U'NG DUNG CHAN DOAN PHAN TU’ TRONG BENH LY NHIEM
TS BS Nguyén Minh Ha
Trang 2MỤC TIỂU
»„ Giải thích được ưu điểm của KT SHPT so với các KT XN Vi sinh truyền thống
» Nêu được tối thiểu 5 ứng dụng của kỹ thuật SHPT trong việc chẩn đoán VSV gay
bệnh
»„ Giải thích được các ý nghĩa KQ âm tính và KO dương tính của XN chẩn đoán hoặc
theo dõi điều trị VSV gây bệnh bằng KT SHPT
Trang 3
Các phương pháp XN vi sinh
Các ứng dụng của KT SHPT trong bệnh nhiễm
Trang 4Các phương pháp xét nghiệm vi sinh
Trang 9
PHIEU KET QUA XET NGHIEM
Bénh pham: Mau mau
Ho tén: Nam sinh: 54 Gict Nam
BS chỉ định: Khoa Dược Nơi gửi: Ngày giờ lây mẫu: Chất lượng mẫu:
Ngày giờ nhận mẫu: Ngày giờinkếtquả 22-08-2018 10:10:37
Yêu cầu xét nghiệm Kết quả xét nghiệm Trị số thamchiếun Đơn vị Máy XN Mã QTXN
Miễn Dịch
HBsAg 0.20 Nonreactive Nonreactive < 1 S/CO 12000_1 ANTI-HBs 8.44 Nonreactive Nonreactive < 10 mIU/ml C18200 ANTI-HCV 0.05 Nonreactive Nonreactive < 1.0; s/CO Ci8200
GZ: 1.0-1.5
Trang 10a Inoculation b E ; payee ¬ “ Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis ñ Air sac D Allantoic sac B Amniotic sac B Yolk sac G Albumin — Shell — Shell membrane línarf'' mÌce Ì Viremia Systemic spread F3
d Allantoic fluid harvest ñ
Remove shell Pull back allantoic membrane Hawvest allantoic fluid
Trang 12Các phương pháp xét nghiệm vi sinh truyền thống tôn tại các khuyết điểm gì?
: Đa số virus khó mọc hoặc không mọc trên môi trường nhân tạo;
= Nguy cơ cao khi nuôi cấy với những chủng virus độc lực mạnh; = A hình thái học đòi hỏi nhiều kinh nghiệm của KTV;
» A huyết thanh học có thể không phát hiện được kháng nguyên do hàm lượng
quá thấp; không phát hiện được kháng thể trong giai đoạn nhiễm sớm hoặc
do tình trạng suy giảm miễn dịch của người bệnh;
» Việc tạo kháng thể hoặc kháng nguyên đặc hiệu cho A tốn nhiều công sức,
3/14/21
Trang 13Các ứng dụng KT SHPT trong bệnh do virus
» Chẩn đoán xác định virus gây bệnh
= Sang loc nhanh để đối phó dịch (cúm A/H5N1, SARS, Ebola )
„ Tiên lượng, quyết định điêu trị và theo dõi điều trị thông qua định lượng và
định kiểu gen (HCV, HBV, HPV )
= Sang loc mau (HBV, HCV, HIV bang KT NAT)
Trang 14Các ứng dụng KT SHPT trong bệnh do VK và KST
= Định danh VK, KST gây bệnh (nhận diện S aureus khang methicillin (MRSA), nam gay viêm mang nao, KST sét rét P falciparum, dinh type H pylori cé nguy co sinh UT .) „Phát hiện nhanh nhóm VK khó hoặc không thể nudi cay (M tuberculosis,
N.gonorrhoea, C.trachomatis, M.pneumonia )
= Xac dinh tinh khang thuốc của VK (phát hiện gen mecA của chủng MRSA, giải trình tự
cac gen rpoB, hsp65, gyrA, inhA giúp phát hiện M.tuberculosis khang va da khang
thuốc .)
»„ Xác định sự tái phát, tái nhiễm
= Xac dinh nguy co vi khi sinh hoc (do Bacillus anthracis, Yersinia petis, .)
- Nghiên cứu dịch tễ học phân tử
Trang 15đồ) CÁC KT SHPT THƯỜNG ĐƯỢC ~ SU’ DUNG TRONG BENH NHIEN
Trang 16»„ KT không khuếch đại: PP lai sử dụng các đoạn dò có đánh dấu đặc
hiệu, ví dụ KT lai phát hiện genotype HCV bằng que inoLipa);
= KT khuéch dai: PCR, realtime PCR, sequencing, bDNA, LCR, RFLP .)
Trang 17KT realtime PCR thường được ưu chuộng hơn
» Nhanh, dễ phân tích kết quả; = Khong can phan tich sau PCR;
= Dinh luong dug@c trong mét pham vi Ién (khác với KT PCR là phát hiện điểm cuối); » Độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn PCR cổ điển
Trang 18BIOMEDICAL SERVICE UNIT [ID | DVND29436/0608 | Ho và tên Ngày thực hiện Người thực biện
Loại xết nghiêm HBV-DNA PCR
May sit dung PCR ICYCLER (Biorad)
Phương pháp thực hiện PCR
® khuộch đại đoạn DNA 259bp: đặc hiệu HBV
Trang 19DỊCH YU XÉT NGHIÊM Y SINH
ID | DVDH29372/0608 —|
Hạ tả Tên 32
Nady chute bién
Noni thite bién -
Loại xét ngiiệm HBV-DNA DINH LUONG PCR Máy :ử dụng RealumePCR ]Q 5(Biorad)
Thương pháp tht hiên Multi color real-time PCR diing tagman probe
Probe gin huỳnh quang Fam phát hiện HRV DNA, prohe gắn huỳnh quang Texat Red nhát hiện chúng nôi tai dude trich biết cùng vấi mẫu © inh lượng nhờ 3 nếng độ chuẩn (51: 10.000 eopie:, S21 1000 copies,
53) 100 copies) duge phat hign real-time cing vối mẫu
af "
KET QUA
Nông độ phát hiện viruz trên bệnh nhắn (topies /mÌ huyết thanh) Dui nguvGag phat hiện
Nông độ phát hiên viruz ngưỡng (eopies (m1 huyết thanh) 500 Copies
Giá trị này có thể qui đổi :ang bDNA bảng cách : số eopiez/ mỉ huyết thanh nhân thêm cho 10
Ty, HCM Ngay 26 thang 06 năm 2006 Trudng phang xét nghiệm 29372 Sttrectet Cane re ary PTR flew Lire PCR Amp/Cycle Chart Beyiwaten Det Date 2-4 0 HY IO A SPST PIS ord one | ® Stsndard & Unknown | 324 e- + pa = : — = 2 27 —= = 3 => = Z 23- —— = - —— _ -a 25 3 3.5 4 45
Log Starting Quantity, copy number
-@- FAM E~1L00.0% RA2=1,.000 slope-3.322 y-int=338 PCR Standard Curve : Data 2006-06-24 2004 HBV
BIOMEDICALSERVICE 25062008.opd
Standard Curve Data Standard Curve Chart
Ho Chi Minh City, 26 Jun 2008
Trang 20ID |DVTA 291000608 |
Ho va Tên
Ngày thực biện
Người thực kiện có
Loai xét aghiém HBV GENOTYPE TIM DOT BIEN KHANG
THUỐC LAMI-ADEF (kỹ thuật giải trình tự)
Máy zử dụag giải trình tý CEQ 8000 ( BECKMAN COULTER.)
KET QUA KET QuA GENOTYPE
CACNHOM DOT BIEN EHANG
LAMIVUDINE DUGC KHAO SAT KẾT QUẢ GHI NHÂN ĐƯỢC
L80VI KHONG TIM THAY
I169T a: ’
V173L KHƠNG TÌM TUẾY
L180M LI80M(H7)
A181T KHONG TIM THAY
T1845 KHONG TIM THAY
M2041/V/S V207M/1
Q215S KHONG TIM THAY
CAC NHOM DOT BIEN EHANG
V384M KHONG TIM THAY
S854 KHONG TIM THAY
L80V/ KHONG TIM THAY
A181V/T KHONG TIM THAY
V2HA KHÔNG TIM THAY
Q2155 KHONG TIM THAY
N236T KHONG TIM THAY GHI CHU: Heterozygote Detection: eé nghia lA phát hiện trên chủng HBV của Bệnh Nhân có một :ế tile viru: bị đột biến BIOMEDICAL SERVICE UNIT
Các thông tin liền quan đến kết quả giải trình tự thực hiện trên đoạn gen đặc hiệu khuếch đại từ virus viềm gan B của bệnh nhân 29100 HBV M204V(HZ) L180M(HZ) GCCCCCAATACCACATCATCCACATAACTGAAAGCCAASACAGTGGGGGAA AGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCACTAGTAAACTGAGCCATGAGAA "1ˆ se ee SES Se Eds aot TEs I Sat Pah, ny iit ee eta ae wk ES
KETLUAN BỆNH NHẪN DƯƠNG TINH VOI HEPATITIS B VIRUS ( HBV)
NHAN THAY CO DOT BIEN KHANG THUOC LAMIVUDINE TREN CHUNG HBY CUA BENH NHAN Tp, HCM Ngty 24 thang 06 ném 2007
Trang 21BIOMEDICAL SERVICE UNIT Các thông tin liên quan đến kết quả giải trình tự thực hiên trên đoạn gen đặc hiệu khuếch đại từ virus viêm gan B của bệnh nhân
LD [DĐDSEĐMB 29038 HBV PRECORE Al762T Gi764Á GI1396A AAGCCACCCAAGGCACAGCTIGGAGGCTTGAACAGTAGGACATGAACAT Hạ và Tên 50 GAGATGATTAGGCAGAGGTGAAAAAGTIGCATGGTGCTGGTGAACAGAC Ngày thực hiện CAATTTATGCCTACAGCCTCCTAGTACAAAGATCATTAACCTAATCTCCTC Sa COCCAACTCCTCCCACTCAGTAAACACACAGTCTTTGAAGTA Ngữ: thực biện - - wT
Loai xét nghiém HBV TIM DOT BIEN KHANG PROMOTER -
PRECORE(ky thuật giải trình tự)
Máy zử dụag giải trình tự CEQ §000 ( BECKMAN COLULTER.)
\ eve SEEAE CC CC CC 4 hư ụ rEH ấu hte bee)
KET oud GENOTYPE GENOTYPE B i
CAC DIEM DOT BIEN PROMOTOR-PRECORE ne DUOC KHAO SAT KẾT QUẢ GHI NHÂN ĐƯỢC
G1896A(Codon 632) G1896A 4
(G vi tri 1896, Guanine bi thay thé bing Adenine) |»
A1762T(Codon 588)
A1762T Bl La LA
( vi trí 1762,A denine bị thay thế bằng Thymine) |“ 060 yi Beep 0
GI764A(Codon 588) GI761A a eB Ss Be aie Be
(G vi tr’ 1764, Guanine bi thay thé bing Adenine) |
KẾT LUẬN BENH NHAN DUONG TINH VOI HEPATITIS B VIRUS ( HBV) TYPE B
CO DOT BIEN PRECORE TREN CHUNG HBV CUA BENH NHAN CO DOT BIEN PROMOTOR TREN CHUNG HBV CUA BENH NHAN
Tp, HCM Ngày 23 tháng 06 năm 2008
Trang 22ut see & © ee : ig ri a) I >» Mee ee « NI f ` 1H ; iat oe GENOTYPE HCV BANG INOLIPA
- Phan biét cac type va subtype
HCV dua vao trinh tu nu Trén
vung 5'UTR va vung Idi
- CDNA cua HCV duoc lai voi cac probe dac hiéu cho cac type
va subtypes duoc gan trén que
thử
- Độ đặc hiệu 96.7% và độ nhạy là 4800 Ul/ml
Trang 24đồ MỘT SỐ LƯU Ý KHI ÁP DỤNG CHAN
Trang 25„ Có thể được thực hiện từ mẫu bệnh phẩm không cần được bảo quản để giữ
cho VSV sống sót
„ Có độ nhạy kỹ thuật tương đối tốt hơn đa phần các pp truyền thống
»„ Thời gian trả KQ ngắn hơn pp cấy truyền thống, » Có thể xác định nhiều tác nhân cùng lúc
Trang 26= Đối với các tác nhân gây bệnh có vật chất di truyền là RNA, cân đặc biệt chú ý đảm bảo chất lượng giai đoạn tách chiết và tỉnh sạch vật chất di truyền vì bản chất RNA nhạy cảm, dễ bị hủy, gây âm tính giả
= Doi với VK, không nên dùng SHPT để định lượng vì không phân biệt được VK sống
hoặc chết Nồng độ được lựa chọn để phân định thể nhiễm bệnh (infected) và thể mang VK (carrirer) cũng ít có ý nghĩa vì quyết định cuối cùng phụ thuộc vào cân nhắc của cán bộ lâm sàng;
Trang 27= Đối với các tác nhân gây bệnh có tốc độ biến đổi di truyền (đột biến) cao, cần hết sức
lưu ý trong thiết kế cặp mồi vì dễ gây bỏ sót các chủng mới biến đổi (cúm, HIV .)
A/Taiwan/421/2006 (H1N1) GCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAATGGGGATCCAA 60
A/Tatwan/482/2005 4 <HSN2) sercidvaceknidi tà Ea dan Sidg Bố gà 400w VW CÀI 0ô guddtnEsSHQTGH mm mi
A/Honekone/156/1997 (HỔN]) co co cuc eo bà Gà co CÀ G3 VÀ Gà bí Gá(GG( IVQA(GẴN gà te sasews AosGs xi
Ay Gangdes ey504/2008 (UNINS) c <xxieactn-<a i Sawn bs Oh) eaeoanen-en om Reema UN oe
A/HongKong/2108/2008(R9N2) Guess es 0á bá LUG( GOIẤT Gà Đại 0620688 Ags a ea
A/Taiwan/421/2006 (H1N1) ATAATATGGACAGAGCAGTTAAACTGTATCGAAAGCTTAAGAGGGAGATAACATTCCATG 120
A/TaiwanjA82/2005 ‘CHGN2) wicuawweRlea cowawcwwws oe oo cenehexenes 08 eewuwenewan 0 Hx
A/HongKong/156/1997 (H5N1).C ¿ ÂyCGẨ 0e du Risk res NO án Bồ tá
A/Canada/rv504/2004 (H7N3).C Co bà g2 wa wa Cua du LẦU dà nu (II ẪN Ga giên Bà canea
A/HongKong/2108/2008(HON2).C A C.ÁAG Games ca sec Gv da SG gà:
3/14/21
Trang 28» Đối với việc xác định VK trong các mẫu bệnh phẩm đặc biệt (có nồng dd VK
thấp) như mẫu phết, mẫu dịch đôi khi cần một số biện pháp giúp tăng sinh để tăng độ nhạy của KT, tránh âm tính giả do quá ít tác nhân gây bệnh trong bệnh phẩm ban đầu;
» Đối với việc xác định KST trong phân bằng KT dựa trên nền tảng PCR vẫn có
khả năng âm tính giả do dùng lượng phân nhỏ và bị pha loãng > cân những
kỹ thuật tăng sinh trước đó;
Trang 29: Đối với A xác định KST, việc sử dụng các cặp môi có độ đặc hiệu khác nhau (cho
giống, cho loài) có thể gây ra tỷ lệ dương tính khác nhau
Trang 30Đo tải lượng (virus load) là gì?
» Định lượng/nồng độ virus trong một đơn vị thể tích huyết tương (HBV, HCV, HIV .)
= Don vi la copies/mL hoac IU/mL
= DO nhay KT (LOD) va dải đo tùy thuộc bộ kit > khác biệt về chi phi
Trang 31Assay Manufacturer Techrique Lower limut Dynanuc of detection r of (quahtative quan ication assay) quantitative assay) : Roche Manual RT- 5SOIU/ml NA HCV w2.0 Molecular PCR Systems
Cobas® Roche Semi- 50 IU/ml NA amphcor™ Molecular automated
HCV w2.0 Systems RT-PCR
Versant® Ba Manual 10IU/ml NA HCV RNA Heal TMA Qualitative Assay “mplicor Roche Manual RT- 6001U/nủ 000-500,000 Molecular PCR IU/ml Moritor® v2.0 Systems
Cobas® Roche Semi- 6001UL/mủ 6OG-500 Q00 licor Xiolecular automated IU/ml CW Monitor Systems RI-PCR
LCx HCV Abbott Serrii- 251IU/ni 25-26230000 RNA Diagnostic automated IU/ml Quantitative RTI-PCR
Assay
Versant® Ba Semi- 6151U/nủ 0615-7,700,000 HCV RNA3.0 Heal automated IU/ml
Assay bDNA
Cobas® Roche Semi- i5IU/ml 43-69000000 TagManHCVY Molecular automated IU/ml
Test Systems real-time
PCR _
Trang 32IU/ml va copies/ml
Sử dụng đơn vị đo nào trong thực tiễn lâm sàng?
° Ý nghĩa thực sự của một copy (bản sao):
Một copy (bản sao) thực chất chỉ là một đoạn trình trự gen ngắn
và không thực sự đại diện cho toàn bộ bộ gen của virus
- - Tín hiệu thu được có thể thu được từ:
*_Virus không hoạt động
* Bộ gen không hoàn chỉnh của virus
- _ Tín hiệu có thê không tương đương với số lượng virus, đặc biệt với những đoạn trình tự lặp lại trong bộ gen virus
- - Tín hiệu có thê không đại diện có số lượng virus đang hoạt động
NI 9200000 cobas Life needs answers
Trang 33IU/ml <—s— copies/ml
copies/ml = [U/ml x hê số chuyển đôi: có tính chất tham khảo
Đơn vị IU/ml — Đòi hỏi từ việc cần thiết phải tiêu chuẩn hóa xét nghiệm đo tải lượng virus
- _ Chuẩn hóa theo nồng độ chuẩn của WHO
- _ Được khuyến nghị sử trong các bản đồng thuận quốc tế về chân
đoán, điêu trị, quản lý bệnh nhân viêm gân
Assay Conversion Factor Amplicor HCV Monitor v2.0 ;«««s««ss«esss«sssessssss ` (manual procedure} .s.1 lU/mL = 0.9 copies/mL +
Cobas Amplicor HCV Monitor v2.0? :
(semi-automated procedure) 2 1 IU/mL = 2.7 copies/mL :
Versant HCV RNA 3.0 : :
Quantitative Àssay „ 1 lU/mL = 5.2 copies/mL +
Cx HCV RNA :
Quantitative Âssay s 1 lU/mL = 3.8 copies/mL :
SuperQuait 4.1 lU/mL = 3.4 copies/mL ?
Assay Conversion Factor
(RE RSBERERRSERSRSRSRSRER SRR ERE SE ES | `
Digene HC - | & lI ‡ Không chuẳnhóa —
Versant HBV DNA 3.0 : † U/mL =5.2 copies/mL ‡ Amplicor HBV Monitor : † lU/mL = 5.6 copies/mL
Cobas TaqMan HBV : 1 IU/mL = 5.82 copiesimL:
cobas
Life needs answers
Trang 34BỘ Y TẾ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM —— Độc lập - Tự do - Hạnh phúc Số: 1868/QĐ-BYT Hà Nội, ngày 24 tháng 4 năm 2020 QUYÉT ĐỊNH Về việc ban hành Hướng dẫn xét nghiệm vi rút viêm gan B, C BỘ TRƯỞNG BỘ Y TẾ DY iy ` Cơ quan phát hành: Bộ Y tế
BO Y TE CONG HOA XA HOI CHU NGHIA VIET NAM
¬— nn Doc lap - Tu do - Hanh phic
HUONG DAN XET NGHIEM VI RUT VIEM GAN B, C
(Ban hành theo quyêt định /QĐ-BITngày tháng năm 2020 của Bộ trưởng Bộ Ÿ tê)
Trang 36» Đặc điểm di truyền của các tác nhân gây bệnh thay đổi theo vùng miền, đối tượng
ký chủ và sự đột biến tự nhiên
A/Taiwan/421/2006 (HIN1)GCGAGGACTGCAGCGTAGACGCTTTGTCCAAAATGCCCTTAATGGGAATGGGGATCCAA 60
A/Tatwan/a8272005 (HSNZ) ca ssieececenen dã luacEantSidk lí Bì 04800008 CÀI đơ gikGNSG0NW me ms
A/HgKong/156/1897 (HồN]) ¿(c6 gõ Go co CÀ Gà @ bá Gá( Q00 ẤN bá bá Ga Aui€s xa:
Ay Gatiadsy rys04/2002 (CHING) cugsaaven cn oo Eadesiwzdoedls Ws G) dee amen om Raed ewes VW dầa
A/HongKong/2108/2003(H9N2) - Ẩhtt3 tá g6 06i0ảngivdi Ẩ¡ 0% j6 6w AG tá đùa
A/Taiwan/421/2006 (HIN1)ATAATATGGACAGAGCAGTTAAACTGTATCGAAAGCTTAAGAGGGAGATAACATTCCATG 120
A/Taiwan/482/2005 ‘(CHBN2) svceoesrveveoeaOẨ ba ceeaneedgdoea ve cá canea ÂN (ĐH 0à 0á 0106:6580803234 g4 ÿ0kci0ð1g
A/HongKong/156/1997 (H5NI).C ¿ Ai CAG iiva.an gi dứa Avd@usaia Gố cá bi
A/Canada/rv504/2004 (H7N3).C uy Êbàccvia ws was án cá cuÂu VÃ UY Ghi ga nã danga
A/HongKong/2108/2003(H9N2).C A C.AG Gass ga s2 z< cu vu la Song
3/14/21
Trang 37„ Sự hạn chế của các nguồn mẫu phù hợp để thực hiện XN, bao gồm loại mẫu,
thời điểm lấy mẫu và chất lượng của mẫu
Đối với bệnh truyên nhiễm, vi sinh vật có đời sống riêng và đôi khi liên quan đến nhiều cơ quan Thời điểm và loại mẫu khi lấy, do vậy, cần lưu ý đặc điểm này Không nhất thiết kết quả âm là không có gì hay kỹ thuật sai, mà vì không lấy đúng mẫu Human ingestion ry Diagnosis of larval ascariasis Clinical examination Image-based diagnosis A B Serological detection Unfertilised egg (A) Fertilised egg (B) Diagnosis of adult intestinal worms
ASO) Clinical examination
Trang 38NHIEU YEU TO ANH HU'ONG DEN KET QUA XET NGHIEM,
Trang 39= Van đề Kiểm tra chất lượng và Đảm bảo chất lượng XN SHPT ⁄ Các yếu tố của mẫu bệnh phẩm ảnh hưởng đến KQ XN SHPT
⁄ Vai trò của các mẫu chứng (control)
Trang 40HỒ) VAI TRÒ CỦA XÉT NGHIỆM