ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 7(104).2016 81 ĐÁNH GIÁ SỰ HÌNH THÀNH BIOFILM VÀ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CHLOROANILINES BỞI BIOFILM CỦA VI KHUẨN ACINETOBACTER BAUMANNII GFJ1 ASSESSMENT OF THE FORMATION OF BIOFILM AND CHLOROANILINE BIODEGRADATION BY BIOFILM OF ACINETOBECTER BAUMANNII GFJ1 Hà Danh Đức Trường Đại học Đồng Tháp; hadanhduc@gmail.com Tóm tắt - Acinetobecter baumannii GFJ1-là vi khuẩn phân giải chloroaniline khảo sát khả hình thành màng sinh học (biofilm) sử dụng biofilm để phân hủy chloroaniline Vi khuẩn hình thành màng sinh học (biofilm) đĩa polystyrene 96 giếng, mơi trường có bổ sung nguồn nitơ có mức độ cao mơi trường không bổ sung chất dinh dưỡng bổ sung nguồn bon Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chloroaniline đến hình thành biofilm thấy nồng độ cao (từ 0,3 mM trở lên), hình thành biofilm chậm Sự phân hủy 3-chloroaniline biofilm (≤ 58,5 ± 3,7%) thấp so với 4- chloroaniline (≥ 44,5 ± 5,5%) 3,4- chloroaniline (≥ 56,6 ± 8,8%) với nồng độ ban đầu 0,1 mM Tốc độ phân hủy phụ thuộc vào chất dinh dưỡng bổ sung vào môi trường Môi trường không bổ sung chất dinh dưỡng bổ sung nguồn bon có tốc độ phân hủy cao mơi trường bổ sung nguồn nitơ Tốc độ phân hủy chloroaniline phụ thuộc vào lượng vi khuẩn ban đầu biofilm Abstract - In this study, Acinetobacter baumannii strain GFJ1 is investigated for its biofilm formation and biodegradation ability toward several chloroanilines The determination of biofilm formation on 96well polystyrene microplates shows that A baumannii GFJ1 forms biofilm at higher levels in mineral medium supplemented with nitrogen sources compared with the medium without co-substrate or mineral medium supplemented with carbon sources The investigation of chloroaniline concentrations on biofilm formation indicates that the biofilm formation is at slower rates in medium with high chloroaniline concentrations (≥ 0.3 mM) The degradation rate of 3-chloroaniline of biofilm (≤ 58.5 ± 3.7%) is lower than that of 4- chloroaniline (≥ 44.5 ± 5.5%) and 3,4- chloroaniline (≥ 56.6 ± 8.8%) at the initial concentration of 0.1 mM These degradation rates are affected by co-substrates added into medium Medium without co-substrate or supplemented with carbon sources results in higher degradation rates of chloroanilines of biofilm In addition, the biodegradation rates of biofilm belong to cell numbers in biofilm at the beginning Từ khóa - Acinetobecter baumannii GFJ1; biofilm; chloroaniline; bon; nitơ; phân hủy Key words - Acinetobecter baumannii GFJ1; biofilm; chloroaniline; carbon; nitrogen; biodegradation Đặt vấn đề Chloroaniline chất độc hại, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người sinh vật khác Chúng gây bệnh liên quan đến tuần hoàn, thần kinh, nội tiết ung thư Chloroaniline phát rộng rãi nguồn nước nước thải công nghiệp thải trực tiếp môi trường, hay nước khu ruộng sau sử dụng loại thuốc diệt cỏ có thành phần chứa propanil hay diuron chúng thường biến đổi thành sản phẩm trung gian, 4-chloroaniline 3,4-dichloroaniline [1,2] Ngồi ra, chloroaniline cịn phát đất [3] hay lớp bùn lầy trầm tích [4] Trong nước thải cơng nghiệp, nồng độ chloroaniline cao [5] Để xử lý chất độc nước thải biện pháp sinh học với quy mơ cơng nghiệp, cần phải có lượng vi khuẩn đủ nhiều môi trường để vi khuẩn hoạt động điều kiện tối ưu Sử dụng biofilm để phân hủy chất thải biện pháp ứng dụng rộng rãi giới Biofilm dùng xử lý sinh học cho hiệu cao, với mật độ vi sinh vật dày đặc hoạt động lâu dài [6] Sự phân hủy chloroaniline màng sinh học nghiên cứu giới [5, 7, 8, 9], chưa nghiên cứu nhiều nước ta Trong báo này, việc khảo sát ảnh hưởng chất dinh dưỡng, nồng độ chất hóa học đến hình thành màng sinh học phân hủy chloroaniline sinh học tiến hành Có nhiều loại chloroaniline, 3chloroaniline, 4-chloroaniline 3,4-dichloroaniline thường phát môi trường sử dụng thí nghiệm Phương tiện phương pháp nghiên cứu 2.1 Vi khuẩn phân hủy chloroaniline Chủng vi khuẩn phân giải chloroaniline – Acinetobecter baumannii GFJ1 phân lập phịng thí nghiệm trường Đại học Chulalongkorn (Thái Lan) A baumannii GFJ1 vi khuẩn có hình que ngắn có khả sử dụng nhiều loại chloroaniline nguồn thức ăn chúng 2.2 Môi trường nuôi vi khuẩn Vi khuẩn nuôi cấy dung dịch khống chất có thành phần sau: 1.419,6mg/l Na2HPO4, 1.360,9mg/l KH2PO4, 98,5mg/l MgSO4, 5,88mg/l CaCl2 2H2O, 1,16mg/l H3BO4, 2,78mg/l FeSO4.7H2O, 1,15mg/l ZnSO4.7H2O, 1,69mg/l MnSO4.H2O, 0,38 mg/l CuSO4.5H2O, 0,24 mg/l CoCl2.6H2O 0,10 mg/l MoO3 [10] Môi trường bổ sung thành phần dinh dưỡng đặt tên sau: 0,01% chất chiết nấm men (yeast extract) (MY001); 0,1% chất chiết nấm men (MY01); 0,01% chất chiết nấm men 0,1% succinate (MYS); 0,01% chất chiết nấm men 0,1 % citrate (MYC); 0,01% chất chiết nấm men 0,1% NaNO3 (MYNa); 0,01% chất chiết nấm men 0,1% (NH4)2SO4 (MYA); 0,01% chất chiết nấm men 0,1% NH4Cl (MYAC); 0,01% chất chiết nấm men, 0,1% succinate 0,1% (NH4)2SO4 (MYSA) pH điều chỉnh khoảng 7,0 ± 0,1 Môi trường khử trùng nhiệt độ 121oC thời gian 15 phút, để nguội đến nhiệt độ phịng trước ni cấy vi khuẩn Hà Danh Đức 82 2.3 Đánh giá khả hình thành màng sinh học điều kiện dinh dưỡng khác Tất thí nghiệm thực phịng thí nghiệm Sinh hóa, trường Đại học Chulalongkorn (Thái Lan) tiến hành lần lặp lại Phân tích hình thành màng sinh học vi khuẩn A baumannii GFJ1 thực theo phương pháp O’Toole and Kolte [11] Vi khuẩn ni cấy đĩa giếng polystyrene có 96 giếng (96-well microplate) để hình thành màng sinh học thành giếng Việc khảo sát ảnh hưởng điều kiện dinh dưỡng đến hình thành màng sinh học thực mơi trường khống khơng có bổ sung chất chất dinh dưỡng nguồn bổ sung bon nitơ Mỗi giếng bổ sung 150 µl mơi trường Vi khuẩn ni mơi trường Luria-Bertani (môi trường LB) 12 giờ, chủng vào giếng (1% so với thể tích giếng) Đĩa đậy lại nắp vô trùng ủ với tốc độ lắc 100 vòng/phút nhiệt độ phịng Sau 24 giờ, mơi trường loại ngồi, đĩa rửa nhẹ (khơng để biofilm tách khỏi thành giếng), làm khô cách lật ngược đĩa Biofilm hình thành thành giếng nhuộm 300 µl dung dịch thuốc tím (1%) 10 phút Sau thuốc tím loại ngồi, rửa lại nước làm khơ Biofilm hịa tan dung dịch gồm ethanol acetone (80%: 20%) Biofilm hình thành thành giếng cạo que tăm để hòa lẫn với dung dịch Dung dịch sau chuyển vào eppendorf, bổ sung thêm nước chưng cất đến 1,0 ml Biofilm xác định phương pháp đo độ đục tán xạ ánh sáng quang phổ kế (spectrophotometer) bước sóng 600 nm 2.4 Ảnh hưởng nồng độ hóa học đến hình thành biofilm Thí nghiệm tiến hành tương tự trên, chlorianiline bổ sung vào môi trường từ đến 1,0 mM Đây nồng độ chloroaniline nằm giới hạn phát môi trường 2.5 Sự phân hủy chloroaniline biofilm Sự phân hủy chloroaniline vi khuẩn thực đĩa giếng với nồng độ 0,1 mM Sau 24 ủ để có biofilm, mơi trường loại ngoài, rửa nhẹ nước chưng cất khử trùng mơi trường có thành phần dinh dưỡng bổ sung thêm vào Sau giờ, lượng môi trường định lấy để xác định chloroaniline phân hủy Đối với thí nghiệm xác định phân hủy chloroaniline biofilm qua chu kì, phần mẫu lấy sau để xác định chloroaniline phân hủy Đĩa tiếp tục ủ để 24 giờ, sau mơi trường loại ngồi, rửa nhẹ nước chưng cất khử trùng tiếp tục chu kì Trong thí nghiệm này, lượng vi khuẩn hình thành biofilm xác định CFU/giếng Một số giếng đĩa bổ sung 300 µl nước chưng cất khử trùng, biofilm thành đáy giếng cạo miếng tăm tre khử trùng Số lượng vi khuẩn từ biofilm tách dung dịch giếng xác định sau pha loãng trải đĩa thạch chứa mơi trường LB đếm số khuẩn lạc hình thành sau 12 ủ nhiệt độ 30oC 2.6 Phương pháp phân tích Nồng độ chloroaniline dung dịch xác định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC High Performance Liquid Chromatography), với cột μm, 250 mm×4,6 mm; Hyperclone, Phenomenex, USA đầu dị quang phổ tử ngoại 240 nm Pha động hỗn hợp acetonitrile (70%) nước tinh khiết (30%) Kết bình luận 3.1 Ảnh chất dinh dưỡng đến hình thành biofilm Phân tích hình thành màng sinh học vi khuẩn A baumannii GFJ1 đĩa giếng thấy A baumannii GFJ1 hình thành màng sinh học với mức độ khác nhau, tùy thuộc vào chất dinh dưỡng bổ sung vào môi trường ni vi khuẩn Vi khuẩn hình thành biofilm thấp không bổ sung chất dinh dưỡng (môi trường MM), cao bổ sung (NH4)2SO4 (mơi trường MYA, Hình 1) Ngoại trừ mơi trường MM, mơi trường cịn lại bổ sung 0,01% chất chiết nấm men để kích thích sinh trưởng vi khuẩn Môi trường bổ sung nguồn nitơ dường dẫn đến hình thành biofilm cao môi trường bổ sung nguồn bon Môi trường bổ sung nguồn nitơ ((NH4)2SO4) bon (succinate) làm giảm hình thành biofilm so với mơi trường có (NH4)2SO4 (Hình 1) Như vậy, khơng phải nhiều chất dinh dưỡng hình thành biofilm cao Trong thí nghiệm này, vi khuẩn P putida KT2440 vi khuẩn có khả hình thành biofilm chọn làm đối chứng dương, mơi trường khơng có vi khuẩn đối chứng âm Các nghiên cứu khác thấy rằng, hình thành biofilm chịu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng [12, 13, 14] Biofilm (OD600) 01 01 01 01 00 00 00 MM MY001 P putida KT2440 MY01 MYS MYC MYNa MYA Môi trường nuôi vi khuẩn Môi trường không chủng vi khuẩn MYAC MYSA Mơi trường chủng vi khuẩn Hình Ảnh hưởng chất dinh dưỡng đến mức độ hình thành biofilm đĩa polystyrene 96 giếng 3.2 Ảnh chất dinh dưỡng đến phân hủy chloroaniline biofilm Đĩa sau hình thành biofilm sau 24 sử dụng để đánh giá ảnh chất dinh dưỡng đến phân hủy chloroaniline Kết thấy rằng, sau ủ, phân hủy 4-chloroaniline 3,4-dichloroaniline chênh lệch khơng ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 7(104).2016 đáng kể cao 3-chloroaniline (Bảng 1) Điều chứng tỏ vị trí chlorine phân tử định tốc độ phân hủy vi khuẩn Trong môi trường MM, MY001, MYS MYC, tốc độ phân hủy gần tương đương cao môi trường MY01, MYA, MYC MYAC Đây kết gây ngạc nhiên biofilm hình thành vi khuẩn ni cấy mơi trường MY01, MYA, MYC MYAC cao môi trường khác, tức có số lượng vi khuẩn nhiều Việc bổ sung chất chiết nấm men với nồng độ 0,1% dẫn đến hình thành biofilm cao lại phân hủy thấp nồng độ 0,01% Điều 83 giải thích rằng, nồng độ chất chiết nấm men cao, vi khuẩn sử dụng chất dinh dưỡng chất chiết nấm men cao để sinh trưởng thay sử dụng chloroaniline Cùng lượng (NH4)2SO4 NH4Cl, hình thành biofilm cao hơn, phân hủy chloroaniline lại thấp trường có NaNO3 Kết giải thích vi khuẩn A baumannii GFJ1 có khuynh hướng sử dụng nitơ từ (NH4)2SO4 NH4Cl cao từ NaNO3 chloroaniline Qua thí nghiệm cho thấy chất dinh dưỡng đóng vai trị quan trọng việc hình thành biofilm phân hủy chất hóa học Bảng Sự phân hủy chloroaniline mơi trường có nguồn dinh dưỡng khác biofilm sau ủ Chloroaniline MM 33,6 ± 3,7 84,4 ± 9,4 88,6 ± 8,5 3-chloroaniline 4-chloroaniline 3,4-dichloroaniline 3-chloroaniline 01 Biofilm (OD600) Sự phân hủy chloroaniline (%) môi trường khác MY001 MY01 MYS MYC MYA MYAC 57,6 ± 3,1 28,2 ± 2,2 58,5 ± 3,7 53,6 ± 1,1 15,5 ± 2,9 21,1 ± 1,8 93,3 ± 3,5 76,6 ± 11,1 94,4 ± 4,4 89,9 ± 7,7 44,5 ± 5,5 64,4 ± 6,6 96,6 ± 4,6 82,2 ± 5,4 94,4 ± 5,4 92,8 ± 3,3 56,6 ± 8,8 71,8 ± 8,8 01 00 00 00 0,05 0,1 0,3 0,6 Nồng độ 3-chloroaniline (mM) 12 48 72 4-chloroaniline 01 Biofilm (OD600) 24 01 00 00 00 0 12 01 Biofilm (OD600) 0,05 0,1 0,3 0,6 Nồng độ 4-chloroaniline (mM) 24 48 72 3,4-dichloroaniline 01 00 00 00 0,05 0,1 0,3 0,6 Nồng độ 3,4-dichloroaniline (mM) 12 24 48 72 Hình Ảnh hưởng nồng độ chloroaniline thời gian đến hình thành biofilm đĩa giếng 3.3 Ảnh hưởng nồng độ chloroaniline đến phát triển biofilm Khả hình thành màng sinh học chịu ảnh hưởng điều kiện môi trường, có nồng độ chất hóa học Trong thí nghiệm này, mơi trường MYNa lựa chọn MYSA 19,4 ± 2,4 65,5 ± 7,3 84,4 ± 4,6 bổ sung chloroaniline nồng độ khác Vi khuẩn ni cấy mơi trường MYNa có hình thành biofilm mức trung bình, có phân hủy chloroaniline mức cao (được mô tả thí nghiệm sau) Ở nồng độ chloroaniline khác nhau, khác mức độ hình thành biofilm khơng đáng kể, ngoại trừ 3,4-dichloroaniline nồng độ 1,0 mM (Hình 1) Ở nồng độ chloroaniline từ đến 0,1 mM, biofilm hình thành đạt đến mức cao sau 24 không thay đổi đáng kể ngày Ở nồng độ cao hơn, vi khuẩn cần nhiều thời gian để hình thành biofilm đạt đến mức cực đại Sự hình thành biofilm phụ thuộc vào mức độ sinh trưởng vi khuẩn Quan sát thấy rằng, nồng độ chất hóa học cao, vi khuẩn sinh trưởng chậm nên hình thành biofilm diễn chậm 3,4-dichloroaniline độc loại monochloroaniline khác Ở nồng độ 1,0 mM, 3,4-dichloroaniline ức chế phát triển vi khuẩn dẫn đến mức độ hình thành biofilm thấp Biofilm hình thức sống vi khuẩn, chúng bám vào giá thể tụ tập lại với nhau, hình thành màng EPS (Extracellular polymeric substances) để chúng tồn tốt trước điều kiện bất lợi môi trường, chẳng hạn chất độc hóa học Chloroaniline vừa chất độc, vừa nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn Điều đáng lưu ý thí nghiệm khơng có chứng chloroaniline kích thích hình thành biofilm vi khuẩn Chloroaniline nồng độ cao ức chế hình thành biofilm thơng qua ức chế sinh trưởng chúng 3.4 Sự phân hủy chloroaniline biofilm có lượng vi khuẩn ban đầu khác chu kì khác Thí nghiệm thực môi trường MYNa, đĩa polystyrene 96 giếng với nồng chloroaniline ban đầu 0,1 mM Trong thí nghiệm này, việc xác định số lượng vi khuẩn biofilm đếm trực tiếp số CFU/giếng thay nhuộm màu thuốc tím đĩa cịn sử dụng chu kì sau Ngồi việc đếm số lượng tế bào biofilm để xác định hoạt động vi khuẩn xác có vi khuẩn biofilm chết sau chu kì Kết thấy rằng, chu kì thứ 2, số lượng tế bào biofilm gấp đơi chu kì thứ nhất, chu kì thứ gần gấp đơi chu kì thứ Trong lúc chu kì thứ 4, lượng vi khuẩn biofilm không thay đổi đáng kể (Hình 3A) Có lẽ lớp biofilm dày, vi khuẩn biofilm, lớp phía trở nên khó tiếp cận với nguồn dinh dưỡng ôxi nên chúng không tăng thêm Hà Danh Đức 84 Sự phân hủy chloroaniline tăng lên từ chu kì đến chu kì 3, chu kì lại khơng thay đổi đáng kể Ở chu kì thứ nhất, phân hủy 3-chloroaniline, 4chloroaniline 3,4-dichloroaniline không 65,3% sau giờ, chu kì 4, phân hủy chloroaniline đạt tới 92% (Hình 3B) Sự tăng tốc độ sử dụng chất lượng vi khuẩn biofilm tăng lên (Hình 3A) Ở thí nghiệm cho thấy, thành phần mơi trường đóng vai trị quan trọng số lượng vi khuẩn ban đầu biofilm việc phân hủy chloroaniline Nhưng thí nghiệm này, mơi trường chu kì, kết lại khác Tuy nhiên khó xác định phân hủy phần trăm vi khuẩn biofilm phần trăm vi khuẩn từ tách từ biofilm di chuyển vào môi trường lỏng Nhưng qua so sánh trên, ta thấy lượng vi khuẩn biofilm đóng vai trị quan trọng xử lý chất độc hại Số lượng CFU/giếng A 8.000E+04 6.000E+04 4.000E+04 2.000E+04 0.000E+00 Chu kì Mức độ phân hủy (%) 3-chloroaniline Chu kì Chu kì 4-chloroaniline Chu kì 3,4-dichloroaniline B 120 100 80 60 40 20 Chù kì 3-chloroaniline Chù kì Chù kì 4-chloroaniline Chù kì 3,4-dichloroaniline Hình Sự hình thành biofilm đĩa polystyrene 96 giếng (A) phân hủy chloroaniline biofilm (B) Trong thí nghiệm trước hình thành biofilm nồng độ 0,1 mM đạt cực đại sau ngày không thay đổi ngày tiếp sau Tuy nhiên thí nghiệm này, lượng vi khuẩn tăng lên chu kì thứ thứ Sự thay môi trường cạn kiệt dinh dưỡng môi trường giúp vi khuẩn có thêm nguồn dinh dưỡng nguyên nhân làm kích thích sinh trường vi khuẩn, dẫn đến làm tăng hình thành biofilm Trong trình hình thành biofilm, bám vào bề mặt, vi khuẩn tiếp tục phân chia, thu nhận thêm tế bào nhận thêm tế bào từ mơi trường lỏng để hình thành lớp biofilm dày Vi sinh vật cần thiết chất dinh dưỡng cho sinh trưởng, hình thành thêm lớp màng EPS để mở rộng phạm vi biofilm [15] Nghiên cứu có ảnh hưởng quan trọng đến ứng dụng biofilm việc phân hủy chất độc hại Kết luận Sự hình thành biofilm vi khuẩn phân hủy chloroaniline-A baumannii GFJ1 chịu ảnh hưởng chất dinh dưỡng nồng độ chloroaniline mơi trường Vi khuẩn hình thành biofilm cao môi trường bổ sung (NH4)2SO4 NH4Cl, chất lại ức chế phân hủy chloroaniline Ở nồng độ chất hóa học cao (≥ 0,3 mM), hình thành biofilm diễn chậm so với chloroaniline nồng độ thấp Sự thay môi trường cạn kiệt nguồn dinh dưỡng môi trường thành phần dinh dưỡng dẫn đến hình thành thêm biofilm vài chu kì tiếp sau Trên 92% chloroaniline phân hủy biofilm vi khuẩn A baumannii GFJ1 môi trường MYNa chu kì thứ Kết nghiên cứu đóng góp phần quan trọng ứng dụng biofilm để phân hủy chất hóa học độc hại TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] A Dahchour, G Bitton, C.M Coste, J Bastide, “Degradation of the herbicide propanil in distilled water”, Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 36 (1), 1986, 556-562 [2] V.E Herrera-Gonzalez, N Ruiz-Ordaz, J Galindez-Mayer, C Juarez-Ramirez, F Santoyo-Tepole, E.M Montiel, “Biodegradation of the herbicide propanil, and its 3,4-dichloroaniline by-product in a continuously operated biofilm reactor”, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 29 (3), 2013, 467-474 [3] Boehncke, A., Kielhorn, J., Konnecker, G., Pohlenz-Michel, C., and Mangelsdorf, I., “4-Chloroaniline Concise International Chemical Assessment Document 48”, 2003 [4] U.S Environmetal Protection Agency, Region Surperfund, Sauget Area 2, 2011 [5] Livingston, A.G., and Willacy, A., “Degradation of 3,4-dichloroaniline in synthetic and industrially produced wastewaters by mixed cultures freely suspended and immobilized in a packed-bed reactor”, Applied Microbiology and Biotechnology 35, 1991, 551-557 [6] Nasib Qureshi, B.A.A., Thaddeus C Ezeji, Patrick Karcher and Ian S Maddox, “Biofilm reactors for industrial bioconversion processes: employing potential of enhanced reaction rates”, 2005, 1-21 [7] Bathe, S., Schwarzenbeck, N., and Hausner, M (2005) Plasmidmediated bioaugmentation of activated sludge bacteria in a sequencing batch moving bed reactor using pNB2 Letters in Applied Microbiology 41, 242-247 [8] González, A.J., Bautista, L.X.C., Papalia, M., Radice, M., Gutkind, G., Magdaleno, A., Planes, E.I., Rossini, G.D.B., Gallego, A., and Korol, S.E., “Biodegradation of p-Chloroaniline and Ammonium Removal in Continuous Biofilm Reactors”, Clean – Soil, Air, Water 42, 2014, 449-455 [9] Radianingtyas, H., Robinson, G.K., and Bull, A.T., “Bacterial community structure and physiological state in a biofilm reactor degrading 4chloroaniline”, Applied Microbiology and Biotechnology, 62, 2003, 423-429 [10] W Dejonghe, E Berteloot, J Goris, N, Boon, K Crul, S Maertens, M Hofte, P De Vos, W Verstraete, E.M “Top, Synergistic degradation of linuron by a bacterial consortium and isolation of a single linuron-degrading Variovorax”, Applied and Environmental Microbiology, 69 (3), 2003, 1532-1541 [11] O'toole, G.A., and Kolter, R., “Initiation of biofilm formation in Peudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genitic analysis”, Molecular Microbiology 28, 1998, 449-461 [12] Allan, V.J., Callow, M.E., Macaskie, L.E., and Paterson-Beedle, M., “Effect of nutrient limitation on biofilm formation and phosphatase activity of a Citrobacter sp” Microbiology 148, 2002, 277-288 [13] Chen, X., Suwarno, S.R., Chong, T.H., McDougald, D., Kjelleberg, S., Cohen, Y., Fane, A.G., and Rice, S.A., “Dynamics of biofilm formation under different nutrient levels and the effect on biofouling of a reverse osmosis membrane system”, Biofouling 29, 2013, 319-330 [14] Srinandan, C.S., Jada, V., Cecilia, D., and Nerurkar, A.S., “Nutrients determine the spatial architecture of Paracoccus sp Biofilm”, Biofouling 26, 2010, 449–459 [15] Kumar, C.G., and Anand, S.K., “Significance of microbial biofilms in food industry: a review”, International Journal of Food Microbiology 42, 1998, 9-27 (BBT nhận bài: 10/01/2016, phản biện xong: 15/01/2016)