử/phút điều kiện Hoạt tính xúc tác đo quang phổ cách quan sát giảm hấp thu ánh sáng bước sóng 525 nmtrong suốt trình phân hủy H2O2 enzyme Hàm lượng protein môi trường dịch lọc canh trường xác định phương pháp Schacterle Pollack Để xác định hàm lượng chất khơ, tồn lượng vật chất bình phản ứng qua giấy lọc sấy khô đến khối lượng không đổi Hàm lượng sinh khối khô xác định từ khác bào tử dính cộng chất mang có chất mang Q trính lên men thực bơ ba bình canh trường phân tích tiến hành lặp Dữ liệu đưa trung bình phép đo Sai số chuẩn trung bình cho đánh giá inulinase 0.23và khoảng giá trị 0.003 đến 0.36 U/ml Kết thảo luận Quá trình sản xuất inulinase công nghiệp hay báo cáo khoa học bao gồm lên men chìm lên men bề mặt Giữa chất, inulin sucrose sử dụng nguồn carbon thích hợp Nói chung inulin chất tốt để sản xuất inulinase Nhưng vi sinh vật tiết hoạt tính inulinase hoạt tính invertase, sucrose xem nguồn carbon tốt để sản xuất enzyme Vì giá thành inulin cao sucrose nên sucrose sử dụng cho nghiên cứu tối ưu Đây chất thay đáng quan tâm sucrose có khả hịa tan cao, rẻ thành phần mật rỉ, nguyên liệu hấp dẫn lên men với suất lớn, inulin có sẵn lượng giới hạn giá thành cao Thực nghiệm liên quan cố định bào tử A niger trình hấp phụ vậ lý lên đá bọt vật liệu xốp polyurethane Trong giai đoạn đầu vài điều kiện pH môi trường, lượng chất mang, thể tích mơi trường nhiệt độ tốc độ khuấy trộn thay đổi để tối ưu điều kiện để sản xuất inulinase Trong tất thí nghiệm, mơi trường thay sau 24h, len men mẻ ba lần Hệ sợi nấm lỗ xốp mọc tràn bề mặt chất mang sản xuất inulinase A niger lúc đầu cố định bên chất mang, phát triển thành lớp dày đặc bề mặt chất mang quan sát rõ kính hiển vi điện tử Trang 50 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Hình 24 Ảnh hưởng pH ( A); Khối lượng chất mang ( B); Thể tích mơi trường (C);Nhiệt độ ( D ); tốc độ khuấy ( E )lên sản xuất inulinase Trang 51 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn pH đầu môi trường, tối ưu cho sản xuất inulinase bào tử đính A niger cố định đá bọt 6.0 ( hình 24A) tương tự trình sản xuất inulinase bào tử tự Hoạt tính inulinase cao việc cố định 2.0 g chất mang lượng sinh khối lớn tích lũy Nếu thêm vào lượng chất mang hoạt tính enzyme giảm (hình 24B) Hoạt tính enzyme tối đa xảy mẻ len men thứ hai sử dụng 50ml môi trường (hình 23C) Hoạt tính inulinase cố định bào tử đính tăng nhiệt độ đạt 300C, giảm 350C (hình 24D) điều trùng sản xuất inulinase bào tử tự do, nhiệt độ tối ưu để sản xuất inulinase là300C Tốc độ khuấy trộn tối ưu 200 rpm (hình 24E) sau mẻ lên men thực hoạt tính inulinase tăng mẻ thứ sau giảm chậm (hình 24F) Để đánh giá tiềm sản xuất thật biến thể, bắt đầu khảo sát thiết bị phản ứng cần thiết Thật sự, giai đoạn thường nhận dấu hiệu hữu ích phía tính ổn định trình sản xuất thừa biến thể phía tính thực thi việc thiết kế quy mô sản xuất lớn Trang 52 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Bảng 11 Phương pháp cố định không cố định tế bào sản xuất inulinase từ A.Niger 20 Osm Một thông số quan trọng q trình lên men hiếu khí cần đạt nồng độ tối ưu oxy hòa tan (DO) DO giới hạn để xác định khả tối ưu vi sinh vật thay đổi phụ thuộc vào sản phảm mong muốn cuối Giới hạn oxy canh trường tùy thuộc vào tỷ trọng bào tử đính, nồng độ nguồn carbon giá trị pH Sản xuất inulinase A niger chịu ảnh hưởng rõ rệt nồng độ DO pha lỏng Bổ sung H2O2 nêu thêm phương pháp thay để tăng nồng độ oxy hòa tan hiệu suất sản xuất inulinase Sản xuất inulinase bào tử Aspergillus Niger 20 Osm trường hợp bào tử tự hay cố định vật liệu xốp polyurethane, nghiên cứu bình phản ứng 2l sử dụng canh trường bão hịa oxy thơng thường khơng thơng thường Hoạt tính enzyme inulinase bào tử tự tăng suốt trình sục khí tơng thường, đạt giá trị tối đa 22.1 (U/ml) sau 96h lên men (hình 24A) Ngược lại điều kiện sục khí khơng thơng Trang 53 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn thường hoạt tính enzyme bào tử tự tăng chậm, giá trị cực đại 3.4 (U/ml) khoảng 48h lên men Nghiên cứu sinh khối canh trường bão hịa oxy với H2O2 so với canh trường sục oxy thơng thường (hình 24 B) Điều gây ức chế oxy tác động mạnh tới kìm hãm phát triển bào tử tự sản xuất enzyme Trong suốt q trình sục khí thơng thường, giảm mạnh nồng độ oxy canh trường (từ 100% đến 70% 0% sau 24h 48h) quan sát, canh trường sục khí khơng thơng thường khơng gây thay đổi nồng độ oxy hòa tan (60 2%) Sự tang hoạt tính enzyme khơng phải lúc liên quan với hàm lượng protein cao canh trường lên men Ví chúng tơi suy đốn tăng hoạt tính enzyme thay đổi enzyme Một khả khác khả tận dụng protein môi trường Aspergillus Niger 20 Osm Sau 96h, lượng đường khử cao canh trường bão hịa oxy với H2O2 so với canh trường sục khí thơng thường Giảm hiệu ứng kìm hãm H2O2 lên sinh trưởng bào tử tự sản xuất inulinase anh trường bão hòa oxy, bào tử Aspergillus Niger 20 Osm cố định vật liêu xốp polyurethane Để thực mục đích này, thiết bị lên men trang bị đĩa gắn chặt với vật liêu xốp polyurethan Kết mẻ lên men trình bày hình 24C Kết tục nghiệm suất tạo inulinase tăng mẻ điều kiện sử dụng bào tử cố định bão hòa oxy với H2O2 Cố định vật liêu xốp polyurethan cho kết tốt có bền chất mang Sự tăng hoạt tính xúc tác sau mẻ thứ ba tích lũy đáng kể khối lượng khơ (13g/l) chứng tỏ bào tử cố định chịu ức chế oxy Khống có thay đổi đáng kể hàm lượng proteintrong mơi trường Có thể kết luận bào tử cố định A niger sản xuất inulinase thời gian ngắn khoảng 48h xa thời gian rút ngắn xuống 24h Hoạt tính inulinase tăng mẻ thứ đề xuất q trình lên men liên tục mẻ (hình 24 C ) Trong thiết bị lên men mẻ sử dụng bào tử cố định điều kiện sục khí bình thường, hoạt tính inulinase tăng đến me thứ ba 7.5 U/ml Tuy nhiên canh trường thể không kéo dài tích lũy bào tử cao 20.0 (g/l) xảy giải phóng bào tử tự vào môi trường Kết nghiên cứu so sánh với nghiên cứu trước Hoạt tính inulinase sản xuất bào tử cố định không cố định Aspergillus Niger 20 Osm nằm khoảng giá trị bào tử tự A.niger cao so với tổng hợp enzyme từ Penicillium purpurogenum Fusarium oxysporum Dựa vào bảng hệ thống đạt giảm thời gian sản xuất đáng kể hoạt tính inulinase cao suất sản xuất inulinase cao Hơn nữa, môi trường sản xuất inulinase mà đưa thành phân đơn giản so với môi trường trước Trang 54 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Bảng 12 So sánh hoạt tính inulinase đạt điều kiện khác Kết luận: Trong giới hạn thực nghiệm nghiên cứu này, sản xuất inulinase liên tục Bào tử cố định A niger sử dụng canh trường bão hòa oxy không thông thường sản xuất lượng inulinase lớn từ thiết lập bước đậu trình tổng hợp enzyme liên tục Sự cải thiện xa q trình đạt việc tối ưu hóa nồng độ oxy Cấn nhấn mạnh bão hịa oxy khơng thơng thường cho canh trường sử dụng lần cho sản xuất inulinase việc cố định bào tử A niger Quá trình lên men chống nhiễm vi sinh vật lạ có diện H2O2 Phương pháp canh trường bão hòa oxy cho phép tiến dần đến cân xác lượng oxy tiêu thụ hứa hẹn có ứng dụng rộng đặc biệt trường hợp vi sinh vật nhạy cảm trượt thể hoạt tính xúc tác Trang 55 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn V TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Ái, Công nghệ lên men ứng dụng công nghệ thực phẩm Nhà xuất đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Lê Ngọc Tú ( chủ biên) - Lê Văn Chứ - Đặng Thị Thư – Phạm Quốc Thăng-Nguyễn thị Kim Thịnh – Bùi Đức Hợi – Lưu Duẩn – Lê Dỗn Diên Hóa sinh cơngnghiệp.Nhà xuất khoa học kĩ thuật Hà Nội – 2002 R.S Singh *, Balwinder Singh Sooch, Munish Puri, Optimization of medium and process parameters for the production of inulinase from a newly isolated Kluyveromyces marxianus YS-1( From Carbohydrate and Protein Biotechnology Laboratory, Department of Biotechnology, Punjabi University, Patiala 147 002, India), Received July 2006; received in revised form 31 August 2006; accepted September 2006 Available online 27 October 2006 R.S Singh *, Rajesh Dhaliwal, Munish Puri, Production of inulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1using root extract of Asparagus racemosus, ( From Production of inulinase from Kluyveromyces marxianus YS-1using root extract of Asparagus racemosus, Punjabi University, Patiala 147002, Punjab, India), Received 17 December 2005; received in revised form 24 February 2006; accepted March 2006 Chen Xiong, Wang Jinhua, Li Dongsheng, Optimization of solid-state medium for the production of inulinase byKluyveromyces S120 using response surface methodology ( From College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Hubei Key Laboratory of Industrial Microbiology, Wuhan 430068, PR China), Received February 2006; received in revised form 31 October 2006; accepted December 2006 Andrelina M.P Santos1* and Francisco Maugeri, Synthesis of Fructooligosaccharides from Sucrose Using Inulinase from Kluyveromyces marxianus, ( From Laboratory Devices and Nanostructures (LDN), UFPE, C.P 7800, CEP 50711-970, Recife, PE, Brazil; Department of Food Engineering (FEA), UNICAMP, CEP 13081-970, Campinas, SP, Brazil) Received: December 19, 2005; Accepted: September 25, 2006 Prabhjot Kaur Gill, Rajesh Kumari Manhas, Prabhjeet Singh, Purification and properties of a heat-stable exoinulinase isoform from Aspergillus fumigatus ( From Department of Biotechnology, Guru Nanak Dev University, Amritsar 143 005, Punjab, India; Department of Microbiology, Guru Nanak Dev University, Amritsar 143 005, Punjab, India), Received 20 January 2005; received in revised form 22 April 2005; accepted 24 April 2005; Available online 16 June 2005 Trang 56 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Arun Dev Sharma, Prabhjot Kaur Gill, Purification and characterization of heatstable exo-inulinase from Streptomyces sp (From Department of Biotechnology, Lyallpur Khalsa College, Jallandhar 144001, Punjab, India; Department of Biotechnology, Lovely Institute of Higher Studies, Phagwara (Chehru), Punjab, India), Received 13 October 2005; accepted 10 April 2006; Available online 29 April 2006 Emanuele Ricca , Vincenza Calabro , Stefano Curcio, Gabriele Iorio, Fructose production by chicory inulin enzymatic hydrolysis:A kinetic study and reaction mechanism ( From Department of Engineering Modelling, University of Calabria, I-87030 Arcavacata di Rende (CS), Italy) 10 Prem P Sehgal and Aubrey W.Naylor, Purication and properties of urease derived from hydrated seeds of jack bean, Canavalia ensiformis (L), Plant Physiology 4, 567 – 572, Horsham, 1966 Các trang web: http://www.elsevier.com/locate/foodhyd http://www.sciencedirect.com http://www.chem.com.au/science/rheology/rheology http://www.mycologia.org/cgi/content/full/99/4/493 Trang 57 ... Cơng thức cấu tạo inulin 1.3 Nguồn thu nhận - Inulin thu nhận từ Jerusalem artichoke, rau diếp xoăn, thược dược… - Inulin thủy phân enzyme inulinase Trang Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt... đặc biệt thu? ??n lợi inulin chiếm 1/3 tới 1/4 lượng đường Trang Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn carbohydrate khác 1/6 đến / lượng chất béo Nó làm tăng hấp thu Ca tăng hấp thu Mg đồng... sản xuất inulinase: nấm men, nấm mốc, vi khuẩn Bảng Một số vi sinh vật sử dụng để sinh tổng hợp inulinase Trang 10 Thu nhận inulinase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn Bảng Một vài tính chất inulinase