TNU Journal of Science and Technology 227(10) 197 204 http //jst tnu edu vn 197 Email jst@tnu edu vn ASSESSMENT OF GENETIC VARIATION OF TOBACCO GENOTYPES (Nicotiana tabacum) IN VIETNAM BASED ON AGRO M[.]
TNU Journal of Science and Technology 227(10): 197 - 204 ASSESSMENT OF GENETIC VARIATION OF TOBACCO GENOTYPES (Nicotiana tabacum) IN VIETNAM BASED ON AGRO-MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS AND SSR MARKERS Nguyen Hong Nhung1, Tran Thi Thanh Hao2, Nguyen Van Van2 , Ho Manh Tuong1, Tran Thi Huyen1, Nguyen Dinh Trong1, Chu Hoang Ha1, Do Tien Phat1* 1Institute of Biotechnology – VAST, 2Tobacco Institute One member Company Limited ARTICLE INFO ABSTRACT Received: 02/5/2022 Tobacco (Nicotiana tabacum) is an important non-crop cultivated worldwide including Vietnam Plant morphology, agronomic traits and chemical components have been mainly used recently for tobacco selection and breeding programs in Vietnam Molecular markers have been successfully developed and used for tobacco improvement worldwide, but the reports on utilizing these markers for Vietnamese tobacco cultivars are very limited In this study, variation of 71 local tobacco genotypes was assessed basing 16 important agromorphological traits and SSR markers The classification based on the agromorphological traits revealed three distinguishable groups with differences in the total leaf number, the leaf length and width as well as the fresh and dry leaf weight The SSR results showed a great genetic diversity among the tested tobacco population Particularly, the Shannon's diversity index (I) and Unbiased Expected Heterozygosity (Uhe) values were more than 0.5 Interestingly, the classification of tested tobacco based on the SSR markers was highly consistent with the results of the agromorphological division, especially for yield-related traits Our results provide a potential to develop and utilize the SRR markers for tobacco breeding programs in near future Revised: 14/7/2022 Published: 14/7/2022 KEYWORDS Gene resources Morphological markers SSR markers Genetic diversity Nicotiana tabacum ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG NGUỒN GEN THUỐC LÁ (Nicotiana tabacum) TẠI VIỆT NAM DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR Nguyễn Hồng Nhung1, Trần Thị Thanh Hảo2, Nguyễn Văn Vân2 , Hồ Mạnh Tường1, Trần Thị Huyền1, Nguyễn Đình Trọng1, Chu Hồng Hà1, Đỗ Tiến Phát1* 1Viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam ty TNHH Một thành viên Viện Thuốc 2Cơng THƠNG TIN BÀI BÁO TĨM TẮT Thuốc (Nicotiana tabacum) công nghiệp quan trọng Việt Nam Hiện nay, công tác tuyển chọn, lai tạo giống thuốc nước ta Ngày hoàn thiện: 14/7/2022 chủ yếu dựa đặc điểm hình thái tiêu chí chất lượng Việc phát triển ứng dụng thị phân tử mang lại nhiều thành công chọn Ngày đăng: 14/7/2022 tạo giống thuốc giới, nhiên nghiên cứu Việt Nam hạn chế Trong nghiên cứu này, kết hợp 16 đặc điểm hình thái TỪ KHĨA thị phân tử SSR để đánh giá đa dạng 71 nguồn gen thuốc Việt Nguồn gen Nam Kết đánh giá dựa đặc điểm hình thái cho thấy dịng thuốc phân chia thành nhóm với khác biệt đặc điểm hình thái quan Đặc điểm hình thái trọng tổng số lá, chiều dài, rộng lá, khối lượng khô tươi Ở kết Chỉ thị SSR đánh giá đa dạng di truyền dựa thị SSR, 71 nguồn gen thuốc Đa dạng di truyền nghiên cứu có tính đa dạng cao với số đa dạng di truyền Shannon (I) giá Nicotiana tabacum trị khác biệt di truyền (Uhe) lớn 0,5 Đáng ý, kết phân nhóm thơng qua thị phân tử SSR có mức độ tương đồng cao với cách chia nhóm dựa đặc điểm hình thái, đặc biệt tiêu suất Điều cho thấy tiềm phát triển ứng dụng thị phân tử SSR hỗ trợ công tác chọn tạo giống thuốc Việt Nam tương lai DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.5932 Ngày nhận bài: 02/5/2022 * Corresponding author Email: dtphat@ibt.ac.vn http://jst.tnu.edu.vn 197 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 197 - 204 Giới thiệu Thuốc (Nicotiana tabacum) công nghiệp quan trọng với giá trị kinh tế cao giới Việt Nam [1], [2] Tại Việt Nam, công tác nhập nội lai tạo giống thuốc suất chủ yếu dựa đặc điểm hình thái cho kết hạn chế, đồng thời tốn nhiều thời gian công sức Vì vậy, việc phát triển cơng cụ sinh học phân tử kết hợp với phân tích hình thái chọn, tạo giống thuốc chiến lược tiềm quan tâm năm gần Các trình tự lặp lại đơn giản (SSR), biết đến thị phân tử hiệu ứng dụng nghiên cứu đa dạng di truyền chọn tạo giống thuốc [3], [4] Yang đồng tác giả (2020) ghi nhận thị SSR thử nghiệm cho tính đa hình di truyền với 10 giống thuốc phân tích [5] Ngồi ra, 120 thị SSR phát triển sử dụng nghiên cứu đa dạng di truyền 231 dòng thuốc nghiên cứu Tong đồng tác giả [4] Gần đây, số nghiên cứu xây dựng phát triển thị SSR có tính tương quan cao với tính trạng hình thái ứng dụng chọn tạo giống trồng, có thuốc [6] Điển hình, nghiên cứu Darvishzadeh đồng tác giả (2013) 35 giống thuốc với đặc điểm kiểu hình 13 thị SSR cho thấy có tương đồng cao kết phân nhóm [6] Ở Việt nam, việc kết hợp kết phân tích đa dạng quần thể dựa đặc điểm hình thái thị phân tử rút ngắn thời gian nâng cao hiệu lai tạo giống ngô, bơ [7], [8] Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền giống thuốc hạn chế Hiện nay, chưa có cơng bố đánh giá tương quan thị phân tử SSR đặc điểm hình thái giống thuốc Việt Nam Trong nghiên cứu này, sử dụng 16 đặc điểm hình thái thị SSR để đánh giá đa dạng 71 nguồn gen thuốc lưu giữ Viện thuốc lá, đồng thời phân tích tương quan hai loại thị Phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu nghiên cứu Vật liệu: 71 dòng thuốc cung cấp Công ty TNHH thành viên Viện Thuốc với thơng tin đặc điểm hình thái điển hình (Bảng 1) Các thị SSR (Bảng 2) liên kết với số đặc điểm nông sinh học điển hình số giống thuốc tham khảo nghiên cứu trước [5] Bảng Thơng tin 16 đặc điểm hình thái 71 giống thuốc nghiên cứu STT 10 11 12 13 14 15 16 Giá trị thấp Tính trạng Chiều cao sinh học chùm hoa (cm) Chiều cao sinh học (không bao gồm chùm hoa) (cm) Tổng số (lá) Dài (cm) Rộng (cm) Góc gân (độ) Góc đóng thân (độ) Khối lượng tươi (gram) Khối lượng khô (gram) Tỷ lệ tươi/khô Tỷ lệ cọng (%) Tỷ lệ cấp (%) Đường kính thân (cm) Độ dài lóng (cm) Năng suất khơ thực thu (tấn/ha) Năng suất khô lý thuyết (tấn/ha) http://jst.tnu.edu.vn 198 119,0 86,0 12,6 36,9 14,4 39,5 36,8 12,0 1,8 6,3 20,0 11,0 1,8 3,7 0,6 0,6 Giá trị lớn Giá trị trung bình 238,1 216,8 35,5 72,6 39,7 87,1 70,1 79,0 8,9 9,5 40,0 90,0 3,9 9,9 2,0 3,0 173,5±23,71 138,38±25,94 19,74±4,35 62,36±7,47 30,86±5,45 67,14±11,77 49,37±7,4 49,23±13,29 6,3±1,7 7,96±0,78 27,59±4,1 51,84±14,9 2,73±0,37 6,67±1,5 1,14±0,28 1,66±0,48 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 197 - 204 2.2 Phương pháp nghiên cứu Tách chiết DNA tổng số: Mẫu non 71 giống thuốc tách chiết DNA theo phương pháp CTAB Ziegenhagen cộng (1993) với số cải tiến [9] Nồng độ độ tinh DNA kiểm tra gel agarose 0,8% quang phổ hấp phụ OD260/280 sử dụng hệ thống NanoDrop Lite (Thermo scientific, USA) DNA pha loãng nồng độ 100 ng/µl sử dụng PCR Phân tích đặc điểm hình thái: 16 đặc điểm hình thái mã hóa, sử dụng phần mềm NTSYS để xây dựng phả hệ SAHN dựa vào hệ số tương đồng Jaccard phương pháp UPGMA để phân nhóm [6], [8] Phân tích thị SSR: PCR-SSR 71 giống thuốc với cặp mồi SSR (Bảng 2) thực máy VeritiTM 96 well thermal Cycler (Applied Biosystems, USA), quy trình chạy PCR thực theo phương pháp Darvishzadeh cộng (2013) [6] Sản phẩm PCRSSR phân tích thơng qua phương pháp điện di gel polyacrylamide 15% với đệm 1X TBE, sau gel soi đèn UV chụp ảnh [6] Bảng Thông tin cặp mồi SSR sử dụng để đánh giá đa dạng 71 dịng thuốc [5] STT Tên thị TM10481 Trình tự mồi (5’-3’) Kiểu lặp ATA CGATTGGTCGCGAATTTACT CGCATCTTTCGTCCTCTGA PT54964 TA GAGAACCGTACGTTGGTCAAA TTCTTCCTATTCGGTGTTTCTGA TM20580 ACA TGGAAACGTTTGCTTAAGGGTA GTGCAACGTGGACATTTGAA TM10846 GAA AGCAGAGCTGCCTATGGAAA AAGATTTGATCGCTGCGTTT PT60728 CA TGAGTATTCGCACGCACAGT CCACAGTTCCTCTCAGCGTT Các băng vạch sản phẩm SSR mã hóa để phân tích đa dạng di truyền phần mềm Microsoft Excel 2016 biểu đồ quan hệ di truyền nguồn gen thuốc xây dựng phần mềm NTSYS 2.02 Để đánh giá hiệu phân tích thị SSR, lượng thơng tin tính đa hình PIC (Polymorphic Information Content) hay hệ số đa hình di truyền cho locus (i) tính theo cơng thức PIC(i) = – Σ Pij2 (trong đó: Pij tần suất allen thứ j với locus thứ i) [10] Phân nhóm dựa hệ số tương đồng Jaccard: sau mẫu nghiên cứu xử lý với phần mền NTSYS 2.02 để tính hệ số tương đồng di truyền lập biểu đồ quan hệ di truyền đối tượng nghiên cứu [11] Các thông số đa dạng di truyền số allele trung bình (Na), số allele hiệu (Ne), số đa dạng di truyền Shannon (I) dựa phần mềm GenAlEx4 [12] Kết thảo luận 3.1 Đa dạng dịng thuốc theo đặc điểm hình thái 3.1.1 Phân tích số đặc điểm hình thái quan trọng Số tiêu hình thái quan trọng số tính trạng cấu thành nên suất thuốc thương phẩm [13] Đối với nguồn gen thuốc lưu giữ Viện nghiên cứu thuốc lá, điều kiện trồng trọt thông thường, tổng số dao động 16-25 có dịng thuốc có tổng số nằm khoảng 32-38 Chiều dài dòng thuốc phân bố tập trung khoảng 62-72 cm, chiều rộng phân bố khoảng 26-43 cm Các tính http://jst.tnu.edu.vn 199 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 197 - 204 trạng kiểu hình khác bao gồm góc gân, góc đóng thân, khối lượng tươi, khối lượng khô, tỷ lệ tươi/khô, tỷ lệ cọng lá, tỷ lệ cấp cấp có khoảng biến động lớn (Bảng 1) Sự biến động tính trạng kiểu hình báo cáo nghiên cứu trước [6] 3.1.2 Mối tương quan 71 nguồn gen thuốc thông qua đặc điểm hình thái Nghiên cứu trước cho thấy phân nhóm dựa đặc điểm hình thái phù hợp với phân bố dòng thuốc theo địa điểm trồng đặc tính sinh trưởng [6] Trong nghiên cứu này, thơng tin tính trạng kiểu hình chúng tơi thu thập phân tích theo phả hệ SAHN dựa vào hệ số tương đồng Jaccard phương pháp UPGMA [6], [8] Cây phân nhóm theo tính trạng kiểu hình 71 nguồn gen thuốc trình bày Hình Dựa theo đặc điểm kiểu hình, 71 dịng thuốc chia thành nhóm gồm nhóm I (38 dịng), nhóm II (29 dịng) nhóm III (4 dịng) (Hình 2; Bảng 4) Trong đó, nhóm I bao gồm nhóm phụ: Ia gồm 13 dịng, Ib gồm có 15 dịng, Ic gồm dịng nhóm Id gồm dịng Nhóm II chia thành nhóm phụ: IIa gồm 22 dòng, IIb gồm dòng Trong đó, nhóm III bao gồm dịng Phân tích hình thái cho thấy, mẫu chia theo phân nhóm phân loại có liên quan trực tiếp tới đặc điểm hình thái độ dài lá, độ rộng lá, khối lượng tươi, khối lượng khơ, suất khơ Trong đó, dịng có suất cao tập trung nhóm I (ví dụ dịng Vir4241-3, Kussaga_51E, SPG140, Vir315, Coker_213, Coker_251, PMRR-4, vv ), tiếp nhóm II thấp nhóm III 3.2 Đa dạng di truyền 71 dịng thuốc thơng qua thị SSR 3.2.1 Đa hình thị SSR Bảng Kết phân tích 71 giống thuốc với thị SSR Locus TM10481 PT54964 TM20580 TM10846 PT60728 Tổng Trung bình Kích thước (bp) 150-189 216-288 148-151 121-252 161-230 Phân đoạn đa hình 4 16 3,4 Phân đoạn đơn hình 0 0 % phân đoạn đa hình 100 100 100 100 100 100 PIC I Uhe F 0,86 0,89 0,72 0,91 0,94 0,985 0,868 0,630 1,075 1,374 0,592 0,544 0,441 0,636 0,749 0,832 -0,850 1,000 -0,584 -0,344 0,864 0,987 0,593 0,011 Khi phân tích 71 dịng thuốc với thị SSR, chúng tơi thu tổng số 16 alen với kích thước dao động từ 121 đến 288 bp (Bảng 3) Đặc biệt, toàn 16 alen thu ghi nhận đa hình mẫu thuốc phân tích Hàm lượng thơng tin đa hình PIC cao nằm khoảng từ 0,72 đến 0,91 Giá trị PIC trung bình thị SSR nghiên cứu (0,864) cao so với nghiên cứu trước thuốc (0,3603 - 0,538) [14], [15] Tuy nhiên, số alen trung bình locus (3,4) thấp so với hầu hết kết công bố (6,84 - 14,7) [14], [16] Ngoài ra, giá trị PIC lớn 0,5 cho thấy thị có giá trị phân tích đa dạng di truyền 71 dòng thuốc nghiên cứu 3.2.2 Quan hệ di truyền 71 dòng thuốc thông qua thị SSR Đặc điểm quan hệ di truyền cần thiết việc lai tạo chọn giống trồng Các nhóm xa mặt di truyền trở thành bố mẹ tiềm cơng tác lai tạo [17] Vì vậy, với phân tích tương quan kiểu hình dịng thuốc lá, thị SSR tiếp tục sử dụng để đánh giá độ đa dạng di truyền mẫu nghiên cứu (Bảng 3, Hình 2) http://jst.tnu.edu.vn 200 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 197 - 204 Hình Biểu đờ phân nhóm thể tương đờng 71 dịng thuốc dựa 16 tiêu hình thái Chỉ số đa dạng di truyền Shannon (I) nằm khoảng 0,630 đến 1,374 với giá trị trung bình đạt 0,986 (Bảng 4) Kết có tương đồng biến động so với nghiên cứu gần thuốc Cụ thể, số I trung bình lớn so với kết nghiên cứu He đồng tác giả (2020) với I = 0,7228 [15] Tuy nhiên, với giá trị số I > 0,5 cho thấy quần thể mẫu nghiên cứu chưa có nguy cận huyết an tồn để tạo tổ hợp lai Ngoài ra, số cố định trung bình (F) đạt 0,011, cho thấy dịng thuốc nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền cao Mặc dù vậy, số F > phản ánh tình trạng suy giảm đa dạng sinh học quần thể mẫu thuốc nghiên cứu Giá trị khác biệt di truyền (Uhe) đạt từ 0,441 đến 0,749 với trung bình đạt 0,593 Giá trị Uhe > 0,5 tương đương nghiên cứu Fricano cộng (2012) (0,59), lần cho thấy dòng thuốc nghiên cứu có đa dạng cao di truyền [16] Cây phân loại di truyền 71 dòng thuốc dựa thị chia thành nhóm chính: nhóm I (29 dịng), nhóm II (39 dịng) nhóm III (3 dịng) (Hình 2; Bảng 4) Trong đó, nhóm I bao gồm nhóm phụ: Ia gồm 11 dịng, Ib gồm dịng Nhóm II bao gồm nhóm phụ: IIa gồm 20 dịng, IIb gồm dịng Từ kết phân nhóm dựa đặc điểm hình thái đặc điểm di truyền thơng qua thị SSR, chúng tơi ghi nhận dịng thuốc có khác biệt lớn có giá trị cơng tác lai tạo, chọn dịng thuốc phục vụ sản xuất tương lai http://jst.tnu.edu.vn 201 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 197 - 204 Hình Cây phân loại di truyền 71 dòng thuốc dựa thị SSR 3.3 Tương quan đặc điểm hình thái đặc điểm di truyền 71 dòng thuốc nghiên cứu Kết phân tích giống khác 71 dòng thuốc dựa phân loại lập theo đặc điểm hình thái theo thị SSR thể Bảng Trong đó, 14 dịng thuộc nhóm I (C30, CMS1303, Kazimisiki, Kussaga_E51, Coker_213, Coker_251, NC95-2, SPG140, P1349-2, DH_56-19, Trung_hoa_bai_1, Vir4241-3, Bel-619, Re_vang) 16 dịng thuộc nhóm II (Coker_347, Coker_254, Macneir_30, NC17, SPG52, SPG58, SPG70, Hicsh_187, Vir87, Vir168, Vir4241, Vir52-1, C7.1, C176, C91) theo cách phân nhóm đặc điểm hình thái SSR Kết cho thấy, kết phân nhóm 71 dòng thuốc dựa theo thị SSR có độ tương quan cao với kết phân tích với 16 thị kiểu hình Cụ thể, phần lớn dịng thuốc nằm nhóm dựa theo kết phân tích thị SSR có độ tương đồng cao đặc điểm hình thái độ dài lá, độ rộng lá, khối lượng tươi, khối lượng khơ, suất khơ Trong đó, dịng nằm nhóm I có giá trị hình thái lớn nhất, dịng nhóm II mang giá trị trung bình thấp nhóm III Điều cho thấy giá trị thị SSR cho công tác đánh giá đa dạng di truyền chọn tạo giống thuốc Kết đánh giá đa dạng 71 dòng thuốc kết hợp đặc điểm hình thái thị SSR phù hợp với nghiên cứu trước [6]-[8] Cụ thể nghiên cứu trước thuốc lá, ngơ, bơ cho kết phân nhóm theo kiểu hình thị SSR có tương đồng cao http://jst.tnu.edu.vn 202 Email: jst@tnu.edu.vn TNU Journal of Science and Technology 227(10): 197 - 204 Bảng Sự giống khác 71 dòng thuốc dựa đặc điểm hình thái thị SSR Kí hiệu dịng HT SSR C30 I I CMS1303 I I Dai_kim_tinh II Kazimisiki Kí hiệu dịng HT SSR Kí hiệu dịng HT SSR Kí hiệu dịng HT SSR NC17 II II Trung_hoa_bai_2 I II Bel-6112 I II NC82 I II Vir23-5-3 I II Bel-619 I I III NC95-1 II I Vir276_Krawat I II Re_vang I I I I NC95-2 I I Vir297 II I Kussaga_E1 I II NC628 II II Vir131 I II Dupnitsa_126 III I Kussaga_51E I I SPG28 II I Vir315 I II Dupnitsa_160 III III Coker_319 I II SPG28-3 I II White_gold II I III I Coker_48E I II SPG52 II II D_V_D I II Tekne_11 III I Coker_213 I I SPG58 II II Vir3X II I I II Coker_251 I I SPG67 I II Vir87 II II Riogrand II I Coker_347 II II SPG70 II II Vir97 I II Tennesse_90 I II Coker_254 II II SPG140 I I Vir197 I II TL16 II I Macneir_30 II II HR62-3 I II Vir168 II II C7.1 II II Macneir_373 II I Hicsh_187 II II Vir188 II I II I Macneir_944-2 II I P1349-2 I I Vir4241 II II C176 II II Nyieseyi_1 I II DH_56-19 I I Vir4241-2 I II K326 II I NC12 I II PMRR-4 I II Vir4241-3 I I II II NC13-1 I II Trung_hoa_bai_1 I I Vir52-1 II II Sieu_la_cao_cay II Rila_82 Criocdo SpG168 C91 III Kí hiệu: HT-nhóm lập theo đặc điểm hình thái; SSR- nhóm lập theo thị SSR Kết luận Dựa 16 đặc điểm hình thái thị SSR, 71 dịng thuốc Việt Nam có tính đa dạng cao có giá trị cơng tác lai tạo chọn dòng thuốc suất tốt phục vụ sản suất Kết phân nhóm dịng thuốc dựa thị SSR có tương đồng cao với phân nhóm dựa đặc điểm hình thái, cho thấy tiềm ứng dụng thị phân tử phục vụ cho công tác đánh giá đa dạng di truyền chọn giống thuốc nước ta Lời cảm ơn Nghiên cứu thực kinh phí nhiệm vụ “Đánh giá nguồn gen thuốc lá” cấp Bộ Công Thương năm 2021 (HĐ số 036.2021.QUYGEN.BO/HĐKHCN) TÀI LIỆU THAM KHẢO/ REFERENCES [1] Food and Agriculture Organization, “Food and Agricultural Commodities Production,” 2016 [Online] Available: http://www.fao.org/faostat [Accessed Feb 8, 2020] [2] Data of main industrial products, “General Statistics Office,” 2019 [Online] Available: https://www.gso.gov.vn/cong-nghiep/ [Accessed Jan 21, 2022] [3] S Doganla, A Frary, M C Daunay, R N Lester, and S D Tanksley, “A comparative genetic linkage map of eggplant (Solanum melongena) and its implications for genome evolution in the Solanaceae,” Genetics, vol 161, pp 1697-1711, 2002 http://jst.tnu.edu.vn 203 Email: jst@tnu.edu.vn ... nghiên cứu sử dụng thị phân tử để đánh giá đa dạng di truyền giống thuốc hạn chế Hiện nay, chưa có cơng bố đánh giá tương quan thị phân tử SSR đặc điểm hình thái giống thuốc Việt Nam Trong nghiên... 35 giống thuốc với đặc điểm kiểu hình 13 thị SSR cho thấy có tương đồng cao kết phân nhóm [6] Ở Việt nam, việc kết hợp kết phân tích đa dạng quần thể dựa đặc điểm hình thái thị phân tử rút ngắn... mang giá trị trung bình thấp nhóm III Điều cho thấy giá trị thị SSR cho công tác đánh giá đa dạng di truyền chọn tạo giống thuốc Kết đánh giá đa dạng 71 dòng thuốc kết hợp đặc điểm hình thái thị