Microsoft Word 118 Tran Khanh Hoa doc Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2019 ISBN 978 604 82 2981 8 487 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ BETA HCG TRÊN BỀ MẶT GIẾNG POLYSTYRENE Trần Khán[.]
Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2019 ISBN: 978-604-82-2981-8 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH KHÁNG THỂ BETA HCG TRÊN BỀ MẶT GIẾNG POLYSTYRENE Trần Khánh Hòa Trường Đại học Thủy lợi, email: hoatk@wru.vn GIỚI THIỆU CHUNG hCG (hormone Chorionic gonadotropin) glycoprotein thai tiết gồm hai tiểu đơn vị: alpha beta Nồng độ beta hCG phát huyết thai phụ vào khoảng - ngày sau rụng trứng nên thường dùng để chẩn đoán có thai chậm kinh Trong sản khoa, định lượng hCG định theo dõi sảy thai, thai lưu, chửa tử cung sàng lọc dị tật bẩm sinh [5] Ngồi ra, beta hCG cịn chất điểm sinh học sàng lọc sớm ung thư tinh hồn, buồng trứng Do đó, việc định lượng beta hCG có ý nghĩa quan trọng cơng tác chăm sóc sức khỏe cộng đồng Phương pháp miễn dịch huỳnh quang phương pháp định lượng thường sử dụng phòng xét nghiệm y sinh Cơ sở phương pháp dựa liên kết đặc hiệu cặp kháng thể với chất phân tích, kháng thể dò gắn với chất đánh dấu phát huỳnh quang số nguyên tố thuộc họ Lantanoit Eu3+; Tb3+, Sm3+…, kháng thể cố định gắn lên bề mặt giếng [1, 3] Cố định kháng thể beta hCG lên bề mặt giếng nhờ hấp phụ kháng thể lên bề mặt giếng nên tính chất, chức protein khơng bị biến tính q trình cố định [2, 4] Tuy nhiên, độ bền tương tác lại bị phụ thuộc nhiều vào nhiều yếu tố như: tính chất bề mặt giếng, pH, thời gian hấp phụ nồng độ kháng thể Những nhược điểm làm cho kháng thể dễ bị rửa trôi số dung dịch đệm dung dịch rửa thực phân tích Do đó, cần phải lựa chọn điều kiện cố định kháng thể beta hCG phù hợp đảm bảo phép phân tích nhanh chóng với chi phí thấp đảm bảo tính xác phép đo Ở đề tài này, nghiên cứu khả cố định kháng thể beta hCG bề mặt giếng polystyrene PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các hóa chất dùng nghiên cứu dạng tinh khiết dùng cho phân tích y sinh: đĩa 96 giếng (bề mặt Polystyren); polyclonal Antibody beta hCG (4750µg/mL); dung dịch đệm phosphate (PBS buffer 0,01M); NaN3 0,5%; dung dịch khóa giếng BSA 1% [3] Định lượng beta hCG phương pháp miễn dịch huỳnh quang mô tả qua hình gồm bước [3]: Hình Quy trình định lượng beta hGC phương pháp miễn dịch huỳnh quang – Cố định kháng thể beta hCG lên bề mặt giếng polystyren – Khóa giếng dung dịch BSA 1% PBS 0,01M, ủ 4oC – Thêm kháng nguyên beta hCG để phản ứng đặc hiệu với kháng thể cố định – Thêm kháng thể dò đánh dấu huỳnh quang 487 Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2019 ISBN: 978-604-82-2981-8 – Đo cường độ huỳnh quang thu máy Victor 2D (PerkinElmer) Chúng khảo sát độ bền yếu tố ảnh hưởng đến độ bền kháng thể hCG cố định bề mặt giếng polystyren độ lặp phép phân tích KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng thể beta hCG cố định bề mặt giếng Chúng khảo sát với nồng độ khác kháng thể hCG (1,25; 2,50; 5,00 10 µg/mL) cố định lên bề mặt polystyrene 20h 4oC Kết trình bày Bảng Hình trơi làm cường độ huỳnh quang giảm Nồng độ tối ưu kháng thể beta hCG để cố định giếng polystyren 2,5 µg/mL 3.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố định kháng thể beta hCG lên bề mặt giếng Chúng tiến hành cố định với khoảng thời gian khác (2; 5; 10; 20 24 giờ) với nồng độ kháng thể beta hCG 2,5µg/mL nhiệt độ 4oC Kết cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào thời gian cố định kháng thể trình bày Hình Bảng Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang mẫu hCG chuẩn vào nồng độ kháng thể hCG Mẫu chuẩn hCG (ng/mL) 10,6 106 1030 5180 10100 Hình Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang mẫu hCG chuẩn vào thời gian cố định kháng thể Nồng độ kháng thể hCG (µg/mL) 1,25 2,5 5,0 10 Thời gian cố định kháng thể tăng từ đến 20 cường độ huỳnh quang tăng, nhiên tăng thời gian cố định lên đến 24 cường độ huỳnh quang gần đổi Do đó, 20 khoảng thời gian phù hợp để cố định kháng thể hCG bề mặt giếng polystyren 1337 1528 1873 1856 1866 3063 4230 3223 4102 19123 28588 23199 13896 192435 179829 167366 26854 584593 466527 339070 37291 626791 448644 396931 3.3 Khảo sát độ lặp phép phân tích Nghiên cứu sử dụng 10 giếng với nồng độ kháng thể beta hCG 2,5µg/mL, cố kháng 20 mẫu chuẩn beta hCG có nồng độ 1030 ng/ml Kết cường độ huỳnh quang thu được trình bày Bảng Hình Hình Sự phụ thuộc cường độ huỳnh quang mẫu beta hCG chuẩn vào nồng độ kháng thể beta hCG Bảng Cường độ huỳnh quang 10 mẫu chuẩn hCG có nồng độ 1030 ng/mL Khi tăng nồng độ kháng thể 5µg/mL, cường độ huỳnh quang giảm Điều giải thích kháng thể xếp chồng lên Khi phản ứng bắt cặp xong bị rửa 488 Giếng Cường độ 251948 230271 239183 219991 225152 Giếng 10 Cường độ 220720 218217 213751 199458 241396 Tuyển tập Hội nghị Khoa học thường niên năm 2019 ISBN: 978-604-82-2981-8 Kết nghiên cứu Bảng cho thấy kháng thể beta hCG cố định bền khoảng thời gian tháng độ bền kháng thể beta hCG giếng polystyren giảm dần theo thời gian KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Hình Cường độ huỳnh quang 10 mẫu chuẩn beta hCG có nồng độ 1030 ng/mL Sử dụng Excel 2013 để tính hệ số biến thiên phép phân tích cho thấy kết có độ lặp tốt (CV 6,7%) 3.4 Khảo sát độ bền kháng thể hCG Nghiên cứu sử dụng 40 giếng cố kháng thể hCG với nồng độ 2,5µg/mL 20 để xác định mẫu chuẩn hCG có nồng độ 1030 ng/ml Các giếng sau cố định cất giữ cẩn thận túi zip nhiệt độ khoảng 4oC Hàng tuần, nghiên cứu lấy 10 giếng đo mẫu chuẩn beta hCG có nồng độ 1030 ng/mL ngày Cường độ huỳnh quang đo được trình bày Bảng đây: Bảng Kết cường độ huỳnh quang 10 mẫu chuẩn hCG nồng độ 1030 ng/mL tuần Lần 10 TB SD CV Tuần 251948 230271 239183 219991 225152 220720 218217 213751 199458 241396 226009 15210 6,7% Tuần 216442 238218 200895 230419 197279 224254 201567 249106 215342 211436 218496 17035 7,8% Tuần 234070 235044 192435 203588 179548 208033 207425 222197 210759 227471 212057 17970 8,5% Tuần 206586 208298 219910 217766 225069 198144 261320 183027 217487 234086 216279 21146 9,7% Chúng bước đầu cố định kháng thể beta hCG bề mặt giếng polystyren với điều kiện tối ưu: nồng độ kháng thể beta hCG 2,5µg/mL, thời gian cố định: 20 Kết phân tích phương pháp miễn dịch huỳnh quang có độ lặp tốt (CV 6,7%) độ bền cao giếng cố định beta hCG cho khả ứng dụng nghiên cứu để định lượng nồng độ beta hCG huyết bệnh nhân Ở nghiên cứu tiếp theo, khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ đặc hiệu phép phân tích, xây dựng đường chuẩn để định lượng beta hCG phương pháp miễn dịch huỳnh quang để xác định hàm lượng beta hCG mẫu huyết thực tế bệnh nhân TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Analytical Biochemistry, Optimization of Time-Resolved Fluorescence Assay for Detection of Eu-DOTA-labeled LigandReceptor Interactions; Channa R De Silva, Volume 398, Issue 1, March 2010, Pages 15-23 [2] Kunzelmann, S., Solscheid, C., and Webb, M R (2014), “Fluorescent biosensors: design and application to motor proteins.”, EXS105, 25–47.doi:10.1007/978-3-03480856-9_2 [3] Perkin Elmer, 2012, Delfia hCG, A007-101 [4] Scienedirect, 2005, Surface modification of polystyrene particles for specificantibody adsorption, Emmanuelle ImbertLaurenceaua, Polymer 46 (2005) 1277– 1285 [5] Võ Văn Đức, 2010, Tài liệu hướng dẫn sàng lọc & chẩn đoán trước sinh, Trường Đại học Y Dược Huế 489 ... Chúng khảo sát độ bền yếu tố ảnh hưởng đến độ bền kháng thể hCG cố định bề mặt giếng polystyren độ lặp phép phân tích KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Ảnh hưởng nồng độ kháng thể beta hCG cố định bề mặt giếng. .. Nồng độ tối ưu kháng thể beta hCG để cố định giếng polystyren 2,5 µg/mL 3.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian cố định kháng thể beta hCG lên bề mặt giếng Chúng tiến hành cố định với khoảng thời gian... (CV 6,7%) độ bền cao giếng cố định beta hCG cho khả ứng dụng nghiên cứu để định lượng nồng độ beta hCG huyết bệnh nhân Ở nghiên cứu tiếp theo, khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng,