TNU Journal of Science and Technology 227(10) 9 16 http //jst tnu edu vn 9 Email jst@tnu edu vn OPTIMIZATION OF AN ULTRASOUND ASSISTED EXTRACTION CONDITION FOR ALKALOIDS COMPOUNDS FROM RHIZOMES OF Cur[.]
TNU Journal of Science and Technology 227(10): - 16 OPTIMIZATION OF AN ULTRASOUND-ASSISTED EXTRACTION CONDITION FOR ALKALOIDS COMPOUNDS FROM RHIZOMES OF Curcuma zedoaria USING RESPONSE SURFACE METHODOLOGY Nguyen Thi Ai Lan1, Tran Chi Linh2* 1Tra Vinh University, 2Can Tho University ARTICLE INFO Received: 02/4/2022 Revised: 14/6/2022 Published: 14/6/2022 KEYWORDS Curcuma zedoaria Extraction Optimization Alkaloids Ultrasound ABSTRACT Response surface methodology using a Box-Behnken design was employed to optimize the conditions for extraction of alkaloids from the rhizomes of Curcuma zedoaria Alkaloids from the rhizomes of Curcuma zedoariaare subjected to ultrasonic-assisted extraction Four independent variables such as: ultrasonic temperature, ethanol concentration, material/ solvent ratio, and ultrasonic time were investigated In which, ultrasonic temperature, ethanol concentration, and ultrasonic time have a lot of influence on alkaloids contentand and are used to optimize for rhizomes of Curcuma zedoaria The results showed that the experimental data could be fitted to a quadratic polynomial model using correlation analysis of the mathematical regression model Response surface plots showed that all independent variables significantly affected the alkakoid content extracted from rhizomes of Curcuma zedoaria The optimum extraction conditions were as follows: ethanol concentration of 69% (v/v), ultrasonic temperature of 62oC, ultrasonic time of 15 min, and the ratio of material to solvent of 1:30 (w/v) The alkaloids content yield under the optimum conditions was found to be 289.25±0.43 mg AE/g extract, which agreed with the predicted value of 288.24 mgAE/g extract TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT CÓ SỰ HỖ TRỢ CỦA SÓNG SIÊU ÂM ĐỐI VỚI HỢP CHẤT ALKALOID TỪ THÂN CỦ NGHỆ ĐEN (Curcuma zedoaria) BẰNG CÁCH SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐÁP ỨNG BỀ MẶT Nguyễn Thị Ái Lan1, Trần Chí Linh2* 1Trường Đại học Trà Vinh, 2Trường Đại học Cần Thơ THÔNG TIN BÀI BÁO TÓM TẮT Phương pháp đáp ứng bề mặt áp dụng thiết kế Box-Behnken Ngày nhận bài: 02/4/2022 sử dụng để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất alkaloid từ thân củ Ngày hoàn thiện: 14/6/2022 nghệ đen Alkaloid từ thân củ nghệ đen chiết xuất với hỗ trợ sóng siêu âm Bốn biến số độc lập gồm: nhiệt độ siêu âm, nồng Ngày đăng: 14/6/2022 độ ethanol, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi thời gian siêu âm khảo sát Trong đó, nhiệt độ siêu âm, nồng độ ethanol thời gian TỪ KHĨA siêu âm có ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng alkaloid sử dụng Nghệ đen để tối ưu hóa cho thân củ nghệ đen Kết cho thấy, liệu thực nghiệm phù hợp với mơ hình đa thức bậc hai cách sử dụng phân Chiết xuất tích tương quan mơ hình hồi quy toán học Các biểu đồ bề mặt Tối ưu hóa đáp ứng cho thấy, biến độc lập ảnh hưởng đáng kể đến hàm Alkaloid lượng alkakoid chiết xuất từ thân củ nghệ đen Các điều kiện chiết Siêu âm xuất tối ưu sau: nồng độ ethanol 69%, nhiệt độ siêu âm 62oC, thời gian siêu âm 15 phút tỷ lệ nguyên liệu so với dung môi 1:30 (w/v) Hàm lượng alkaloid điều kiện tối ưu xác định 289,25±0,43 mg AE/g cao chiết, phù hợp với giá trị dự đoán 288,24 mg AE/g cao chiết DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.5804 * Corresponding author Email: tclinh@ctu.edu.vn http://jst.tnu.edu.vn Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): - 16 Giới thiệu Alkaloid nhóm đa dạng cấu trúc chất chuyển hóa thứ cấp chứa nitơ với phân bố tương đối rộng tự nhiên phạm vi hoạt động sinh học đa dạng [1] Các hợp chất thuộc nhóm alkaloid phổ biến thực vật thường ly trích để làm thuốc chữa bệnh Trong y học đại, nhiều alkaloid dẫn xuất alkaloid ứng dụng làm thuốc chí nhiều alkaloid điều tra thử nghiệm lâm sàng để lựa chọn alkaloid quan trọng để điều trị nhiều bệnh tật nguy hiểm [2], [3] Nhu cầu sử dụng alkaloid cho y học nhiều, nhiên việc phân lập hợp chất alkaloid với số lượng lớn tốn thời gian, phân lập quy mơ cơng nghiệp [1] Do đó, việc nghiên cứu để tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid nhà khoa học quan tâm Hiện để tối ưu hóa điều kiện ly trích hợp chất thiên nhiên, nhà khoa học thường áp dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (Response Surface Methodology, RSM) Box Wilson đề xuất sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt vào năm 1951, phương pháp tối ưu hóa cho thiết kế thí nghiệm tồn diện mơ hình tốn học, áp dụng rộng rãi việc chiết xuất hợp chất thiên nhiên từ thực vật ưu điểm có độ xác cao hiệu suất dự đốn tốt [4], [5] Nhiều lồi thực vật thuộc chi Curcuma chứng minh đóng vai trị quan trọng điều trị nhiều bệnh tật nguy hiểm [6] Trong đó, nghệ đen (Curcuma zedoaria) sở hữu hoạt tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn kháng viêm tốt [7]-[9] Các đặc tính dược nghệ đen diện thành phần đa dạng polyphenol, flavonoid alkaloid [10] Nhận thấy tầm quan trọng hợp chất thiên nhiên nghệ đen, số nghiên cứu tiến hành tối ưu hóa điều kiện chiết xuất hợp chất thiên nhiên từ lồi thực vật Trong đó, nghiên cứu Azahar cộng (2017) tiến hành tối ưu điều kiện chiết xuất tối ưu để ly trích polyphenol flavonoid từ nghệ đen [11] Trong đó, nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết xuất alkaloid từ thân củ nghệ đen chưa quan tâm nghiên cứu Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu Nghệ đen thu lấy thân củ huyện Thạnh Phú, tỉnh Bến Tre, Việt Nam Nghệ đen định danh lưu trữ phịng thí nghiệm Hóa Sinh Lâm Sàng (Phịng C11.105), mơn Hóa Sinh, Khoa Y - Dược, trường Đại học Trà Vinh với mã số lưu trữ là: BT_Cze202001010010 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xử lý nguyên liệu xác định độ ẩm Sau xử lý nhóm nghiên cứu thu 6,25 kg thân củ nghệ đen tươi Sau đó, thân củ nghệ đen cắt lát mỏng phơi khơ bóng râm xay nhuyễn thu 1,85 kg bột Bột thân củ nghệ đen đem ray qua khay để thu lấy hạt bột có kích thước 60 mesh xác định độ ẩm theo mô tả Dược Điển Việt Nam V [12] Bột thân củ nghệ đen có độ ẩm 7,15±0,25% bảo quản túi nhựa PE, đặt hộp nhựa kính, lưu trữ 4oC dùng cho thử nghiệm 2.2.2 Xác định ảnh hưởng yếu tố đơn tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid Alkaloid bột thân củ nghệ đen chiết xuất máy siêu âm gia nhiệt (Derui DRMH30, China) với tần số cố định 40 kHz Alkaloid thân củ nghệ đen chiết xuất điều kiện sau: ethanol có nồng độ từ 40, 50, 60, 70, 80, 90 đến 99,5% (v/v); nhiệt độ siêu âm thay đổi 30, 40, 50, 60, 70, 80 90oC; thời gian siêu âm tăng từ 5, 10, 15, 20, 25, 30 đến 35 phút; tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi thay đổi từ 1/10, 1/15, 1/20, 1/25, 1/30, 1/35 đến 1/40 (w/v) Trong trình khảo sát ảnh hưởng yếu tố đơn nồng độ ethanol 90%, nhiệt độ 30oC, thời gian siêu âm 10 phút tỷ lệ nguyên liệu/ dung http://jst.tnu.edu.vn 10 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): - 16 môi 1/10 (w/v) cố định Tiến hành lọc dịch chiết cô đuổi dung môi thu lấy cao chiết định lượng alkaloid theo mô tả mục 2.2.3 Sau tiến hành khảo sát đơn nhân tố, nhóm nghiên cứu lựa chọn 03 yếu tố có ảnh hưởng nhiều đến hàm lượng alkaloid cao chiết thân củ nghệ đen để xây dựng quy trình chiết xuất tối ưu Phương pháp đáp ứng bề mặt theo thiết kế thí nghiệm Box-Behnken với ba yếu tố, ba cấp độ phần mềm Design expert 11.0 sử dụng để thiết kế thí nghiệm đánh giá mơ hình 2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng alkaloid bột thân củ nghệ đen Hàm lượng alkaloid xác định theo phương pháp hình thành phức hợp với bromocresol green (BCG), tạo thành sản phẩm có màu vàng theo mô tả Shamsa cộng (2008) [13] Cao chiết thân củ nghệ đen (1 mL) cho phản ứng với mL HCl 2N Sau phút, dung dịch lọc giấy lọc loại bỏ cặn Dung dịch cho vào bình tách chiết thêm vào mL BCG mL dung dịch đệm phosphate (pH=4,7) Cuối cùng, hỗn hợp phản ứng lắc mạnh bình tách chiết với 10 mL chloroform phút nhiệt độ phòng Tiến hành xác định độ hấp thu quang phổ bước sóng 470 nm Hàm lượng alkaloid cao chiết thân củ nghệ đen (mg AE/g cao chiết) xác định dựa vào đường chuẩn atropine 2.2.4 Xử lý phân tích số liệu Các số liệu khảo sát đơn yếu tố trình bày dạng Mean±Stdev xử lý phần mềm Minitab 16.0 kiểm định ANOVA-Tukey’s Biểu đồ vẽ phần mềm Microsof excel 2013 Các số liệu mơ hình tối ưu xử lý phần mềm Design expert 11.0 Kết bàn luận 3.1 Ảnh hưởng yếu tố đơn đến trình chiết xuất alkaloid từ thân củ nghệ đen Ảnh hưởng yếu tố đơn nồng độ ethanol, nhiệt độ siêu âm, thời gian siêu âm tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hàm lượng alkakoid chiết xuất từ thân củ nghệ đen trình bày Hình Hình Hàm lượng alkaloid dịch chiết từ thân củ nghệ đen Ghi chú: A: Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hàm lượng alkaloid; B: Ảnh hưởng thời gian siêu âm đến hàm lượng alkaloid; C: Ảnh hưởng nhiệt độ siêu âm đến hàm lượng alkaloid; D: Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hàm lượng alkaloid http://jst.tnu.edu.vn 11 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): - 16 Thân củ nghệ đen chiết xuất nồng độ ethanol khác thu hàm lượng alkaloid khác Khi sử dụng ethanol từ 40 đến 70% hàm lượng alkaloid tăng liên tục từ 56,67±1,33 đến 109,78±1,02 mg AE/g cao chiết Hàm lượng alkaloid bắt đầu giảm tăng nồng độ ethanol lên 80% (Hình 1A) Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát ảnh hưởng mốc thời gian siêu âm khác từ đến 35 phút đến hàm lượng alkaloid Kết nghiên cứu cho thấy, hàm lượng alkaloid chiết xuất đạt mức tối đa 15 phút (149,56±1,02 mg AE/g cao chiết) sau giảm kéo dài thời gian siêu âm (Hình 1B) Do đó, thời gian siêu âm khoảng thời gian từ 10 đến 20 phút chọn cho thí nghiệm tối ưu hóa Nhiệt độ yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến trình chiết xuất Qua Hình 1C thấy hàm lượng alkaloid cao chiết tăng nhanh khoảng nhiệt độ từ 30 đến 60°C, hàm lượng tăng cao từ 83,56±1,02 lên 126,22±1,39 mg AE/g cao chiết Tuy nhiên, tiếp tục tăng nhiệt độ lên 70°C hàm lượng alkaloid có xu hướng giảm Một số nghiên cứu trước cho thấy hàm lượng hợp chất thiên nhiên trình chiết xuất tăng đến nhiệt độ cố định bắt đầu giảm dần sau đó, phân hủy nhiệt độ cao số nhóm chất khơng bền với nhiệt [14], [15] Từ kết Hình 1D cho thấy, hàm lượng alkaloid tăng theo tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi Hàm lượng alkaloid tăng từ 84,44±1,68 lên 104,44±0,38 mg AE/g cao chiết tăng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi từ 1/10 đến 1/40 (w/v) Tuy nhiên, nhóm nghiên cứu nhận thấy, hàm lượng alkaloid chiết xuất từ thân củ nghệ đen sử dụng tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi 1/30 (w/v) đạt 100,67±0,67 mg AE/g khác biệt ý nghĩa mặt thống kê (p>0,05) so với tỷ lệ ngun liệu/ dung mơi cao Do đó, nhóm nghiên cứu chọn tỷ lệ nguyên liệu/ dung mơi thích hợp 1/30 để tiết kiệm ngun liệu, dung mơi chi phí cho q trình chiết xuất 3.2 Tối ưu hóa quy trình chiết xuất alkaloid từ thân củ nghệ đen Bảng Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố thân củ nghệ đen Nghiệm thức 10 11 12 13 14 15 16 17 Các biến độc lập Ethanol Nhiệt độ Thời gian (%, v/v) (oC) (phút) 60 50 15 80 50 15 60 70 15 80 70 15 60 60 10 80 60 10 60 60 20 80 60 20 70 50 10 70 70 10 70 50 20 70 70 20 70 60 15 70 60 15 70 60 15 70 60 15 70 60 15 Hàm lượng alkaloid (mg GAE/g cao chiết) Hàm lượng thực nghiệm Hàm lượng dự đoán 254,44d±3,01 232,89e±1,39 251,33d±0,67 274,67c±2,40 202,67gh±2,40 201,11h±1,02 213,33f±2,67 157,78k±2,34 190,44i±2,34 207,33g±1,76 179,33j±1,33 189,11i±2,34 287,56b±0,77 279,11c±1,68 293,56a±1,39 288,89ab±1,39 285,11b±2,14 236,51 227,03 257,20 265,81 194,83 208,06 206,39 165,57 189,36 209,25 177,42 190,20 286,85 286,85 286,85 286,85 286,85 Ghi chú: Các ký tự theo sau cột giống khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p0,05) điều cần thiết [16] Thêm vào đó, mơ hình tương quan tốt cần có hệ số xác định tương quan R2 lớn 0,8 [17] Kết phân tích cho thấy hệ số tương quan R2 mơ hình dự đốn 0,9825 lớn 0,8 giá trị Lack of fit 0,0692 lớn 0,05 Vì vậy, khả phù hợp mơ hình dự đoán với thực nghiệm cho hàm lượng alkaloid cao Hệ số biến động (CV) hàm lượng alkaloid 3,83%, điều cho thấy giá trị CV tương đối thấp, thể mơ hình phản hồi có độ tin cậy tốt [11] Các hệ số phương trình hồi quy có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p0,05) Bảng Phân tích hệ số tương quan yếu tố đến hàm lượng alkaloid Nguồn Model A-Ethanol B-Nhiệt độ C-Thời gian AB AC BC A² B² C² Residual Lack of Fit Pure Error Cor Total Sum of squares 31789,91 382,54 533,66 480,50 503,78 728,73 12,64 1034,12 1340,33 25257,99 565,67 453,05 112,62 32355,58 Df 1 1 1 1 16 Mean square 3532,21 382,54 533,66 480,50 503,78 728,73 12,64 1034,12 1340,33 25257,99 80,81 151,02 28,16 R²=0,9825 F-value 43,71 4,73 6,60 5,95 6,23 9,02 0,1564 12,80 16,59 312,56 p-value