Sản xuất sinh khối vi khuẩn ACETOBACTER XYLINUM để chế biến NATA DE COCO

Sản xuất sinh khối vi khuẩn ACETOBACTER XYLINUM để chế biến NATA DE COCO

Bài 1 :

SẢN XUẤT SINH KHỐI VI KHUẨN ACETOBACTER XYLINUM

ĐỂ CHẾ BIẾN NATA DE COCO

Nata de coco là một sản phẩm lên men truyền thống của Philippines, được sản

xuất từ nước dừa lên men bơi một loại vi khuẩn len men dấm, có tên là Acetobacter xylinum Nata de coco lớp váng trắng, dai và khá dầy, nổi lên trên lớp dừa già sau khi

được lên men bởi vi khuẩn Bản chất lớp váng này chính là lớp màng hemicellulose bao quanh vi khuẩn, lớp màng này rất dày so với kích thước tế bào, chúng được tổng hợp rất nhanh và mạnh tạo thành váng khá dầy

Hemicellulose là một loại polysaccharide được tế bào vi khuẩn tổng hợp từ quá trình trao đổi chất trong môi trường nuôi cấy, chúng tích tụ đáng kể trong môi trường, do không hoà tan trong nước (nhưng hoà tan trong dung dịch kiềm), nên rất dễ tách ra khải môi trường nuôi cấy

1 Đặc điểm của vi khuẩn Acetobacter xylinum

Là trường khuẩn Gram âm, không có bào tử, không di động, có khả nặng tạo lớp vỏ nhầy hemicelluose bao quanh tế bào nên vi khuẩn kết tủa tạo lớp váng khá dầy, váng

vi khuẩn được sử dụng để chế biến thực phẩm

2 Điều kiện nuôi cấy vi khuẩn

Môi trường thoáng khí

Nhiệt độ thích hợp : 300C

Môi trường phải có đầy đủ nguồn dinh dưỡng: C, N, P, K, S …

Môi trường phải có pH < 4,5

3 Quy trình sản xuất

a Giai đoạn phân lập và giữ giống

Vi khuẩn được phân lập trong dĩa từ nguồn nước dừa lên men đã thấy xuất hiện váng trắng Sau đó giữ trong môi trường thạch nghiêng

Thành phần môi trường phân lập và giữ giống:

- (NH4)2HPO4 (DAP) : 0,3g

- Dung dịch Skegg : 5ml

b Giai đoạn nhân giống cấp 1, cấp 2, cấp 3…:Nuôi cấy chìm

Từ giống gốc trong ống nghiệm, cấy vào bình tam giác 100ml môi trường dịch thể Sục khí

Chuyển giống cấp 1 sang môi trường nhân giống cấp 2 với thể tích tăng lên 10 lần Nuôi sục khí 24 – 48 giờ, nuôi cấy tĩnh từ 3 – 4 ngày

Cấy giống cấp 2 sang môi trường nuôi cấy cấp 3 với thể tích tăng10 lần Nuôi sạu khí 24 – 48 giờ, nuôi cấy tĩnh trong 3 – 4 ngày

c Giai đoạn sản xuất: nuôi cấy bề mặt tĩnh

Khi lượng giống nhân lên đủ cho yêu cầu sản xuất Tiến hành lên men bề mặt trên các khay nhựa Các khay dược rửa sạch, tráng qua nước sôi và phun cồn để khử trùng

Môi trường lên men có các thành phần sau:

• Nước dừa già : 1000ml

• Đường cát : 20g (2%)

• (NH4)2SO4 : 8g (0,8%)

• (NH4)2HPO4 : 2g (0,2%)

• Acid acetic đậm đặc : 12ml (1,2%)

Các thành phần trên (trừ acid acetic) được cho vào nước dừa già đã được lọc sạch Nấu sôi, để nguội, bổ sung acid acetic vào Làm nguội môi trường xuống 300C Cấy giống vào và trộn đều Sau đó phân vào các khay nhựa và đậy kín bằng giấy báo sạch rồi xếp chống các khay lên nhau và để nơi yên tĩnh

Nhân giống cấp 1 10%

3ngày Tiệt trùng Autoclave

Nấu sôi

Các bước tiến hành lên men vi khuẩn Acetobacter xylinum

4 Thu hoạch

Sau thời gian ủ lớp váng xuất hiện ngày càng dày và môi trường cạn dần Khi

đó ta tiến hành thu hoạch ngay bằng cách dỡ lớp váng ra khỏi môi trường

5 Chế biến

- Gỡ bỏ lớp nhớt ở phía mặt dưới của lớp váng

- Miếng thạch sau khi thu hoạch dai và cứng cắt thành những miếng vuông nhỏ

- Miếng thạch sau khi thu hoạch có màu vàng và vá có vị chua do có acid acetic nên ta phải tiến hành rửa và dùng vật nặng đè cho nước chảy ra Sau đó lại ngâm

và rửa trong nước mới Cứ làm như vậy cho đến khi miếng thạch hết mùi chua và

có màu trắng

- Đến nước cuối cùng, cho thạch vào nước sôi luộc 15 phút

- Sơ chế: 3kg thạch : 1,5kg đường nấu cho ngấm đường

- Làm nước đường và bổ sung hương liệu

- Có thể bổ sung chất bảo quản Na benzoat 0,1%

6 Một số điều lưu ý khi thực hiện

Phải để nhiệt độ của môi trường thật nguội mới được cho vào vi khuẩn vào, nếu không thì chúng sẽ chết hết

Sau khi cấy vi khuẩn vào khay, phải để các khay nơi yên tĩnh, không được lay động các khay vì như thế sẽ làm cho miếng thạch tách lớp không ngon và rời rạc

Bài 2 :

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BỘT BÀO TỬ TỪ NẤM MỐC

1 Hình thái

Nấm mốc có dạng hình sợi phân nhánh gọi là khuẩn ty Những sợi này sinh trưởng ở đỉnh và phát triển nhanh tạo thành khuẩn ty thể

2 Cách phân lập

a Giống

Lấy từ những cơ chất tự nhiên (để đậu nành hấp chín, đậy lá nhãn lên rồi dể phơi sương 1 đêm cho lên mốc Sau đó chọn những mốc có màu vàng hoa cau, hoa cúc để phân lập)

b Nhân giống

- Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Đó là môi trường Saboward gồm có:

Thanh trùng ở 1210C trong 5 phút Sau đó để nguội rồi cho tetracyline vào

- Đặt trên đĩa petri 3 hạt đậu chứa nấm mốc rồi đem ủ Sau vài ngày trên hạt đậu sẽ phát triển thành những khuẩn ty Nếu trong đĩa không bị nhiễm khuẩn lạ thì ta không cần phải cấy chuyền, còn đĩa bị nhiễm khuẩn thì ta tiến hành cấy chuyền để thu được giống thuần

- Tiến hành giữ giống trong môi trường thạch nghiêng và bảo quản thạch

- Nhân giống trong bình tam giác Môi trường chứa trong bình tam giác gồm: bã đậu nành hay cơm hoặc tấm nấu không nhão Sau đó đem khử trùng ở 1210C/5 phút Tiếp đến cấy giống từ môi trường thạch nghiêng sang bình tam giác rồi đem

đi nuôi trong 5 ngày, chỉ để đến lúc thu tơ trắng

- Chuẩn bị môi trường bã đậu trên khay Trước khi đổ giống ra khay, ta cho vào bình tam giác một lớp bột mì sau đó trút ra trộn đều với môi trường trên khay và ủ trong 5 ngày

c Thu hoạch

Khi trên khay mốc đã mọc 1 lớp màu xanh đều, chuẩn bị bột mì rang vàng rồi phủ lên trên lớp mốc, lấy nguyên khối ra cho vào bao giấy rồi bóp cho rời ra Sau đó đem

đi sấy cho khô, làm cho nát rồi cho vào bịch bảo quản

3 Cách làm tương

a Nguyên liệu

- Đậu nành

- Bột mì rang vàng

- Muối

- Bột bào tử

b Cách thực hiện

- Ngâm nước, và nấu mềm đậu nành tách ra làm 2 phần: đậu để ráo nước, còn phần nước nấu đậu cho vào muối 10% rồi đem đi phơi nắng

- Phần đậu sau khi đã ráo nước, cho phần bột mì rang vàng vào trộn đều để tạo 1 lớp áo quanh các hạt đậu

- Cho bột bào tử vào phần đậu với tỷ lệ 3 gói bào tử (3g) : 250g đậu nành, sau đó trộn đều rồi cho vào khay ủ khoảng 3 ngày cho đến khi có tơ trắng đều rồi bóp cho rời Cho nước nấu đậu vào xấp xấp mặt (hay nước muối 20%)

- Đem đi phơi nắng và nhớ lắc đều hằng ngày

- Sau thời gian ủ từ 30 – 45 ngày, ta tách ra thành 2 phần :

Phần hạt: ta tiến hành chế biến thành tương hột như sau: 1kg đậu hột : 800g đường vàng, rồi đem đường đi nấu thật sôi sau đó cho phần đầu vào tiếp tục nấu sôi tương hột

Phần nước: Đem lọc lấy nước trong, thắng nước đường vàng đổ vào và tiếp tục nấu sôi Nước tương thu được thêm đường cho vừa ăn sử dụng

Giống gốc

Nhân giống cấp 1

Nhân giống cấp 2

Bánh giống

Xay

Bột bào tử giống

Sử dụng lên men Đóng gói, bảo quản

QUY TRÌNH SẢN XUẤT BỘT BÀO TỬ

Bài 3 :

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT MEO GIỐNG

Meo giống là những khuẩn ty thứ cấp được phân lập từ mmô thịt của quả thể

1 Cách phân lập

- Chọn khuẩn ty từ nơi làm giống, từ những quả thể to

- Dùng dao gọt những phần dính trên mô thịt

- Dùng gòn nhúng cồn 70o sáttrùng quả thể

- Lấy khay men khử trùng đặt quả thể lên giải phẩu, bỏ hết phần mô ở phía ngoài chỉ lấy phần mô nằm ở bên trong để đảm bảo mô cấy được vô trùng

- Sau đó đặt mô cấy vào đĩa petri chứa môi trường PDA

- Môi trường PDA gồm có:

Khoai tây : 500g (không cần bỏ vỏ nhưng phải rửa sạch, cắt nhỏ, nấu sôi và lọc dịch)

- Một phần nhỏ môi trường sau khi pha cho vào ống nghiệm để làm môi trường thạch nghiêng để giữ giống

- Còn một phần lớn được đưa vào bình tam giác để khử trùng rồi đổ vào đĩa petri Sau đó đặt mô thịt vào môi trường và đem đi ủ Sau thời gian ủ, nếu mẫu bị nhiễm thì ta tiến hành cấy chuyền nhiều lần để thu được giống tinh khiết Tơ giống thu được đó là tơ giống cấp 1

2 Cách nhân giống

- Từ tơ giống cấp 1, ta tiến hành tạo meo hạt bằng cách: dùng lúa nẩy mầm, gạo lức hoặc gạo tẻ nấu chín (tốt nhất là dùng lúa nẩy mầm vì có chứa nhiều chất dinh dưỡng) cho vào bình tam giácvà đem khử trùng ở 1210C trong 5 phút Dùng dao cắt cả phần thạch lẫn tơ nấm cho vào bình tam giác sau đó đem ủ tơ bao hạt (meo hạt) ( 1 đĩa petri có thể cấy vào 5 bình tam giác)

- Trong quá trình sản xuất nấm, nếu sử dụng meo hạt thì không kinh tế và rrất tốn công nên người ta tiến hành sản xuất meo cọng bằng cách:

♦ Dùng rơm, rạ hoặc thân mì đem phơi thật khô rồi cắt thành những đoạn đều nhau (khoảng 3cm)

♦ Đem ngâm vào nước vôi 10%

♦ Xong vớt ra rồi phủ lên đó 1 lớp cám gạo

♦ Sau đó, xếp tất cả vào bao PE hoặc chai thuỷ tinh (như chai Tribeco) cho vừa kín rồi đem đi khử trùng

♦ Từ meo hạt đã tạo được ta cho vào bao PE hoặc chai thuỷ tinh, rồi đậy miệng lại, đem ủ 15 ngày meo hạt

Quả thể Phân lập giống Tạo meo giống cấp 1 Meo hạt Meo cọng

Các bước tiến hành tạo meo giống

Bài 4:

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN

SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Lên men là quá trình chuyển hoá đường thành 2 sản phẩm chủ yếu là rượu ethylic

và CO2 trong điều kiện kỵ khí, theo phương trình tổng quát sau:

C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 + 27 kcal

Quá trình này thường do hoạt động của nấm men, nấm mốc và vi khuẩn nhưng thường là nấm men thuộc giống Saccharomyces

1 Giống

- Nấm men được phân lập từ các nguồn:

Nấm men bánh mì Nấm men rượu nếp, men cơm rượu … Nấm men lên men nước trái cây, dịch trái cây lên men…

- Nấm men sau khi phân lập phải có hoạt lực mạnh được nuôi trong môi trường Sabouraud Môi trường Sabouraud gồm có:

- Từ ống nghiệm ta tiến hành nuôi qua rỉ đường

Xử lý rỉ đường:

Cho acid sunfuric đậm đặc vào với tỷ lệ 35kg H2SO4 : 1 tấn rỉ đường

Dùng phương pháp lạnh : khuấy ở nhiệt độ thường trong 24h

- Rỉ đường sau khi được xử lý, ta cân 1kg rỉ đường cho vào 9l nước rồi bổ sung N,P,K bằng các chất:

- Sau đó đem đi nấu cho đạt được pH = 4,5 – 4,6 Xong ta tiến hành khử trùng Sau

đó ta cấy nấm men vào môi trường rỉ đường trong các ống nghiệm

- Khi nấm men phát triển đầu trong môi trường thì ta tiến hành cấy từ ống nghiệm qua bình tam giác (1 ống nghiệm cấy vào khoảng 2 –3 bình) trong khoảng 16 – 24h rồi cho vào thiết bị lên men (fermentor) lớn hơn với tỷ lệ cho vào là 8 – 10% thể tích thiết bị

- Sau khi cho vào thiết bị lên men với môi trường như trên thì sau 36h nó sẽ phát triển cực đại dịch lên men Sau đó ta tiến hành lắng bằng cách đóng viên alginate (cố định tế bào nấm men trong alginate)

Cách đóng viên alginate

Dùng alginate làm cơ chất, sử dụng:

♦ Alginate Na 3% : 30g

♦ CaCl2 2%

Dịch lên men : mật độ 2.109 tế bào/ml

Chuẩn bị becher vô trùng Cho vào becher 50ml alginate, 20ml dịch lên men rồi trộn đều tạo thành hỗn hợp

Chuẩn bị becher thứ 2, cho vào 150ml CaCl2 Tiến hành hút dịch ở bình 1 nhỏ từ từ vào bình 2 và thu kết tủa

2 Quá trình nước trái cây lên men

a Nguyên liệu

Dứa, mía hoặc các loại trái cây có thịt quả không dẻo

b Cách thực hiện (đối với dứa)

- Dứa sau khi được làm sạch, ta tiến hành vắt lấy nước rồi đem lọc để bỏ cặn

- Thêm đường khoảng 15 – 20%, pha nước vào khoảng 100 –200 ml (đối với

1 trái dứa)

- Đun sôi hỗn hợp trên

- Để nguội rồi chiết vào chai

- Sau đó cho men được cố định trong alginate vào

- Để yên trong 24h thì có thể sử dụng

c Lưu ý

- Trong quá trình lên men, thường xuyên mở nắp chai để cho khí thoát bớt ra ngoài Nếu không có thể gây nổ chai

- Sau khi đã lên men xong, nên sử dụng ngay trong khoảng từ 24 – 36h

- Nên vớt con men ra sau khi lên men xong, để có thể tái sử dụng đạt hiệu quả cao

Bài 5 :

CÔNG NGHỆ LÊN MEN GIẤM CỐ ĐỊNH

1 Nguyên liệu

Nguyên liệu thực hiện lên men giấm là những sản phẩm chứa cồn như: rượu, dịch trái cây lên men

2 Cách phân lập VSV lên men giấm

- Có thể phân lập VSV từ tự nhiên

- Có thể lấy VSV từ những cơ sở sản xuất

Sau khi đã có được giống VSV ta tiền hành nhân giống tạo dòng thuần (như các bước của các bài trên)

3 Cách thực hiện

- Sau khi đã có giống đủ mạnh, người ta chuẩn bị các thiết bị lên men (fermentor) Trong thùng lên men có chứa các chất mang như: bã mía, cùi bắp, xơ mướp….Các chất mang này có tác dụng là giữ con men, làm cho dịch lên men trong

- Sau khi chuẩn bị thùng lên men xong, ta tiến hành cấy con men vào rồi đổ dung dịch cần lên men vào thùng Vì VSV lên men giấm là VSV hiếu khí nên cần phải cung cấp đầy đủ oxy

- Dung dịch giấm sau khi thu nhận được thường có nồng độ thấp Muốn có nồng độ cao hơn ta cho tiếp tục giấm vừa mới tạo thành đi qua môi trường lên men Cứ làm như vậy nhiều lần ta sẽ có giấm có nồng độ cao

Bài 6 :

LÊN MEN LACTIC

1 Phân lập VSV lactic

- Người ta phân lập VSV lactic chủ yếu từ các nguồn:

Kim chi, dưa chua Sữa chua

- Môi trường phân lâp là môi trường MRS Agar:

• Postassium phosphate : 2g

• Amonium citrate : 2g

• Agar :15g Sữa chua

Ta phân lập được 2 chủng VSV lactic là: Lactobacillus bulgarius và Streptococcus thermophilus trên môi trường MRS Agar

Lactobacillus bulgarius : hình que, kết thành sợi dài hình chữ nhật có

màu xanh, trực khuẩn gram dương, không có bào tử, phản ứng catalase

âm tính Môi trường ức chế ở pH = 6,5 Streptococcus thermophilus : chuỗi dài, hình cầu Môi trường ức chế ở

pH = 4,5 Hai chủng này hỗ trợ nhau : Lacto có khả năng lên men mạnh nên tạo vị chua còn Strepto khả năng lên men yếu nên chủ yếu là tạo hương

Phân lập từ kim chi và dưa chua tương tự

2 Tuyển chọn giống

Cho vi khuẩn vào môi trường đường, 4h sau đem đi phân tích định tính acid lactic, sau đó định lượng acid lactic nhiều hay ít rồi lựa chọn

a Phương pháp định tính

Acid lactic trong điều kiện có sự hiện diện của acid sunfuric và KMnO4 (thuốc tím) chuyển thành acetaldehyde Acetaldehyde khi gặp hỗn hợp Ag/NH3 sẽ có màu đen Dựa vào sự xuất hiện màu đen, người ta xác định có sự hiện diện của acid lactic trong dịch hay không

KMnO4 + H2SO4 = K2SO4 + MnSO4 + H2O + 5O

CH3 – CH(OH) – COOH + O = CH3CHO + CO2 + H2O

CH3CHO + Ag/NH3 chất màu đen Cách thực hiện

Lấy 1 ống nghiệm, cho vào đó 5 – 7ml dung dịch cần kiểm tra Sau đó cho vào 1ml H2SO4 rồi đem đun sôi Cho vào vài giọt KMnO4, đặt vào ống nghiệm 1 tờ giấy lọc (tẩm 10 – 20ml AgNO3 + 2ml dung dịch NH4OH)

b Phương pháp định lượng

Nguyên tắc :

Lượng acid acetic có trong dịch mẫu có thể được biểu diễn bằng độ Therner

độ Therner chính là số ml dd NaOH dùng để trung hoà lượng acid lactic có trong 100ml dd mẫu Dung dịch phenolptalein 1% trong môi trường acid không màu , khi lượng acid bị trung hoà bởi NaOH thì phenolptalein chuyển sang màu hồng Dựa vào sụu chuyển màu của phenolptalein trong mẫu, người ta xác định được lượng NaOH cần dùng

Công thức tính độ Therner:

n 100

To(độ therner) =

V

n : số lượng NaOH để trung hoà 100ml dung dịch mẫu

V : thể tích mẫu

Cách thực hiện :

- Cho vào becher lượng mẫu, thêm nước vào cho đủ 100ml

- Cho vào mẫu một ít phenolptalein

- Dùng NaOH chuẩn độ đến khi trong becher có màu hồng không phai thì ngừng lại

lượng acid lactic có trong mẫu:

A% = To x 0,009 (g/100ml)

3 Nhân giống và bảo quản giống

a Nhân giống

Vì vi khuẩn lactic là vi khuẩn kỵ khí nên không có quá trình sục khí

b Bảo quản giống

Đông lạnh sâu

Dùng các eppendorf

- Cho vào eppendorf 0,5ml dd glycerin rồi đậy kín Sau đó đem đi hấp bằng Autoclave trong 25 phút ở 121oC

- Cho giống vào: hút 0,5ml giống vào eppendorf

- Bảo ở nhiệt độ đông lạnh sâu

Đông khô (sấy thăng hoa)

Có thể bảo quản giống trong thời gian rất lâu

- Sinh khối VSV, cho bột lactose vào, trộn đều thu được hỗn hợp dạng sệt

- Đưa dạng sệt vào khay rồi đặt vào tủ lạnh để đông nhanh, sau đó hạ nhiệt

độ xuống –40oC Sau đó nhiệt độ lên để tinh thể đá thăng hoa trong điều kiện chân không

4 Làm kim chi

- Cải nên phơi cho héo

- Thực hiện ức chế vi khuẩn gây thối bằng cách ngâm muối (khoảng 15% trong vòng 1 –2 giờ)

- Vắt thật ráo nước để loại nước trong cải và làm cho khô để không bị nhớt

- Cho gia vị vào (tỏi, gừng, ớt bột, đường cát)

- Sau đó nhận vào keo khoảng 2 ngày là có thể dùng được