TNU Journal of Science and Technology 227(10) 82 90 http //jst tnu edu vn 82 Email jst@tnu edu vn EFFECT OF BASAL MEDIUM AND PLANT GROWTH REGULATORS ON SEED GERMINATION, DIFFERENTIATION AND SHOOT REGE[.]
TNU Journal of Science and Technology 227(10): 82 - 90 EFFECT OF BASAL MEDIUM AND PLANT GROWTH REGULATORS ON SEED GERMINATION, DIFFERENTIATION AND SHOOT REGENERATION OF PAPHIOPEDILUM CONCOLOR (LINDL.) PFITZ Vu Thi Lan1*, Nguyen Quoc Khanh2, Do Tien Phat3 1TNU - University of Science, 2Linh Son Secondary School of Biotechnology - VAST 3Institute ARTICLE INFO Received: 07/4/2022 Revised: 24/6/2022 Published: 24/6/2022 KEYWORDS Germination Medium Paphiopedilum concolor Plant growth regulator Seed ABSTRACT Paphiopedilum concolor (Lindl.) Pfitz is a native species of Northern Vietnam Recently, this species has been extremely exploited in nature due to deforestation and over-collection, so it is essential to develop in vitro propagation methods for conservation This paper represent that we have successfully studied a number of factors affecting the efficiency of propagation of Paphiopedilum concolor by in virto seed germination, including suitable mineral medium for seed germination, suitable media added plant growth regulators for differentiation and shoot formation, a suitable medium for shoot regeneration and seedding growth Seeds were cultured on ½ MS or ½ VW medium gave high germination rates (82.5% and 80%, respectively), germination time was 37.5 to 40 days The suitable medium for the differentiation and development of germinated seeds was P5 medium (VW + BAP 1.0 mg/L, NAA 0.5 mg/L, banana homogenate 30 g/L, potato homogenate 40 g/L) with the highest percentage of shoot formation (50.1%) The suitable medium for shoot regeneration and seedling growth was VW medium supplemented with BAP 2.0 mg/L, NAA 0.5 mg/L, number of shoots/sample reached 2.0, number of leaves/shoot reached 3.5, leaf length reaches 1.35 cm, seeddings with large, dark green and thick leaves These results are basis for further studies on in vitro propagation of P concolor in Vietnam ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG CƠ BẢN VÀ CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG ĐẾN SỰ NẢY MẦM HẠT, BIỆT HÓA VÀ TÁI SINH CHỒI LAN HÀI ĐỐM (Paphiopedilum concolor Lindl Pfitz) Vũ Thị Lan1*, Nguyễn Quốc Khánh2, Đỗ Tiến Phát3 1Trường 3Viện Đại học Khoa học - ĐH Thái Nguyên, 2Trường Trung học sở Linh Sơn Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam THƠNG TIN BÀI BÁO Ngày nhận bài: 07/4/2022 Ngày hoàn thiện: 24/6/2022 Ngày đăng: 24/6/2022 TỪ KHĨA Chất điều hịa sinh trưởng Hạt Lan hài Đốm Mơi trường Nảy mầm TĨM TẮT Lan hài Đốm (Paphiopedilum concolor Lindl Pfitz) loài Lan hài địa miền Bắc Việt Nam Hiện nay, loài bị khai thác cạn kiệt tự nhiên nên việc phát triển phương pháp nhân giống in vitro để bảo tồn cần thiết Bài báo trình bày kết nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu nhân giống in vitro Lan hài Đốm bao gồm mơi trường khống phù hợp cho hạt nảy mầm, môi trường cho phát triển từ hạt, môi trường phù hợp cho tái sinh chồi sinh trưởng in vitro Kết cho thấy hạt Lan hài Đốm độ tuổi 190 ngày (sau thụ phấn) ni cấy mơi trường ½MS ½VW cho tỷ lệ hạt nảy mầm cao 82,5% 80%, thời gian nảy mầm 37,5 đến 40 ngày Môi trường phù hợp cho biệt hóa phát triển hạt nảy mầm môi trường P5 (VW + BAP 1,0 mg/L, NAA 0,5 mg/L, chuối 30 g/L, khoai tây 40 g/L) có tỷ lệ tạo chồi đạt cao (50,1%) Môi trường phù hợp cho tái sinh chồi sinh trưởng môi trường VW bổ sung BAP 2,0 mg/L, NAA 0,5 mg/L, số chồi/mẫu đạt 2,0, số lá/chồi đạt 3,5, chiều dài đạt 1,35 cm, chồi to, xanh đậm dày DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.5821 * Corresponding author Email: lanvt@tnus.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn 82 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 82 - 90 Giới thiệu Nhiều loài Lan hài thuộc chi Paphiopedilum q hiếm, cơng nhận bảo vệ tổ chức CITES Hiện nay, loài lan Việt Nam bị đe dọa có nguy tuyệt chủng nạn chặt phá rừng khai thác mức, nên cần thiết phải ưu tiên bảo vệ [1] Chi Paphiopedilum có đặc điểm có tốc độ sinh trưởng phát triển chậm, tỷ lệ hạt nảy mầm thấp Hiện nay, hướng nghiên cứu nhân giống loài Lan hài Việt Nam quan tâm nhằm mục đích bảo tồn nguồn gen tiến tới thương mại hóa Đã có nhiều nghiên cứu chi Paphiopedilum, chủ yếu phương thức nhân giống thông qua nảy mầm hạt không cộng sinh [2]-[4], tái sinh chồi trực tiếp từ [5], việc nhân giống Lan hài phụ thuộc lớn vào loài, đa số báo cáo cho ni cấy lồi Lan hài lai thường dễ dàng loài địa Q trình nảy mầm phát triển hạt bị ảnh hưởng lớn yếu tố tuổi hạt, việc xử lý hạt trước nuôi cấy, môi trường điều kiện, phương pháp ni cấy [4] Đã có số cơng trình nghiên cứu loài Lan hài Việt Nam đánh giá đa dạng di truyền loài Lan hài [6], [7], nghiên cứu phương pháp nhân giống số loài hài Hằng [8], hài Đỏ [9], hài Hồng [10], [11], hài Vân, hài Tam đảo [12] Tuy nhiên, thành công việc nhân giống tùy thuộc vào lồi thành cơng số loài Lan hài đinh Lan hài Đốm Paphiopedilum concolor Lindl Pfitz loài Lan hài địa Việt Nam Lồi có hoa to, màu vàng nhạt với nhiều chấm nhỏ màu tím, phân bố rộng dãy núi đá vơi có độ cao trung bình tỉnh miền núi phía Bắc Việt Nam Bắc Kạn, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc,…[1] Hiện nay, loài bị khai thác gần cạn kiệt ngồi tự nhiên Vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống in vitro Lan hài Đốm có ý nghĩa quan trọng cơng tác trì, bảo tồn phát triển nguồn gen Đã có nghiên cứu P concolor Việt Nam nghiên cứu đa dạng di truyền [13], nhân giống từ mầm ngủ thân mầm [14], tái sinh từ chồi ex vitro gieo hạt [15] Tuy nhiên, hiệu tái sinh chồi loài Lan báo cáo cịn thấp, cần có nghiên cứu sau để cải thiện tỷ lệ nảy mầm hạt hệ số nhân chồi Bài báo báo cáo kết nghiên cứu ảnh hưởng mơi trường chất điều hịa sinh trưởng đến nảy mầm, biệt hóa phát triển hạt sau nảy mầm, nhân chồi từ mầm sinh trưởng Lan hài Đốm in vitro Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu điều kiện nuôi cấy Vật liệu thực vât Quả có độ tuổi khoảng 190 ngày sau thụ phấn tay thu hái từ lan Paphiopedilum concolor khoẻ mạnh, bệnh vườn ươm Khoa Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Thái Nguyên Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy sử dụng nghiên cứu bao gồm: môi trường MS (Murashige Skoog, 1962) [16], VW (Vacin, Went, 1949) [17] chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) thực vật Điều kiện nuôi cấy Hạt nảy mầm tối 2-3 tuần đầu Các nghiên cứu biệt hóa phát triển hạt nảy mầm, tái sinh chồi sinh trưởng in vitro thực điều kiện chiếu sáng 2.500 - 3.000 lux, nhiệt độ 25 ± 2ºC, ẩm độ 80% chu kỳ quang 16/8 (sáng/tối) 2.2 Phương pháp nghiên cứu Khử trùng Lan hài Quả lan không bị tổn thương bệnh rửa vòi nước chảy, ngâm xà phịng lỗng khoảng phút, rửa nước cất Quả tiếp tục khử trùng NaOCl nồng độ 2,5% 30 phút Sau đó, rửa lại nhiều lần nước cất khử trùng Nảy mầm Lan hài Đốm http://jst.tnu.edu.vn 83 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 82 - 90 Hạt tách từ lan sau khử trùng, gieo mơi trường khống gồm mơi trường MS, ½ MS, mơi trường VW, ½VW mơi trường MS có bổ sung BAP mg/L Tất môi trường nuôi cấy bổ sung sucrose 30 g/L, than hoạt tính 0,5 g/L, agar g/L, pH mơi trường 5,8 Sự biệt hóa phát triển hạt nảy mầm Hạt nảy mầm mơi trường gieo hạt (có màu trắng, trong) cấy chuyển sang mơi trường khác để kích thích biệt hóa phát triển hạt nảy mầm Thành phần ký hiệu môi trường phát triển mầm trình bày bảng Bảng Thành phần mơi trường nghiên cứu biệt hóa phát triển hạt nảy mầm Kí hiệu mơi trường ĐC1 ĐC2 P3 MT1 - MT6 MT7 – MT8 P5 NC6 Thành phần môi trường MS + sucrose 20 g/L, than hoạt tính 0,5 g/L, agar g/L, nước dừa 100 ml/L VW + sucrose 20 g/L, than hoạt tính 0,5 g/L, agar g/L, nước dừa 100 ml/L ĐC1+ BAP 1,0 mg/L, NAA 0,5 mg/L, chuối 30 g/L, khoai tây 40 g/L ĐC1 + BAP bổ sung nồng độ (0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0) mg/L ĐC2 + BAP bổ sung nồng độ 1,0 2,0 mg/L ĐC2 + BAP 1,0 mg/L, NAA 0,5 mg/L, chuối 30 g/L , khoai tây 40 g/L ĐC2 + BAP 2,0 mg/L, NAA 0,5 mg/L Tái sinh chồi từ non in vitro Các chồi in vitro non sau nảy mầm từ hạt khoảng - tuần, có từ - cấy chuyển lên môi trường nuôi cấy ĐC2 bổ sung chất ĐHST BAP riêng rẽ bổ sung kết hợp BAP với NAA để nghiên cứu khả tái sinh sinh trưởng in vitro Môi trường đối chứng ĐC2 (Bảng 1), mơi trường thí nghiệm mơi trường NC1-NC4 bổ sung BAP riêng rẽ từ 1,0 – 4,0 mg/L, môi trường NC5-NC8 (bổ sung kết hợp BAP nồng độ 1,0 – 2,0 mg/Lvới NAA từ, 0,25 - 0,5 mg/L) Xử lí số liệu Các thí nghiệm lặp lại lần, lần - bình Đối với thí nghiệm gieo hạt, lần lặp lại xử lí bình, bình cấy lượng hạt tương đương Đối với thí nghiệm nghiên cứu khả biệt hóa phát triển hạt nảy mầm, thí nghiệm cấy bình, bình 15 - 20 mẫu Thí nghiệm nghiên cứu khả tái sinh sinh trưởng chồi, cấy bình, bình - mẫu Các số liệu xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trình ứng dụng Statgraphics centurion XVI Các giá trị trung bình theo sau chữ khác (a, b, c,…) cột bảng số liệu thể sai khác có ý nghĩa thống kê theo phép kiểm định Duncan với p < 0,05 Kết thảo luận 3.1 Khả nảy mầm hạt Lan hài Đốm mơi trường khống khác Hạt có độ tuổi từ 190 ngày sau thụ phấn gieo mơi trường có hàm lượng khống khác gồm MS, ½MS, VW, ½VW, MS + BAP mg/L có khác biệt rõ rệt khả nảy mầm hạt (Bảng 2, Hình 1) Bảng Ảnh hưởng mơi trường khống đến khả nảy mầm hạt Lan hài Đốm sau 60 ngày Môi trường Thời gian nảy mầm* (ngày) Tỷ lệ nảy mầm (%) Đặc điểm hạt nảy mầm MS 45,0 ± 7,1 ab 50,0 ± 28,3 ab Trắng, nhỏ 1/2MS 37,5 ± 3,5 a 82,5 ± 3,5 a Trắng, nhỏ VW 42,5 ± 3,5 ab 1/2VW 40,0 ± 1,4 a MS + BAP 55,0 ± 7,1 b *: hạt nảy mầm giai đoạn đầu phơi trịn, trắng http://jst.tnu.edu.vn 84 55,0 ± 35,4 ab 80,0 ± 7,1 a 25,0 ± 7,1 b Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Trắng, nhỏ Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 82 - 90 Hình Hạt nảy mầm mơi trường ½MS ½VW: (a) Hạt sau khử trùng gieo môi trường, (b) Hạt bắt đầu nảy mầm sau 40 ngày, (c) Mầm chồi trắng hình thành từ protocorm, (d) Chồi có xanh hồn chỉnh Thời gian nảy mầm hạt năm môi trường nuôi cấy tương đối ngắn, từ 37,5 đến 55 ngày Trong đó, hạt mơi trường khống MS VW đầy đủ có thời gian nảy mầm lâu mơi trường có thành phần giảm nửa, trung bình 42,5 đến 45 ngày Trong đó, mơi trường ½MS ½VW có thời gian nảy mầm hạt sớm hơn, 37,5 40 ngày, môi trường MS bổ sung BAP mg/L có thời gian nảy mầm lâu 55 ngày Như vậy, việc bổ sung BAP vào môi trường gieo hạt không làm tăng khả nảy mầm hạt lan hài Đốm Mặc dù vậy, tốc độ nảy mầm hạt lan hài nghiên cứu nhanh so với nghiên cứu trước môi trường MS bổ sung mg/L BAP [15] Trong nghiên cứu đó, hạt tách từ lan khử trùng HgCl2 có thời gian nảy mầm từ 90 đến 100 ngày Do thấy, hóa chất khử trùng có ảnh hưởng quan trọng đến nảy mầm hạt Tỷ lệ nảy mầm hạt môi trường ni cấy có khác biệt đáng kể Mơi trường ½MS ½VW cho tỷ lệ nảy mầm cao so với mơi trường cịn lại, đạt 82,5% 80% (Bảng 2, Hình 1b) Trong mơi trường MS VW có tỷ lệ nảy mầm thấp hơn, 50 55% Mơi trường MS có BAP mg/L cho tỷ lệ hạt nảy mầm thấp nhất, đạt 25% Như mơi trường MS VW khống có hàm lượng giảm nửa có hiệu tốt cho nảy mầm hạt Kết phù hợp với báo cáo Li đồng tác giả cho rng mụi trng ẵ MS v ẳ MS thớch hp cho nảy mầm P concolor [18] Đối với loài P wardii, nảy mầm môi trường MS thấp đáng kể so với mơi trường ½ MS [2] Các nghiên cứu Lan hài cho thấy tỷ lệ nảy mầm giống khác phụ thuộc vào nhiều yếu tố đặc tính lồi Hầu hết lồi thuộc chi Paphiopedilum có khả nảy mầm tốt mơi trường khống thấp Các môi trường 1/2, 1/4, 1/5, 1/6 1/8 MS khẳng định có hiệu tốt cho nảy mầm hạt chi lan hài Paphiopedilum [4] Ngoài ra, thành phần mơi trường khống ảnh hưởng tới khả nảy mầm loài thuộc chi Paphiopedilum Nhut đồng tác giả (2005) cho rằng, hạt P delenatii tháng tuổi nảy mầm tốt môi trường Knudson C so với môi trường MS ½MS [19] Tuy nhiên, khả nảy mầm hạt Cymbidium finlaysonianum Lindl đạt cao 83,8% môi trường VW [20] Do thấy, lồi Lan hài cần thiết tìm mơi trường thích hợp cho q trình nảy mầm hạt 3.2 Sự biệt hóa phát triển hạt nảy mầm mơi trường khống bổ sung chất điều hịa sinh trưởng Sự nảy mầm hạt lồi Lan hài ảnh hưởng hàm lượng thành phần mơi trường khống cịn chịu ảnh hưởng lớn thành phần môi trường dinh dưỡng việc bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (ĐHST) Trong nghiên cứu này, hạt nảy mầm tốt hai môi trường gieo hạt ½MS ½VW cấy chuyển sang mơi trường có bổ sung chất ĐHST với nồng độ khác (Bảng 1) Kết nuôi cấy sau 40 đến 50 ngày cho thấy môi trường có biệt hóa tạo chồi, nhiên số lượng chồi thu thấp tốc độ biệt hóa có khác mơi http://jst.tnu.edu.vn 85 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 82 - 90 trường nuôi cấy (Bảng 3) Đa phần chồi tạo thành có non màu vàng nhạt trắng Đến 70 ngày, chồi có xanh, riêng mơi trường P5 tạo thành chồi hồn chỉnh có 1-2 xanh rễ (Hình 1d) Như vậy, việc bổ sung BAP NAA có hiệu tốt việc hình thành chồi sau 70 ngày so với đối chứng, mơi trường MS bổ sung BAP với nồng độ 2,0 mg/L đến 3,0 mg/L cho biệt hóa hạt nảy mầm tốt, nhiều hạt phát triển thành protocorm trắng, to xuất mầm chồi, số chồi xanh hình thành nhiều so với nồng độ BAP khác, đạt cao 4,0 chồi/bình Mơi trường MT7 MT8 (Mơi trường VW bổ sung BAP 1,0 2,0 mg/L) có biệt hóa hạt nảy mầm tốt, số chồi tạo thành đạt 4,0 chồi/bình nồng độ BAP mg/L Điều cho thấy môi trường MS hay VW bổ sung BAP nồng độ 2,0 mg/L phù hợp cho giai đoạn biệt hóa hạt nảy mầm Bảng Ảnh hưởng mơi trường khống bổ sung chất ĐHST đến hình thành chồi từ hạt nảy mầm giai đoạn sau 70 ngày Môi trường ĐC1 (MS) MT1 MT2 MT3 MT4 MT5 MT6 P3 ĐC2 (VW) MT7 MT8 P5 BAP (mg/L) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 1,0 1,0 2,0 1,0 NAA (mg/L) 0 0 0 0,5 0 0,5 Thời gian tạo chồi (ngày) 55 55 55 45 50 50 50 40 40 50 Số chồi/bình 0d 1,0 cd 1,0 cd 2,0 bc 4,0 a 4,0 a 3,5 ab ,0 bc 0,0 d 3,5 ab 4,0 a 4,0 a Đặc điểm chồi/protocorm Protocorm trắng Chồi trắng Chồi xanh nhạt Chồi có xanh Chồi có xanh Chồi vàng nhạt Mầm chồi xanh Mầm chồi vàng nhạt Protocorm trắng Mầm chồi vàng nhạt Chồi có xanh Chồi hồn chỉnh (có rễ, xanh) Ghi chú: ĐC1 đến P3: môi trường MS; ĐC2 đến P5: Mơi trường VW, “-”: khơng có kết Đối với môi trường P3 P5 (bổ sung kết hợp BAP 1,0 mg/L, NAA 0,5 mg/L chất hữu thực vật nước dừa 100 ml/L, khoai tây 40 g/L, chuối 30 g/L cho thấy có hiệu tốt thúc đẩy biệt hóa chồi Mơi trường P5 cho biệt hóa chồi sớm mơi trường P3, đến 50 ngày tạo chồi hồn chỉnh có rễ xanh (Hình 1d), mơi trường P3 hạt nảy mầm biệt hóa chậm tạo mầm chồi vàng nhạt, chưa có xanh rễ Như vậy, môi trường MS VW bổ sung chất ĐHST không ảnh hưởng nhiều đến số chồi hình thành bổ sung tổ hợp với chất hữu có ảnh hưởng đến tốc độ biệt hóa phát triển chồi Các mơi trường cho kết hình thành chồi tốt MT4, MT8 P5 Các nghiên cứu Lan hài cho thấy chất ĐHST thực vật khác có tác động khác đến nảy mầm loài khác Mặc dù, khơng có chất ĐHST ngoại sinh hạt Paphiopedilum nảy mầm tuy, nhiên tỷ lệ nảy mầm cải thiện đáng kể bổ sung chất ĐHST với nồng độ phù hợp Ngoài ra, việc bổ sung chất hữu từ thực vật báo cáo có tác dụng khác đến nảy mầm hạt Việc bổ sung nước dừa vào mơi trường khống gieo hạt báo cáo Chen đồng tác giả (2015) bổ sung nước dừa vào môi trường khoáng RE MS gieo hạt P Spicerianum cho thấy tỷ lệ nảy mầm cao đạt mơi trường RE có nước dừa so với mơi trường MS có nước dừa với chu kì ni 24 tối sau xử lý với 1,0% NaOCl khoảng 40 phút [20] Theo Li đồng tác giả (2016), bổ sung 100 ml/L nước dừa (CW) g/L peptone có tác động tích cực đến nảy mầm hạt biệt hóa protocorm P concolor [18] Sự biệt hóa chồi protocorm mơi trường khống bổ sung chất điều hòa sinh trưởng khác Từ kết nghiên cứu thu lựa chọn số môi trường bổ sung chất ĐHST cho hiệu hình thành chồi tốt để tiếp tục đánh giá biệt hóa protocorm (Bảng 4) http://jst.tnu.edu.vn 86 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 82 - 90 Các mơi trường nghiên cứu có ảnh hưởng đến biệt hóa phát triển protocorm có tỷ lệ tạo chồi cao so với đối chứng ĐC1 Sau 40 ngày nuôi cấy, môi trường bổ sung BAP riêng rẽ với nồng độ 1,0 2,0 mg/L (MT2, MT8) bổ sung kết hợp BAP 2,0 mg/L với NAA 0,5 mg/L (NC6) tỷ lệ tạo chồi sau 40 ngày tương đương không khác biệt so với môi trường đối chứng, tỷ lệ tạo chồi đạt 20,2 đến 27% Môi trường P5 có tỷ lệ tạo chồi đạt cao (48,2%), điều chứng tỏ môi trường P5 thúc đẩy biệt hóa tạo chồi sớm so với mơi trường cịn lại Sau 60 ngày, tỷ lệ tạo chồi môi trường nghiên cứu tăng lên đáng kể so với 40 ngày có khác biệt rõ rệt môi trường bổ sung BAP với nồng độ khác Trong đó, mơi trường P5 có tỷ lệ tạo chồi đạt (50,1%), tiếp đến môi trường NC6 cho tỷ lệ tạo chồi đạt cao (42,1%) Môi trường MT4 MT8 (BAP bổ sung 2,0 mg/L) tỷ lệ tạo chồi đạt cao so với MT2 MT7, đạt 36,3 - 36,9% Điều cho thấy mơi trường khống MS VW không ảnh hưởng khác biệt đến khả tạo chồi, mà phụ thuộc vào nồng độ chất ĐHST bổ sung vào môi trường Khi bổ sung BAP mg/L kết hợp với NAA 0,5 mg/L làm tăng tỷ lệ tạo chồi so với bổ sung riêng BAP mg/L Khi bổ sung kết hợp tổ hợp BAP NAA với chuối khoai tây, nước dừa mơi trường P5 có tác dụng tốt đến khả biệt hóa chồi hạt nảy mầm phát triển tạo hồn chỉnh (Hình 2) Ngồi ra, môi trường nghiên cứu sau 60 ngày nuôi cấy có tượng số hạt nảy mầm phát triển đến giai đoạn protocorm khơng phát triển tiếp, đen dần chết Tỷ lệ chết phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy chiếm từ 6,2 - 31% Tỷ lệ hạt nảy mầm trì trạng thái protocorm lại cao, chiếm 24,3 đến 62% Các protocorm cấy chuyển sang môi trường tạo chồi tỷ lệ thấp Các kết tương tự quan sát Chen đồng tác giả (2015) [21], cho môi trường RE protocorm P spicerianum hình thành, có màu trắng phát triển khơng tạo chlorophyll sau chuyển sang nâu chết Như vậy, 100% hạt Lan hài nảy mầm phát triển thành chồi hồn chỉnh cho thấy có nhiều trở ngại việc nhân giống Lan hài Bảng Ảnh hưởng môi trường khoáng bổ sung chất ĐHST đến biệt hóa chồi protocorm Mơi trường Mơi trường + BAP (mg/L) + NAA (mg/L) ĐC1 MT2 MT4 MT7 MT8 NC6 P5 MS + + MS + 1,0 +0 MS + 2,0 + VW + 1,0 + VW + 2,0 + VW + 2,0 + 0,5 VW + 1,0 + 0,5 + PH+ BH + CW Sau 40 ngày nuôi cấy Tỷ lệ tạo Tỷ lệ chết chồi (%) (%) 16,3 b 15,9 ab 20,2 b 9,6 ab b 25,2 15,4 ab b 21,9 2,5 b 25,5 b 14,3 ab 27 b 9,4 ab a 48,2 29,2 a Sau 60 ngày nuôi cấy Tỷ lệ tạo Tỷ lệ chết chồi (%) (%) 19,3 c 29,2 a 30,3 bc 19,0 ab b 36,3 17,2 ab bc 31,8 6,2 b 36,9 b 31,0 a 42,1 ab 24,6 ab a 50,1 25,6 a CW+ PH+ BH: Nước dừa 100 ml/L + 40 g/L khoai tây + 30 g/L chuối (a) (b) (c) Hình Biệt hóa chồi từ protocorm môi trường P5(VW + BAP 1,0 mg/L+ NAA 0,5 mg/L+ Nước dừa 100 ml/L + Khoai tây 40 g/L + Chuối 30 g/L): (a) Hình thành mầm, (b) Cây có xanh sau 30 ngày, (c) Cây hoàn chỉnh sau 60 ngày http://jst.tnu.edu.vn 87 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 82 - 90 Các nghiên cứu môi trường phù hợp cho nảy mầm Lan hài nhiều tác giả báo cáo Chuối hay khoai tây bổ sung vào mơi trường thúc đẩy ức chế nảy mầm hạt Paphiopedilum giống lai tạo Sự nảy mầm ba loài P bellatulum, P delenatii P Primulinum thúc đẩy bổ sung 20 g/L khoai tây, bổ sung chuối 20 g/L lại làm giảm nảy mầm P bellatulum, P delenatii P primulinum [4] Ngược lại, theo Zeng đồng tác giả (2012), tỷ lệ nảy mầm hạt khơng có khác biệt mơi trường ½MS có chứa khoai tây mơi trường ½MS có chứa 75 đến 100 g/L dịch chiết chuối so với môi trường không bổ sung chất hữu [2] 3.3 Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tái sinh chồi sinh trưởng Lan hài Đốm in vitro Các môi trường nghiên cứu VW bổ sung BAP riêng rẽ từ 1,0 - 4,0 mg/L hay bổ sung kết hợp BAP nồng độ từ 1,0 - 2,0 mg/L NAA 0,25 - 0,5 mg/L (NC1- NC8) có ảnh hưởng khác biệt so với đối chứng (ĐC2) lên tái sinh chồi sinh trưởng Lan hài Đốm in vitro (Bảng 5) Bảng Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tái sinh chồi sinh trưởng Lan hài Đốm in vitro sau 60 ngày Môi trường ĐC NC1 NC2 NC3 NC4 NC5 NC6 NC7 NC8 BAP (mg/L) 1,0 2,0 3,0 4,0 1,0 1,0 2,0 2,0 NAA (mg/L) 0 0 0,25 0,5 0,25 0,5 Số chồi/mẫu 1,00 b 1,00 b 1,67 a 1,00 b 1,00 b 1,00 b 1,40 ab 1,50 ab 2,00 a Số lá/chồi 1,80 b 2,50 b 2,67 b 2,50 b 3,00 b 2,00 b 2,33 b 2,50 b 3,50 a Dài (cm) 0,55 c 0,76 bc 0,77 bc 0,75 bc 1,15 ab 0,93 bc 1,15 ab 1,25 ab 1,35 a Số rễ/chồi 0,50 b 1,00 ab 1,00 b 1,00 ab 1,50 ab 1,00 ab 1,31 ab 1,50 ab 2,00 a Đặc điểm chồi Lá bé, vàng nhạt Lá bé, xanh đậm Lá non, xanh nhạt Lá mỏng, vàng nhạt Lá dày, tím nâu Lá bé, vàng nhạt Lá mỏng, xanh nhạt Lá xanh nhạt Lá xanh đậm Hình Sinh trưởng Lan hài Đốm in vitro môi trường bổ sung BAP BAP kết hợp với NAA: (a) Chồi ban đầu, (b) Chồi sinh trưởng tốt sau 30 ngày, (c) Sự tạo đa chồi môi trường bổ sung BAP mg/L + NAA 0,5 mg/L, (d) Sự tái sinh chồi môi trường BAP mg/L, (e) Chồi sinh trưởng tốt môi trường bổ sung BAP sau 90 ngày, (f) Cây Lan hài Đốm vườn ươm sau 60 ngày Trong số tiêu sinh trưởng số lá/chồi thay đổi không lớn môi trường nuôi cấy khác già chết rụng song song với trình Ở môi trường ĐC không bổ sung BAP NAA cho thấy mẫu không tạo đa chồi, chồi sinh trưởng kém, nhỏ, bé vàng nhạt Với môi trường bổ sung BAP với nồng độ từ 1,0 - 4,0 mg/L (NC1 - NC4), tiêu sinh trưởng chồi số lá/chồi, chiều dài lá, số rễ đạt cao so http://jst.tnu.edu.vn 88 Email: jst@tnu.edu.vn ... (NC1- NC8) có ảnh hưởng khác biệt so với đối chứng (ĐC2) lên tái sinh chồi sinh trưởng Lan hài Đốm in vitro (Bảng 5) Bảng Ảnh hưởng BAP NAA đến khả tái sinh chồi sinh trưởng Lan hài Đốm in vitro... thiết tìm mơi trường thích hợp cho q trình nảy mầm hạt 3.2 Sự biệt hóa phát triển hạt nảy mầm mơi trường khống bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Sự nảy mầm hạt loài Lan hài ảnh hưởng hàm lượng... hưởng mơi trường chất điều hịa sinh trưởng đến nảy mầm, biệt hóa phát triển hạt sau nảy mầm, nhân chồi từ mầm sinh trưởng Lan hài Đốm in vitro Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Nguyên liệu điều