Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT BẤT THƯỜNG PHÂN TỬ TRONG BỆNH LÝ THIỂU SẢN THƯỢNG THẬN BẨM SINH Lê Gia Hoàng Linh1, Lâm Văn Hoàng2, Đỗ Đức Minh1 TÓM TẮT Mục tiêu: Thiểu sản thượng thận bẩm sinh (AHC: adrenal hypoplasia congenita) bệnh lý di truyền theo nhiễm sắc thể X đặc trưng tình trạng suy thượng thận nguyên phát suy sinh dục thứ phát gặp nam giới Việc chẩn đốn xác bệnh lý lâm sàng cịn nhiều thách thức thường cần có chứng bất thường di truyền Đối tượng phương pháp: Nghiên cứu thực nghệm, tiến hành xây dựng quy trình giải trình tự gen NR0B1 Hai bệnh nhân nghi ngờ AHC khảo sát bất thường gen NR0B1 phương pháp giải trình tự Sanger Kết quả: Chúng tơi phát kiểu đột biến bán hợp tử gây bệnh bệnh nhân chẩn đoán AHC lâm sàng bao gồm c.1292delG (p Cys431Ilefs*5) c.622C>T (p Q208X) gen NR0B1 Cả đột biến báo cáo nguyên nhân gây bệnh AHC Kết luận: Chúng tơi xây dựng thành cơng quy trình khảo sát bất thường gen NR0B1 giúp chẩn đốn xác bệnh lý AHC Từ khóa: thiểu sản thượng thận bẩm sinh di truyền theo nhiễm sắc thể X (X-linked adrenal hypoplasia congenita), gen NR0B1, giải trình tự Sanger ABSTRACT MOLECULAR DIAGNOSIS OF ADRENAL HYPERPLASIA CONGENITA Le Gia Hoang Linh, Lam Van Hoang, Do Duc Minh * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 25 - No - 2021: 250 - 255 Objectives: X-linked adrenal hypoplasia congenita (AHC) is a rare hereditary disease characterized by primary adrenal insuffiency and hypogonadotropic hypogonadism in male patients The accurate diagnosis of AHC is still a challenge in clinical practice and usually requires molecular evidences Methods: This is an experimental study in which sequencing protocol of NR0B1 gene was established NR0B1 gene sequencing was performed in two patients suspected with AHC Results: Two hemizygous mutations were found in NR0B1 gene of the two probands including c.1292delG (p Cys431Ilefs*5) and c.622C>T (p Q208X) These two mutations were previously reported to be associated with AHC Conclusion: NR0B1 sequencing protocol was successfully developed and this allows the molecular diagnosis of AHC Keywords: X-linked adrenal hypoplasia congenita, NR0B1 gene, Sanger sequencing đường sinh tổng hợp hormon steroid ĐẶT VẤN ĐỀ bệnh lý tuyến thượng thận(1) Biểu Suy vỏ thượng thận nguyên phát bẩm sinh, lâm sàng suy thượng thận bẩm sinh thường đặc trưng tình trạng giảm thiểu sản xuất xuất sớm giai đoạn chu sinh hormon vỏ thượng thận aldosteron, cortisol cần điều trị thay với glucocorticoid và testosteron, bất thường 2Khoa Nội tiết – Bệnh viện Chợ Rẫy Trung tâm Y sinh học phân tử - ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS Đỗ Đức Minh ĐT: 0932 999989 Email: ducminh@ump.edu.vn 250 Chuyên Đề Nội Khoa – Lão Khoa Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 chí mineralocorticoid(2) Chẩn đốn ngun nhân suy thượng thận bẩm sinh thường khó khăn có vai trò quan trọng giúp tiên lượng bệnh tư vấn di truyền phù hợp(3) quy trình khảo sát gen NR0B1 nhằm phục vụ chẩn đoán xác định bệnh lý AHC có nghi ngờ lâm sàng Trong số nguyên nhân gây suy thượng thận nguyên phát, thiểu sản thượng thận bẩm sinh liên quan đến nhiễm sắc thể X (AHC: adrenal hypoplasia congenita; OMIM: 300200) bệnh lý di truyền gặp đặc trưng tình trạng thiếu hụt hình thành tế bào vỏ thượng thận(4), chiếm khoảng 0,97% nguyên nhân suy thượng thận nguyên phát trường hợp chẩn đoán trước 18 tuổi(5) Biểu lâm sàng chủ đạo bệnh lý suy vỏ thượng thận(3) suy sinh dục thứ phát vào giai đoạn dậy gặp nam giới Bệnh đột biến gen NR0B1 (Nuclear Receptor subfamily 0, group B, member 1); hay cịn có tên gọi khác gen DAX-1 (Dosage-sensitive sex reversal), gen mã hóa cho protein DAX-1, protein thụ thể nhân tế bào, có nhiều tế bào vùng hạ đồi, tuyến yên, tuyến sinh dục tuyến thượng thận(6,7) Biểu lâm sàng bệnh đa dạng tùy thuộc vào loại đột biến, tuổi xuất mức độ suy tuyến thượng thận, anh em gia đình mang đột biến giống có biểu lâm sàng khác nhau(8–10) Hầu hết đột biến gây bệnh đoạn lớn gen NR0B1 dẫn đến dị tật bẩm sinh kèm với biểu suy thượng thận, đó, đột biến sai nghĩa đoạn nhỏ biểu lâm sàng rõ rệt giai đoạn trưởng thành phần nhỏ chức sinh tổng hợp hormon tuyến thượng thận(11) Đối tƣợng nghiên cứu Vì bệnh lý gặp, việc chẩn đốn AHC lâm sàng cịn gặp nhiều khó khăn biểu lâm sàng dễ nhầm lẫn với bệnh lý khác tăng sản thượng thận bẩm sinh bệnh nhân phát giai đoạn sơ sinh nhũ nhi hay suy tuyến yên toàn bệnh nhân chẩn đốn vào giai đoạn dậy trưởng thành Do đó, thơng qua nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành xây dựng Chuyên Đề Nội Khoa - Lão Khoa ĐỐI TƢỢNG- PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Chúng tơi tiến hành giải trình tự DNA để phát đột biến gen NR0B1 cho bệnh nhân nam trưởng thành (24 tuổi 27 tuổi) nghi ngờ mắc AHC với biểu lâm sàng đặc trưng bao gồm suy thượng thận nguyên phát (ACTH tăng cao kèm với nồng độ cortisol máu thấp, aldosteron giới hạn bình thường) có biểu suy sinh dục thứ phát (LH, FSH testosterone giảm thấp) kèm với chức lại tuyến yên bảo tồn Phƣơng pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm nhằm mục tiêu xây dựng quy trình giải trình tự gen NR0B1 báo cáo trường hợp lâm sàng bệnh lý AHC Phương pháp thực Tách chiết DNA gene Bệnh nhân thu thập lấy ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đơng có EDTA, lắc nhẹ nhàng Genomic DNA tế bào bạch cầu máu tồn phần tách chiết vịng 24 kit GeneJetTM whole blood genomic DNA purification (Thermo Scientific, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất Phản ứng PCR khuếch đại giải trình tự gen mục tiêu Bảng 1: Bộ mồi dùng để khuếch đại exon mã hóa vùng intron lân cận gen NR0B1 Tên mồi Sequencing (5’→ 3’) NR0B1-1F1 TGAGAGGAAGGAGGAAAGTG NR0B1-1R2 CTAGTGAGCAAGCTGTAGAG NR0B1-1F3 CTGCTGCTTTTGCGGTAAAG NR0B1-1R3 ACTTCCACAGTCTCGAACTG NR0B1-1F2 TGCGCTTCGTCAAGTACTTG NR0B1-1R1 ACTCTGCTGAGTTAGTCACG NR0B1-2F TCTTGGACACGTTGCTTCTG NR0B1-2R GTACAGAGCTATGCTACCTG Kích thước khuếch đại (bp) 715 738 520 641 251 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Cặp mồi thiết kế tổng hợp (IDT, Mỹ) dựa trình tự DNA gen NR0B1 mang mã số NG_009814.1trong kho liệu NCBI (Bảng 1) Tiến hành phản ứng PCR: Mỗi tube PCR tích 15µl chứa thành phần: 1,5μl PCR buffer 10X; 1,5μl dNTP 2,5mM; 0,75μl cho cặp mồi xuôi ngược (10nM/μl) bên bên ngoài, 0,1μl TaKaRa Taq TM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản), 2μl genomic DNA (20-50ng/μl) 8,4μl nước cất lần khử ion Các phản ứng kèm theo chứng âm không chứa DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Chu trình ln nhiệt cho PCR thực máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức) Chu kỳ nhiệt: khởi đầu 980 C phút, với 40 chu kỳ lặp lại bước 980C: 20 giây, 580C: 20 giây, 720C: 60 giây; với bước 720C: phút Trữ sản phẩm PCR 160C Kỹ thuật giải trình tự Nghiên cứu Y học BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) cặp mồi thiết kế Bảng Sản phẩm sau kết tủa ethanol, hịa tan Hi-Di formanide, biến tính 950C trước làm lạnh đột ngột Trình tự DNA đọc máy ABI 3500 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) Kết giải trình tự DNA phân tích phần mềm CLC Main Workbench Bảng 2: Bộ mồi dùng để giải trình tự exon vùng intron lân cận gen NR0B1 Tên mồi NR0B1-1R2 NR0B1-1F3 NR0B1-1R3 NR0B1-1R1 NR0B1-2F Sequencing (5’→ 3’) CTAGTGAGCAAGCTGTAGAG CTGCTGCTTTTGCGGTAAAG ACTTCCACAGTCTCGAACTG ACTCTGCTGAGTTAGTCACG TCTTGGACACGTTGCTTCTG KẾT QUẢ Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh nhân tham gia nghiên cứu Sản phẩm PCR sau tinh Các thơng tin lâm sàng cận lâm sàng Exosap-IT glycerol solution (Affymetrix, Mỹ) bệnh nhân chẩn đoán thiểu sản thượng theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất thận bẩm sinh tóm tắt Bảng thực phản ứng cycle sequencing với Bảng 3: Đặc điểm lâm sàng cận lâm sàng bệnh nhân chẩn đoán AHC Đặc điểm Tuổi Giới Chiều cao Cân nặng Kiểu hình ACTH (7,9-66,1 ng/mL) Cortisol máu (50-230 ng/ml) Renin (4,4-46,1 mcrIU/mL) Aldosteron máu (1,76-39,2 ng/dL) FSH (1,3-11,8 mIU/mL) LH (2,8-6,8 mIU/mL) Testosteron (1,9-6,1 ng/mL) PTH (18,5-88 pg/mL) Phosphate (25-50 mg/L) Calci (1,1-1,3 mmol/L) FT4 (0,89-1,76 ng/dL) TSH (0,55-4,78 uIU/mL) 252 Bệnh nhân Bệnh nhân 24 tuổi 27 tuổi Nam Nam 187 cm 165 cm 45 kg Sạm da nhẹ Sạm da Suy sinh dục: thang điểm Tanner Suy sinh dục: thang điểm Tanner cho phận sinh dục lẫn cho phận sinh dục lẫn lông mu lông mu 1560 980 TT (p Q208*) lâm sàng Đầu tiên, việc xét nghiệm di truyền BÀN LUẬN cho người mẹ mang gen bệnh giúp cho việc AHC bệnh di truyền nhiễm chọn lọc tiền làm tổ chẩn đốn sắc thể X ảnh hưởng đến trình phân chia điều trị sớm cho bé trai mắc bệnh vừa biệt hóa tế bào vỏ thượng thận Tần suất đời nhằm hạn chế di chứng tử bệnh lý ước đoán vào khoảng vong(19) Bên cạnh đó, nhà lâm sàng 1:140,000 đến 1:1,200,000 trẻ sinh sống(3) Quá chắn nguy suy sinh dục trẻ dậy trình tăng trưởng biết hóa tế bào vỏ để lựa chọn xác thời điểm thượng thận tam cá nguyệt bị suy phương pháp điều trị phù hợp(20,21) Mặc dù tiên giảm bệnh lý AHC, ảnh hưởng đến lượng sinh sản bệnh nhân AHC dè dặt tiết cortisol lẫn aldosterone Một số ca bệnh nhân thường có tinh trùng lâm sàng thiếu hụt mineralocorticoid đơn độc cấu trúc mô học tinh hoàn bị thay đổi(22), báo cáo trước bệnh lý nhiên có bệnh nhân AHC thành này(14) Các bệnh nhân chẩn đốn sớm cơng việc ly trích tinh trùng thụ tinh giai đoạn sơ sinh với triệu chứng điển thành công báo cáo(23) Trong nghiên cứu chậm phát triển, nơn ói, muối chúng tơi, có kiểu đột biến bán hợp tử tăng sác tố da khó phân biệt với bệnh lý thiếu gen NR0B1 phát bao gồm hụt men 21-hydroxylase, vốn phổ biến c.1292delG (p Cys431Ilefs*5) nhiều Do đó, AHC thường chẩn đoán lầm c.621_622GC>TT (p Q208X) Cả kiểu đột biến với tăng sản thượng thận bẩm sinh (CAH: làm cho sản phẩm protein DAX1 bị cắt congenital adrenal hyperplasia)(15,16) Tuy nhiên, cụt dẫn đến chức khơng hồn chỉnh, nét đặc trưng bệnh lý AHC tiết kiểu đột biến báo cáo androgen giảm thiểu điều hồn cơng trình nghiên cứu trước đây(12,13) Các bệnh toàn trái ngược với bệnh lý CAH Từ đột nhân khơng chẩn đốn lâm sàng biến gen NR0B1 mô tả, AHC tuổi trưởng thành, bắt nay, có 100 kiểu đột biến gen đầu có biểu suy sinh dục Từ cho báo cáo Hầu hết đột biến đột biến thấy vai trò quan trọng việc chẩn đốn phân vơ nghĩa lệch khung đọc làm cho sản phẩm tử xác bệnh lý này, việc xác định protein cuối bị cắt ngắn(17,18) Chẩn đoán nguyên nhân di truyền hỗ trợ nhiều cho kế phân tử đột biến gen NR0B1 quan trọng 254 Chuyên Đề Nội Khoa – Lão Khoa Nghiên cứu Y học hoạch điều trị tư vấn di truyền cho người thân gia đình bệnh nhân KẾT LUẬN Thơng qua nghiên cứu này, chúng tơi xây dựng hồn chỉnh quy trình chẩn đốn phân tử đột biến gen NR0B1 có liên quan đến bệnh lý AHC Việc chẩn đốn xác AHC đóng vai trị quan trọng việc nâng cao nhận thức bệnh lý để bệnh nhân thân nhân tư vấn di truyền phù hợp Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 11 12 13 14 TÀI LIỆU THAM KHẢO: Huecker MR, Dominique E (2019) Adrenal Insufficiency In: StatPearls Treasure Island (FL): StatPearls Publishing URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK441832/ Pazderska A, Pearce SH (2017) Adrenal insufficiency – recognition and management Clin Med, 17(3):258-262 Lin L, Gu W-X, Ozisik G, et al (2006) Analysis of DAX1 (NR0B1) and steroidogenic factor-1 (NR5A1) in children and adults with primary adrenal failure: ten years’ experience J Clin Endocrinol Metab, 91(8):3048-3054 Zanaria E, Muscatelli F, Bardoni B, et al (1994) An unusual member of the nuclear hormone receptor superfamily responsible for X-linked adrenal hypoplasia congenita Nature, 372(6507):635-641 Perry R, Kecha O, Paquette J, Huot C, Van Vliet G, Deal C (2005) Primary adrenal insufficiency in children: twenty years experience at the Sainte-Justine Hospital, Montreal J Clin Endocrinol Metab, 90(6):3243-3250 Jadhav U, Harris RM, Jameson JL (2011) Hypogonadotropic Hypogonadism in Subjects with DAX1 Mutations Mol Cell Endocrinol, 346(1-2):65-73 Peter M, Viemann M, Partsch CJ, Sippell WG (1998) Congenital adrenal hypoplasia: clinical spectrum, experience with hormonal diagnosis, and report on new point mutations of the DAX-1 gene J Clin Endocrinol Metab, 83(8):2666-2674 Ali JM, Jalaludin MY, Harun F (2014) Late onset X-linked adrenal hypoplasia congenita with hypogonadotropic hypgonadism due to a novel 4-bp deletion in exon of NR0B1 J Pediatr Endocrinol Metab JPEM, 27(11-12):1189-1192 Sánchez-Pacheco M, Moreno-Pérez O, Sánchez-Ortiga R, Picó A, Moreno F (2012) Congenital adrenal hypoplasia and hypogonadotropic hypogonadism: phenotypic variability of the DAX-1 gene R267P mutation Endocrinol Nutr Organo Soc Espanola Endocrinol Nutr, 59(2):140-142 10 Calliari LEP, Rocha MN, Rocha MN, Monte O, Longui CA (2013) Mild adrenal insufficiency due to a NROB1 (DAX1) gene mutation in a boy presenting an association of hypogonadotropic hypogonadism, reduced final height and Chuyên Đề Nội Khoa - Lão Khoa 15 16 17 18 19 20 21 22 23 attention deficit disorder Arq Bras Endocrinol Metabol, 57(7):562565 Lin L, Achermann JC (2004) Inherited adrenal hypoplasia: not just for kids! Clin Endocrinol, 60(5):529-537 Loureiro M, Reis F, Robalo B, Pereira C, Sampaio L (2015) Adrenal Hypoplasia Congenita: A Rare Cause of Primary Adrenal Insufficiency and Hypogonadotropic Hypogonadism Pediatr Rep, 7(3) doi:10.4081/pr.2015.5936 Durmaz E, Turkkahraman D, Berdeli A, et al (2013) A novel DAX-1 mutation presented with precocious puberty and hypogonadotropic hypogonadism in different members of a large pedigree J Pediatr Endocrinol Metab JPEM, 26(5-6):551-555 Verrijn Stuart AA, Ozisik G, de Vroede MA, et al (2007) An amino-terminal DAX1 (NROB1) missense mutation associated with isolated mineralocorticoid deficiency J Clin Endocrinol Metab, 92(3):755-761 Mantovani RM, Pezzuti IL, Dias VMA, Silva IN (2009) Identification of a novel mutation in DAX1/NR0B1A gene in two siblings with severe clinical presentation of adrenal hypoplasia congenita Arq Bras Endocrinol Metabol, 53(6):771-776 Esden-Tempska Z, Lewczuk A, Tobias ES, Borozdin W, Kohlhase J, Sworczak K (2012) Delayed diagnosis of adrenal hypoplasia congenita in a patient with a new mutation in the NR0B1 gene J Pediatr Endocrinol Metab JPEM, 25(1-2):147-148 Krone N, Riepe FG, Dörr H-G, et al (2005) Thirteen novel mutations in the NR0B1 (DAX1) gene as cause of adrenal hypoplasia congenita Hum Mutat, 25(5):502-503 Li N, Liu R, Zhang H, et al (2010) Seven novel DAX1 mutations with loss of function identified in Chinese patients with congenital adrenal hypoplasia J Clin Endocrinol Metab, 95(9):E104-111 Ostermann S, Salvi R, Lang-Muritano M, et al (2006) Importance of genetic diagnosis of DAX-1 deficiency: example from a large, multigenerational family Horm Res, 65(4):163-168 Klein DA, Emerick JE, Sylvester JE, Vogt KS (2017) Disorders of Puberty: An Approach to Diagnosis and Management Am Fam Physician, 96(9):590-599 Loke KY, Larry KS, Lee YS, Peter M, Drop SL (2000) Prepubertal diagnosis of X-linked congenital adrenal hypoplasia presenting after infancy Eur J Pediatr, 159(9):671-675 Mantovani G, De Menis E, Borretta G, et al (2006) DAX1 and Xlinked adrenal hypoplasia congenita: clinical and molecular analysis in five patients Eur J Endocrinol, 154(5):685-689 Frapsauce C, Ravel C, Legendre M, et al (2011) Birth after TESEICSI in a man with hypogonadotropic hypogonadism and congenital adrenal hypoplasia linked to a DAX-1 (NR0B1) mutation Hum Reprod Oxf Engl, 26(3):724-728 Ngày nhận báo: 13/10/2020 Ngày nhận phản biện nhận xét báo: 01/02/2021 Ngày báo đăng: 10/03/2021 255 ... hormon tuyến thượng thận( 11) Đối tƣợng nghiên cứu Vì bệnh lý gặp, việc chẩn đốn AHC lâm sàng cịn gặp nhiều khó khăn biểu lâm sàng dễ nhầm lẫn với bệnh lý khác tăng sản thượng thận bẩm sinh bệnh nhân... ngờ lâm sàng Trong số nguyên nhân gây suy thượng thận nguyên phát, thiểu sản thượng thận bẩm sinh liên quan đến nhiễm sắc thể X (AHC: adrenal hypoplasia congenita; OMIM: 300200) bệnh lý di truyền... nhân suy thượng thận bẩm sinh thường khó khăn có vai trị quan trọng giúp tiên lượng bệnh tư vấn di truyền phù hợp(3) quy trình khảo sát gen NR0B1 nhằm phục vụ chẩn đoán xác định bệnh lý AHC có