NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG 6 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 Nghiên cứu xác định kiểu gen của vi rút BK ở bệnh nhân ghép thận tại Bệnh viện Quân y 103 Hoàng Xuân Sử 1, Trương Qúy Kiên2, Phạm Quốc Toản[.]
NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Nghiên cứu xác định kiểu gen vi rút BK bệnh nhân ghép thận Bệnh viện Quân y 103 Hoàng Xuân Sử 1, Trương Qúy Kiên2, Phạm Quốc Toản2, Lê Việt Thắng2 Nguyễn Thanh Xuân2, Lê Thị Bảo Quyên3, Lê Đình Nam4, Nguyễn Đắc Thắng1 Hoàng Xuân Cường1, Đinh Thị Thu Hằng1, Hồ Anh Sơn1, Hoàng Văn Lương1 Học viện Quân y Bệnh viện Quân y 103 Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Bệnh viện Quân y 354 TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định phân bố lưu hành kiểu gen vi rút BK bệnh nhân ghép thận Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Tổng số 131 bệnh nhân ghép thận thu thập khoa Thận Lọc máu, Bệnh viện Quân y 103 Mẫu máu, nước tiểu thu thập tách chiết DNA sử dụng cho phản ứng Nested - PCR khuếch đại đoạn gen VP1 BK virus (BKV) Những mẫu BKV dương tính giải trình tự xây dựng chủng loại phát sinh xác định kiểu gen phương pháp Neighbor-joining dựa phần mềm Mega Kết quả: 40 mẫu dương tính với BKV giải trình tự phân tích lồi, phát BKV- I (62,5%) BKV- IV (37,5%) Trong BKV- I, quan sát phân nhóm I/b-1 (62,5%), khơng phát phân nhóm khác Tuy nhiên, BKV- IV cho thấy đa dạng phân nhóm sau: IV/a-1 (26,67%), IV/a-2 (6,67%), IV/c1 (66,66%) Với bệnh nhân bị BKVN (BK Virus Nephropathy), khẳng định sinh thiết thận, 5/8 (62,5%) bệnh nhân thuộc phân nhóm I/bNgày nhận bài: 10/6/2020 Ngày phản biện: 30/7/2020 Ngày chấp nhận đăng: 5/8/2020 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 1, 3/8 (37,5%) thuộc phân nhóm IV/c-1 Khơng có khác biệt kiểu gen BKV liên quan đến tuổi, giới, số xét nghiệm tình trạng BKVN khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Kết luận: Nghiên cứu kiểu gen BKV-I kiểu gen lưu hành phổ biến, BKV-IV bệnh nhân ghép thận Nghiên cứu giúp cung cấp đặc điểm di truyền phân tử BKV góp phần giám sát BKV bệnh nhân ghép thận Từ khóa: Vi rút BK, kiểu gen BKV, ghép thận ĐẶT VẤN ĐỀ Human polyomavirus BK (BKV) thuộc họ Polyomaviridae, đặc trưng gen DNA kép, khép vòng, phân lập lần từ mẫu nước tiểu bệnh nhân sau ghép thận với biến chứng hẹp niệu quản [18] Thuật ngữ “BK” có nguồn gốc từ chữ đầu bệnh nhân phát nhiễm virus nước tiểu vào năm 1971 BKV lây nhiễm lứa tuổi với tỷ lệ huyết dương tính người lớn dao động từ 60% tới 100% NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Sau nhiễm BKV nguyên phát, BKV tồn dạng tiềm ẩn đường tiết niệu sinh dục bắt đầu tái hoạt động nhân lên mạnh mẽ, phá hủy tế bào đường tiết niệu hệ miễn dịch bị ức chế suy giảm Ngoài tiết đường tiết niệu, BKV xuất huyết tương bệnh nhân ghép thận Ở bệnh nhân ghép thận, tỷ lệ lưu hành BKV dao động từ 10% tới 60%, số 1% tới 10% dẫn đến BKVN, đặc trưng hoại tử ống thận tình trạng viêm thận kẽ Sự tiến triển BKVN thường xảy mà khơng có dấu hiệu lâm sàng triệu chứng rõ ràng ngoại trừ tăng nồng độ creatinin huyết thanh, không phát kịp thời 15% đến 80% trường hợp BKVN dẫn tới ghép vòng năm [3] Mặt khác, BKVN thường dễ bị bỏ sót chẩn đốn nhầm lẫn với tình trạng thải ghép cấp tính độc tính thuốc ức chế miễn dịch Bộ gen BKV có kích thước gần 5,3 kb, chia thành vùng: vùng kiểm soát sớm, vùng kiểm soát muộn vùng khơng mã hóa [3], vùng khơng mã hóa giữ chức điều tiết, vùng mã hóa sớm mã hóa cho kháng nguyên T lớn, T nhỏ vùng mã hóa muộn mã hóa agnoprotein protein cấu trúc (Viral Protein: VP1, VP2 VP3) VP1 thành phần vỏ capsid, giúp trì cấu trúc capsid, đồng thời vịng lặp bên ngồi VP1 đóng vai trị quan trọng việc làm trung gian gắn kết với thụ thể tế bào chủ chịu trách nhiệm cho tồn biến thể kháng nguyên BKV [2], [14] Dựa trình tự tồn gen đa dạng trình tự vùng VP1, Jin cs [5] phân loại chủng BKV có thành bốn kiểu gen kí hiệu từ BKV I-IV, đồng thời kiểu gen có mối tương quan rõ rệt với kiểu huyết học [7] BKV- I xác định kiểu gen lưu hành phổ biến giới (80%), BKV- IV (15%), BKV- II BKV- III gặp BKV-I tiếp tục chia thành phân nhóm I/a, I/b-1, I/b-2 I/c; BKV-IV đa dạng với phân nhóm IV/a-1, IV/ a-2, IV/b-1, IV/b-2, IV/c-1, IV/c-2 Sự phân bố đa dạng kiểu BKV phân nhóm BKV quần thể người nghiên cứu nhiều nước, phân nhóm Ia phổ biến châu Phi, phân nhóm I/b-1 phổ biến Đơng Nam Á, phân nhóm I/b-2 phổ biến châu Âu phân nhóm I/c phổ biến Đơng Bắc Á [8], [15] Cũng phân nhóm I, phân nhóm BKV-IV tương ứng với vị trí địa lý định [11] Các nghiên cứu gần cho thấy kiểu gen BKV có liên quan đến yếu tố độc lực bệnh sinh BKVN Tuy nhiên, Việt Nam, chưa có nghiên cứu xác định tỷ lệ lưu hành kiểu gen BKV bệnh nhân ghép thận Do đó, mục tiêu nghiên cứu nhằm xác định phân bố lưu hành kiểu gen BKV bệnh nhân ghép thận Bệnh viện Quân y 103 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bệnh nhân mẫu bệnh phẩm Mẫu máu nước tiểu 131 bệnh nhân ghép thận thu thập Khoa Thận Lọc máu, Bệnh viện Quân y 103 Mẫu nước tiểu xử lý cách ly tâm 3200 rpm, 30 phút, bỏ dịch, thu cặn Mẫu máu ly tâm 3000 rpm, 10 phút tách lấy huyết tương Huyết tương cặn nước tiểu bảo quản -80oC tách DNA Thông tin lâm sàng cận lâm sàng thu thập cho phân tích liên quan với kiểu gen BKV Tách DNA BKV-DNA tách chiết từ 200 µl huyết tương cặn nước tiểu theo quy trình kit GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ) DNA ly giải 54 µl dung dịch Elution buffer Các mẫu sau bảo quản lâu dài -80oC thực phản ứng Nested - PCR TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Nested PCR giải trình tự Các cặp mồi nhằm khuếch đại vùng gen VP1 thay đổi số trình tự so với công bố trước nhằm phù hợp với chủng Việt Nam [6], [9] Thành phần phản ứng PCR thể tích 20 µl gồm: 1X Dream Taqgo master mix, 0,2 µM hỗn hợp mồi xi - ngược, µl DNA khn, điều chỉnh H2O khử ion đủ thể tích 20 μl Phản ứng PCR khuếch đại máy Mastercycler (Eppendorf, Hamburg, Germany) với chu trình nhiệt sau: Vòng (95oC x phút)(94oC x 30 giây; 58oC x 30 giây; 72oC x 45 giây) x 35 chu kỳ, (72oC x phút); vòng (95oC x phút)(94oC x 30 giây; 42oC x 30 giây; 72oC x 30 giây) x 35 chu kỳ, (72oC x phút) Sản phẩm Nested - PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,2% TBE 0,5X, nhuộm ethidium bromide, chụp ảnh lưu kết máy UVP (Eppendorf, Hamburg, Germany) Bảng Các cặp mồi sử dụng nghiên cứu Primers Sequences Position BKV_ S ATC AAA GAA CTG CTC CTC AAT 1361-1381 BKV_ AS GCA CTC CCT GCA TTT CCA AGG G 1919-1940 BKV-F CAA GTG CCA AAA CTA CTA AT 1630-1649 BKV-R TGC ATG AAG GTT AAG CAT GC 1937-1956 BKV-seq AGG AGT AGA AGT TCT AGA AG 1651-1675 Size (bp) References 580 bp 327 bp 287 bp Các chủng tham chiếu 26 trình tự genome BKV tương ứng với kiểu gen BKV thu thập từ Genbank để so sánh với trình tự chủng BKV phân lập từ bệnh nhân ghép thận nghiên cứu Thông tin trình tự tham chiếu thể Bảng Bảng Các trình tự tham chiếu Mã số AB211369 AB365177 JN192433 AB301086 AB211370 AB369092 NC001538 V01108 AB211381 AB211372 AB211386 AB263920 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 Phân nhóm I/b-1 I/b-1 I/b-1 I/b-2 I/b-2 I/a I/a I/a I/c I/c III II Quốc gia Nhật Bản Nhật Bản Ireland Nhật Bản Netherland Nhật Bản USA USA Nhật Bản Nhật Bản Nhật Bản Anh NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG AB269859 AB269869 AB268868 AB211389 AB269867 AB269858 AB269863 AB211391 AB217919 KF468291 AB269857 AB269835 AB269834 AB211387 IV/a-1 IV/a-1 IV/a-2 IV/a-2 IV/c-1 IV/c-1 IV/c-1 IV/b-1 IV/b-1 IV/c-2 IV/c-2 IV/b-2 IV/b-2 IV/b-2 Giải trình tự gen xây dựng chủng loại phát sinh Sản phẩm Nested-PCR tinh giải trình tự trực tiếp máy 3130 XL (ABI, Mỹ) Trình tự vùng VP1 thu sử dụng phần mềm BioEdit 7.0 MEGA7.0 để phân tích xây dựng phát sinh loài chủng BKV phân lập bệnh nhân ghép thận theo phương pháp Neiborjoining (ML) với hệ số bootstrap lặp lại 1000 lần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Thông tin chung bệnh nhân Bảng Đặc điểm chung nhóm bệnh nhân nghiên cứu Đặc điểm Giới tính Thơng số Nam 91 (69,47%) Nữ 40 (30,53%) Tuổi 39,73 ± 10,68 Creatinin T1 (µmol/ml) 116,53 ± 33,40 HLA mismath 3,57 ± 1,47 BKVN (6,11%) Philippine Việt Nam Việt Nam Nhật Bản Việt Nam Trung Quốc Trung Quốc Nhật Bản Nhật Bản Đức Trung Quốc Nhật Bản Nhật Bản Nhật Bản Tổng số 131 bệnh nhân ghép thận đưa vào nghiên cứu với độ tuổi trung bình 39,73±10,68 Tỷ lệ bệnh nhân nam chiếm 69,47%, nữ chiếm 30,53% Các số xét nghiệm gồm số điểm hịa hợp HLA trung bình 3,57±1,47, nồng độ creatinine tháng đầu sau ghép 116,53±33,40 Trong số 131 bệnh nhân, trường hợp chẩn đoán BKVN (6,11%) sinh thiết thận Nested - PCR phát BKV Mẫu bệnh phẩm 131 bệnh nhân tách DNA thực Nested - PCR với cặp mồi đặc hiệu Trong số đó, 40 mẫu (30,53%) dương tính với BKV, thể qua hình ảnh điện di với băng đặc hiệu có kích thước 327 bp (hình 1) Các băng sáng, đậm nét khơng có sản phẩm phụ Hình Nested PCR gen VP1 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Chú thích: 1, 2, 3: mẫu dương tính với BKV, 4: đối chứng âm, 5: Marker 100 bp (Thermo Fisher, Mỹ) Xác định lưu hành kiểu gen BKV bệnh nhân ghép thận 40 mẫu dương tính với BKV Nested - PCR tinh giải trình tự Dựa vào trình tự tham chiếu cơng bố Genbank với kết giải trình tự 40 mẫu dương tính, chủng loại phát sinh xây dựng theo phương pháp Neighbor-joining (Hình 2) Kết phân tích chủng loại phát sinh cho thấy: 25 mẫu (62,5%) thuộc BKV-I, 15 mẫu (37,5%) thuộc BKV- IV, không phát BKV-II, III mẫu bệnh phẩm bệnh nhân ghép thận Việt Nam Phân tích sâu trình tự lồi, 27/27 mẫu BKV-I thuộc phân nhóm I/b-1, khơng phát phân nhóm I/b-2, I/a hay I/c Tuy nhiên, BKV- IV thể đa dạng phân nhóm cao hơn: 10 mẫu thuộc phân nhóm IV/c-1, mẫu thuộc phân nhóm IV/a-1 mẫu thuộc nhóm IV/a-2 (Bảng 4) Trong số bệnh nhân bị BKVN, phát 5/8 mẫu (62,5%) thuộc phân nhóm I/b-1, 3/8 mẫu (38,5%) thuộc phân nhóm IV/c-1 Kết phân tích phân bố khác biệt kiểu gen BKV liên quan đến tuổi, giới, số xét nghiệm tình trạng BKVN khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Kết trình bày bảng Bảng Sự phân bố phân nhóm BKV BKV- I (n=25) BKV- IV (n=15) I/a I/-b1 I/b-2 I/c IV/a-1 IV/a-2 IV/b-1 IV/c-1 IV/c-2 (0%) 25 (100%) (0%) (0%) (26,67%) (6,67%) (0%) 10 (66.66%) (0%) Bảng Sự phân bố kiểu gen BKV theo số lâm sàng cận lâm sàng Thông số BKV-I (n=25) BKV-IV (n=15) p Tuổi 41,12 ± 10,94 38,94 ± 8,49 0,50 (24%) (26,67%) Nữ Giới tính 10 Nam 19 (76%) 11 (73,33%) Thời gian sau ghép (năm) 2,42 ± 2,63 1,91 ± 1,93 0,51 Creatinin T1 (µmol/ml) 126,16 ± 33,86 134,06 ± 39,62 0,50 BKVN (20 %) (20%) TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG Genotype I Genotype III Genotype II Genotype IV Hình Cây phát sinh lồi trình tự gen VP1 chủng BKV phân lập miền Bắc Việt Nam với chủng tham chiếu, sử dụng phần mềm MEGA7 theo phương pháp Neighbor joining với hệ số bootstrap lặp lại 1000 lần TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/20200 11 NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG BÀN LUẬN BKV có kiểu gen BKV-I, II, III, IV lưu hành giới phân bố kiểu gen phân nhóm phụ thuộc vào vùng địa lý khác Trong đó, BKV- I phổ biến toàn giới, chiếm tỷ lệ 70%-80% [15], tiếp đến BKVIV chiếm 15%-25%, phát châu Âu, châu Á không phát châu Phi BKV- II BKVIII gặp vùng địa lý [4] BKV- I có phân nhóm gồm I/a, I/b-1, I/b-2 I/c nguồn gốc phân bố phân nhóm khác Phân nhóm I/a có nguồn gốc châu Phi, I/b-1 có nguồn gốc từ Đơng Nam Á, I/b-2 đến từ châu Âu I/c chủ yếu Đông Bắc Á Trong nghiên cứu này, phân tích trình tự DNA vùng gen VP1 cho thấy BKV- I kiểu gen chiếm ưu (62,5%), tiếp đến BKV-IV (32,5%) Phân tích sâu để xác định phân nhóm, 25/25 mẫu thuộc BKV- I bệnh nhân ghép thận miền Bắc nghiên cứu thuộc nhóm I/b-1 Kết phù hợp với phân bố kiểu gen BKV giới nguồn gốc phân bố nhóm I/b-1 Đông Nam Á nghiên cứu trước [1], [4], [17] Nhiễm BKV BKVN vấn đề thách thức lâm sàng bệnh nhân sau ghép thận mà lựa chọn điều trị hạn chế, phụ thuộc nhiều vào kinh nghiệm bác sĩ Việc theo dõi điều trị bệnh nhân sau ghép thận đóng vai trị quan trọng trì chức thận ghép, giảm thiểu tối đa nguy mô ghép hay suy chức thận ghép Trong nghiên cứu này, phân tích kiểu gen BKV bệnh nhân BKVN khẳng định sinh thiết thận, 5/8 (62,5%) thuộc nhóm I/b-1; 3/5 (37,5%) thuộc nhóm IV/c-1, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Nghiên cứu của H Boukoum cộng (2016) 34 mẫu bệnh phẩm (máu nước tiểu) bệnh nhân ghép thận Tunisia cho thấy BKV- I có tỷ lệ lưu hành cao (79,5%), phân nhóm I/b-2 12 TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 18/2020 chiếm ưu (76,5%) H Boukoum cộng đưa nhận định khơng có liên quan kiểu gen tình trạng BKVN (p>0,05), hai bệnh nhân bị BKVN thuộc phân nhóm I/b-2 Trong đó, nghiên cứu Pastrana cs (2013) [13] BKV - IV chiếm tỷ lệ cao bệnh nhân bị BKVN sau ghép thận so với bệnh nhân sau ghép có BKV dương tính máu nước tiểu Một số nghiên cứu khác mối liên hệ kiểu gen BKV-II, III, IV với nguy bị BKVN cao bệnh nhân ghép thận [10], [16] Nghiên cứu gần Johannes Korth cộng cho thấy BKV-I chiếm tỷ lệ cao với 82%, BKV-IV (14%) cuối BKV-II (4%) Điểm đáng ý bệnh nhân BKVN BKV-II IV phát với tỷ lệ cao so với bệnh nhân bị BKVN BKV-I ((8/10 (80%) so với 17/46 (37%); p = 0,001) Trong nghiên cứu BKV- I xuất nhóm bệnh nhân BKVN cao (5/8 bệnh nhân) BKV- I chép hiệu BKV- IV tế bào biểu mô thận BKV- I chiếm ưu dân số Việt Nam [12] Kết so sánh khác biệt kiểu gen BKV liên quan đến tuổi, giới, số xét nghiệm tình trạng BKVN cho thấy khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Tuy nhiên, nghiên cứu chưa hỗ trợ đầy đủ để đánh giá tính mức độ liên quan kiểu gen BKV, tải lượng vi rút BKV máu nước tiểu nguy bệnh thận BKV, đó, nghiên cứu lớn cần thiết để kiểm tra giả thuyết KẾT LUẬN Nghiên cứu phân bố lưu hành kiểu gen BKV bệnh nhân ghép thận Việt Nam cho thấy phát BKV-I BKV-IV, BKV-I chiếm ưu (62,5% so với 37,5%) Việc xác định kiểu gen BKV giúp dự báo mối liên quan tiềm tàng diễn tiến gây bệnh BKV tiến triển BKVN bệnh nhân ghép thận ... hành kiểu gen BKV bệnh nhân ghép thận Do đó, mục tiêu nghiên cứu nhằm xác định phân bố lưu hành kiểu gen BKV bệnh nhân ghép thận Bệnh vi? ??n Quân y 103 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Bệnh nhân. .. sau ghép thận so với bệnh nhân sau ghép có BKV dương tính máu nước tiểu Một số nghiên cứu khác mối liên hệ kiểu gen BKV-II, III, IV với nguy bị BKVN cao bệnh nhân ghép thận [10], [16] Nghiên cứu. .. trì chức thận ghép, giảm thiểu tối đa nguy mô ghép hay suy chức thận ghép Trong nghiên cứu n? ?y, phân tích kiểu gen BKV bệnh nhân BKVN khẳng định sinh thiết thận, 5/8 (62,5%) thuộc nhóm I/b-1; 3/5