Giới thiệu một số phương pháp tách ADN từ máu toàn phần - Tạp chí nghiên cứu y học pdf

TCNCYH 23 (3) 2003 Giới thiệu một số phơng pháp tách ADN từ máu toàn phần Lê Hoàn, Trần Khánh Chi, Phạm Thị Nguyệt Hằng, Bạch Khánh Hòa Đại học Y Hà Nội Tách chiết ADN là khâu cơ bản và rất quan trọng trong kỹ thuật sinh học phân tử. Chúng tôi đã tiến hành một số kỹ thuật tách chiết ADN từ máu ngoại vi: kỹ thuật Perchlorate sodium, kỹ thuật Acetate amonium, kỹ thuật QIA ampkit. Đồng thời so sánh các kỹ thuật đó với nhau dựa trên một số tiêu chuẩn. Kết quả cho thấy kỹ thuật Perchlorate sodium có nhiều u điểm nhất. Kỹ thuật này đang đợc sử dụng thờng qui tại Labo Trung tâm Y sinh học, Đại học Y Hà Nội. I. Đặt vấn đề ADN (Acid Deoxyribose Nucleic) là một đại phân tử đợc cấu thành từ các đơn phân là nucleotid. Trong cơ thể, tất cả các tế bào có nhân đều chứa phân tử ADN. Phân tử này mang toàn bộ thông tin di truyền của cá thể. Nguồn thông tin di truyền đó đợc ổn định nhờ hoạt động tự sao chép của ADN theo nguyên tắc bán bảo tồn". Đồng thời thông qua hoạt động của các bộ máy tế bào, nguồn thông tin này đợc chuyển sang các phân tử ARN thông tin ra ngoài bào tơng tổng hợp nên phân tử protein: ADN sao mã mARN dịch mã Protein Trên cơ sở đó, sinh học phân tử đã phát triển các kỹ thuật di truyền trên ADN vào nghiên cứu và chẩn đoán một số bệnh. Để thực hiện kỹ thuật này đòi hỏi phải có nguồn nguyên liệu ADN đảm bảo cả về chất và lợng. Vì vậy, tách chiết ADN là khâu đầu tiên, cơ bản và rất quan trọng trong các qui trình thao tác trên ADN. Với tầm quan trọng đó, đề tài này tiến hành ứng dụng một số kỹ thuật tách ADN khác nhau và so sánh chúng với nhau. Mục đích của đề tài là tìm ra một kỹ thuật phù hợp nhất với các tiêu chuẩn về: chất lợng ADN, hàm lợng ADN, thời gian tiến hành, chi phí thực hiện và mức độ độc hại đối với ngời thực hiện. II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng Máu ngoại vi chống đông bằng EDTA. 2. Phơng pháp nghiên cứu Thực hiện một số kỹ thuật tách ADN khác nhau với nguyên lý cơn bản gồm 4 bớc: Phá vỡ hồng cầu Phá vỡ bạch cầu Loại bỏ protein Tủa ADN 2.1. Kỹ thuật tách ADN bằng Perchlorate sodium (Kỹ thuật của S.A. Miller, D.D. Dykes, H.F. Polesky - 1988) Hoá chất: - Dung dịch I (cho 1 lít): Sucrose 0,3M 102g Tris HCl 1M pH7.5 10mM 10ml 2 TCNCYH 23 (3) 2003 MgCl 2 5mM 1g Triton 100 1% 10ml - Dung dịch II (cho 500ml): NaCl 0,0075M 2,19g EDTA 0,024M 4,46g - SDS (Sodium Dodecyle Sunfate) 10% - Perchlorate sodium 5M - NaCl 6M - Cồn tuyệt đối - Cồn 70% - T.E (cho 1lít) gồm: Tris HCl 1M pH8 10ml EDTA 0,5M pH8 2ml Qui trình tách: Phá vỡ hồng cầu: - Lấy 10ml máu chống đông bằng EDTA. - Thêm vào đó dung dịch I cho đủ 50ml. - Trộn đều, ly tâm 4200 vòng/ 10 phút/ 4 0 C. - Loại bỏ nớc nổi, thu đợc cặn trắng (nếu còn hồng cầu thì tiếp tục loại bỏ hồng cầu bằng dung dịch I). Phá vỡ bạch cầu: - Sau khi thu đợc cặn trắng cho thêm vào: 4,5ml dung dịch II 125àl SDS 10% 1,1ml perchlorate sodium 5M 10àl Proteinase K 10mg/ ml - Trộn đều, ủ 42 0 C/ 30 phút, lắc nhẹ. - Thêm 2ml NaCl 6M. - Trồn đều, ly tâm 3500 vòng/ 15 phút/ 4 0 C. Tủa ADN: - Lấy nớc nổi sang một tube khác. - Thêm vào 2,5 thể tích cồn tuyệt đối, lắc nhẹ, ủ ở -30 0 C qua đêm thu đợc tủa ADN dạng hình sứa. - Rửa tủa bằng cồn 70%, để khô, hoà tủa bằng T.E. 2.2. Kỹ thuật tách ADN bằng acetate d'ammonium (Kỹ thuật của S.A.Miller, D.D.Dykes, H.F.Polesky - 1988) Hoá chất T.E 20-5: TrisHCl 20mM EDTA 5mM - Sarkosyl 20% - Proteinase K 10mg/ ml - Acetate d'ammonium - Cồn tuyệt đối - Cồn 70% Qui trình tách Phá vỡ hồng cầu: - Lấy máu chống đông bằng EDTA. - Trộn đều, ly tâm nhẹ 2000 vòng/ 15 phút. - Lấy phần huyết tơng giàu bạch cầu, đặt trong đá 30 phút. - Thêm vào 15ml dung dịch T.E 20-5, trộn đều, ly tâm 1500 vòng/ 10 phút. - Loại bỏ nớc nổi, thu cặn trắng. Phá vỡ bạch cầu và loại protein: - Sau khi thu đợc cặn trắng, thêm vào: 3,5ml T.E 20-5 3 TCNCYH 23 (3) 2003 175àl Sarkosyl 20% 75àl proteinase K - Lắc đều, ủ 37 0 C qua đêm. - Loại bỏ protein - Thêm 2ml acetate d'ammonium 7,5M. - Ly tâm 3500 vòng/ 15 phút/ 4 0 C. Tủa ADN: - Lấy nớc nổi sang một tube khác. - Thêm 15ml cồn tuyệt đối. - Trộn đều thu đợc tủa ADN hình sứa. - Rửa tủa bằng cồn 70%, để khô, hoà tan tủa bằng T.E. 2.2.3. Kỹ thuật tách ADN bằng QIA ampkit (Microtechnique) Nguyên tắc: Kỹ thuật này tách ADN từ máu ngoại vi bằng QIAamp minikit có sẵn. Qui trình tách: - Cho 20àl QIAGEN protease (hoặc proteinase K) vào eppendorf 1,5ml. - Thêm vào đó 200àl Buffer AL, lắc bằng máy khuấy trộn Vortex 15 giây. - ủ 56 0 C/ 10 phút. - Thêm 200àl cồn tuyệt đối, trộn đều bằng máy Vortex. - Chuyển sang cột QIAGEN, ly tâm 8000 vòng/ 10 phút, sau đó chuyển cột QIAGEN vào tube 2ml sạch khác. - Thêm 500àl Buffer AW1 vào cột QIAGEN, ly tâm 8000 vòng/ 1 phút, đặt cột QIAGEN vào tube 2ml sạch khác. - Thêm 500àl Buffer AW2, ly tâm 14000 vòng/ 3 phút. - Đặt cột QIAGEN vào tube ly tâm 1,5ml, thêm 200àl Buffer AE, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 8000 vòng/ 1phút. III. Kết quả 1. Đo hàm lợng và đánh giá độ tinh khiết của ADN bằng máy quang phổ kế - Đo mật độ quang của dung dịch ADN ở bớc sóng 260nm và ở bớc sóng 280nm. - Hàm lợng ADN đợc xác định theo công thức: [ADN] àg/ml = OD 260 *Hệ số pha loãng*50. - Đánh giá độ tinh khiết của ADN qua tỷ số OD 260 / OD 280 . ADN đợc coi là tinh khiết khi: 1,6<OD 260 / OD 280 <2. Bảng 1: Hàm lợng và độ tinh khiết của ADN tách bằng các kỹ thuật khác nhau KT OD260 OD280 OD260/ OD280 ADN (àg/ml) Perchlorate 0.473 0.268 1.76 9.46 Acetate amonium 0.838 0.513 1.64 16.76 QIA ampkit 0.227 0.134 1.70 11.4 4 TCNCYH 23 (3) 2003 2. Điện di kiểm tra ADN - Bản gel điện di có 6 giếng, cho vào mỗi giếng một thể tích ADN nh nhau. Hình 1: Điện di kiểm tra ADN trên gel agarose 0,8%, điện thế 100 V, thời gian 20 phút. - Giếng số 1, 2: ADN tách từ kỹ thuật Perchlorate sodium - Giếng số 3, 4: ADN tách từ kỹ thuật QIA ampkit - Giếng số 5: ADN tách từ kỹ thuật Acetate Ammonium - Giếng số 6: ADN chuẩn nông độ 12 àg/ml - Kết quả cho thấy các băng sáng hiện rõ nét, gọn và khá đều nhau. IV. Bàn luận Kỹ thuật QIA amp cho ADN chất lợng tốt dù chỉ đi từ một lợng máu rất ít (200àl). Tuy nhiên, chi phí cho kỹ thuật này khá cao nên cha đợc áp dụng rộng rãi. Hai kỹ thuật Perchlorate Sodium và Acetate d'ammonium có u điểm là dễ tiến hành, thời gian ngắn và chi phí vừa phải mà vẫn thu đợc ADN đảm bảo cả về chất và lợng. Hơn nữa, hai kỹ thuật này đi từ một lợng máu khá lớn (10ml) nên lợng ADN thu đợc có thể sử dụng trong những kỹ thuật đòi hỏi một lợng ADN lớn nh định nhóm kháng nguyên bạch cầu, định nhóm kháng nguyên tiểu cầu. ADN tách từ kỹ thuật perchlorate sodium có độ tinh khiết cao hơn ADN tách từ kỹ thuật Acetate d'ammonium. V. Kết luận Qua quá trình tiến hành các kỹ thuật trên cùng với kết quả thu đợc, chúng tôi nhận thấy rằng kỹ thuật Perchlorate Sodium là phù hợp nhất với những tiêu chuẩn đã đặt ra. Hiện nay, kỹ thuật này đang đợc sử dụng thờng qui tại Labo Trung tâm Y Sinh học, Đại học Y Hà Nội để tách ADN từ máu ngoại vi. Tài liệu tham khảo 1. Laboratoire dimmunologie plaquettaire: Fiches Techniques. 1998, Vol.2. 2. Biologie Moleculaire: Principes et techniques de base - Les techniques de PCR. 3. Lê Đình Lơng : Nguyên lí kỹ thuật di truyền . 2001. Summary Application and comparison of some methods of extraction DNA from peripheral blood DNA extraction is a basic and importance step in molecular biology technical. DNA has been extracted from peripheral blood by some techniques as: Perchlorate sodium, Acetate amonium, QIA amp minikit. At the same time, the comparison of those techniques depend on some standard. The result indicated: Perchlorate sodium DNA extraction is the best technique among the techniques mentioned above. This technique is daily used to extract DNA from peripheral blood at the Bio - Medical Centre Laboratory, Hanoi Medical University. 5 . TCNCYH 23 (3) 2003 Giới thiệu một số phơng pháp tách ADN từ máu toàn phần Lê Hoàn, Trần Khánh Chi, Phạm Thị Nguyệt Hằng, Bạch Khánh Hòa Đại học Y Hà Nội Tách chiết ADN là khâu. EDTA 5mM - Sarkosyl 20% - Proteinase K 10mg/ ml - Acetate d'ammonium - Cồn tuyệt đối - Cồn 70% Qui trình tách Phá vỡ hồng cầu: - L y máu chống đông bằng EDTA. - Trộn đều, ly tâm nhẹ. sodium - Giếng số 3, 4: ADN tách từ kỹ thuật QIA ampkit - Giếng số 5: ADN tách từ kỹ thuật Acetate Ammonium - Giếng số 6: ADN chuẩn nông độ 12 àg/ml - Kết quả cho th y các băng sáng hiện rõ