No 21 June 2021 |p 183 189 183 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN 2354 1431 http //tckh daihoctantrao edu vn/ THE INVESTIGATION OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF URENA LOBATA L Truong Thi Thu Huong1, T[.]
No.21_June 2021 |p.183-189 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN: 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ THE INVESTIGATION OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF URENA LOBATA L Truong Thi Thu Huong1, Tran Thi Hoai Van1,*, Tran Thi Thuy Duong2, Chu Quynh Mai3, Nguyen Thi Nguyet3 VietNam University Of Traditional Medicine, Vietnam Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry, Vietnam Tan Trao University, Vietnam *Email address: hoaivantt@gmail.com http://doi.org/10.51453/2354-1431/2021/587 Article info Abstract: The n-hexane and ethyl acetate extracts and two isolated compounds, 5- Recieved: 19/3/2021 Accepted: 3/5/2021 hydroxy-6,7-dimetoxyflavanon 3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic from Urena lobata shows that the antibacterial activity are good of Gram-positive (Bacillus subtillis and Staphylococcus aureus), Gram-negative (Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, Filamentous fungi (Aspergillus niger and Keywords: Urena lobata L., Urena, Antibacterial activity Fusarium oxysporum), yeast (Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae) with diameter of the zone of inhibition from to 28mm 183 No.21_June 2021 |p.183-189 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN: 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH CỦA LOÀI KÉ HOA ĐÀO (URENA LOBATA L.) Trương Thị Thu Hương1, Trần Thị Hoài Vân1,*, Trần Thị Thùy Dương2, Chu Quỳnh Mai3, Nguyễn Thị Nguyệt3 Học viện Y Dược học Cổ truyền Việt Nam, Việt Nam Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Việt Nam Trường Đại học Tân Trào, Việt Nam * Địa email: hoaivantt@gmail.com http://doi.org/10.51453/2354-1431/2021/587 Thơng tin viết Tóm tắt Các cặn chiết ethanol tổng, n-hexane, ethyl acetate hợp chất 5-hydroxy- Ngày nhận bài: 19/3/2021 Ngày duyệt đăng: 3/5/2021 Từ khóa: Urena lobata L., 6,7-dimetoxyflavanon 3β-hydroxy-urs-12-en-28-oic phân lập từ loài Ké hoa đào (Urena lobata) thể hoạt tính kháng tốt chủng vi khuẩn Gram (–) (Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa), chủng Gram (+) (Bacillus subtillis Staphylococcus aureus), 02 chủng nấm sợi (Aspergillus niger Fusarium oxysporum), chủng nấm men (Candida albicans Saccharomyces cerevisiae) với đường kính vịng kháng khuẩn từ đến 28 mm Urena, Ké hoa đào, hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Mở đầu khí hư, bạch đới, lỵ, tiêu hóa kém, cảm cúm, amidan, Urena lobata L thuộc họ bơng Malvaceae có tên sốt rét, hen, bướu giáp Hoa chữa thủy đậu, sốt, rối Ké hoa đào (hay ké hoa đỏ) gọi phan thiên hoa, loạn trí não Cành toàn dùng chữa tiêu phan thiên hoa, nha khac mòn, bái lương, bái cúc, chấn thương bầm dập, thấp khớp, viêm vú, rắn cắn [1, vái, địa đào hoa, niêm du tử, thổ đỗ trọng, hồng hài nhi, 2, 4] dã mai hoa, dã miên hoa, dã đào hoa [1, 2, 3] Trên Ở Philippines, rễ dùng làm thuốc giải giới, Urena lobata có vùng phân bố rộng rãi khắp nhiệt hoạt nhuận, cịn Malaysia dùng làm nước nhiệt đới Nam Mỹ, Châu Phi Châu Á Cây thuốc trị kiết lỵ Theo y học cổ truyền Ấn độ, rễ làm trồng hạn chế Braxin, Cộng hịa Trung thuốc đắp ngồi trị tê thấp, sẩy thai [3] Trong y học cổ Phi, Zaire, Gabon để lấy vỏ làm sợi [4, 5] Ở nước ta, truyền Trung Quốc, Urena lobata điều trị cảm lạnh, sốt, Urena lobata mọc nhiều nơi Lạng Sơn, Tuyên đau, bị tê thấp khớp, kiết lỵ, phù nề, bệnh lậu, Quang, Cao Bằng…[2, 3] leucorrhea, nôn máu, xe buncle, chấn thương chảy Urena lobata có vị nhạt, ngọt, dịu, tính mát, máu,…[4] khơng độc, có tác dụng nhiệt, tiêu viêm, trừ thấp, Các nghiên cứu giới cho thấy thành lợi tiêu Rễ Urena lobata dùng chữa thấp khớp, phần hóa học Urena lobata chủ yếu hợp 184 T.T.T.Huong/ No.21_Jun 2021|p.185-189 chất flavonoid dẫn xuất chúng với nhiều Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột thường với pha tĩnh hoạt tính sinh học phong phú chống oxy hóa, silica gel 60, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (230 - 400 chống lao, kháng viêm, chữa bệnh tiêu hố mesh) Merck, dung mơi rửa giải chủ yếu loại đường ruột, chống ung thư…[5, 6, 7] Tuy nhiên, phân tích, cơng nghiệp nghiên cứu hoạt tính sinh học lồi 2.4 Phương pháp khảo sát cấu trúc chất hạn chế Vì vậy, mục tiêu nghiên cứu khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cặn chiết chất từ loài Urena lobata, làm rõ chất sinh học sở cho nghiên cứu sâu hoạt tính sinh học Các chất phân lập dạng tinh khiết đối tượng để khảo sát đặc trưng vật lý: màu sắc, dạng thù hình, Rf, điểm nóng chảy, Khi chất đủ tiến hành ghi phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) chiều: Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR), phổ 2.1 Nguyên liệu DEPT phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: Mẫu thân rễ Ké hoa đào thu Tuần Giáo HSQC HMBC với kỹ thuật khác tuỳ Điện Biên vào tháng năm 2020 TS theo đối tượng cụ thể Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam) chất sử dụng thiết bị đại Các thiết bị xác định tên khoa học Urena lobata L., mẫu lưu phương pháp sử dụng gồm: Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam Điểm nóng chảy (mp): Đo máy Kofler 2.2 Phương pháp xử lý chiết mẫu micro-hotstage Viện Hóa học Hợp chất Mẫu nghiên cứu sau thu hái thái nhỏ, thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ phơi bóng mát, sấy khơ nhiệt độ 60 oC đến Việt Nam khối lượng khơng đổi, sau đem nghiền nhỏ Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR): Đo máy Mẫu ngâm chiết lần metanol thiết bị Bruckker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội TMS), siêu âm nhiệt độ phòng Dịch tổng thu cất Viện Hoá học - Viện Hàn lâm Khoa học Công kiệt dung môi áp suất giảm, nhiệt độ < 50 C nghệ Việt Nam Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt thu cặn metanol Cặn metanol thêm nhân sử dụng: o nước chiết với dung mơi có độ phân cực tăng dần n-hexan etyl axetat Sau đuổi Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều: 1HNMR, 13C-NMR DEPT dung môi thu cặn n-hexan, etyl axetat metanol tương ứng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY NOESY 2.3 Phương pháp phân tích, phân lập hợp chất từ dịch chiết Dung môi sử dụng bao gồm dung môi DMSO-d6, CD3OD CDCl3 Lựa chọn dung môi Việc phân tích, phân tách phần dịch chiết đo phụ thuộc vào chất mẫu, theo thực phương pháp sắc nguyên tắc dung mơi phải hịa tan hồn tồn mẫu ký khác sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký đo cột thường (CC) với pha tĩnh silica gel (Merck) Sắc ký lớp mỏng (TLC): Dùng để khảo sát thành 2.5 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phần thực mỏng tráng sẵn DC- Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tiến Alufolien 60 F254 (0,25 mm; Merck) RP-18 hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh mẫu F254S (0,25 mm; Merck) Phát chất đèn nghiên cứu thực theo phương pháp tử ngoại hai bước sóng 254 nm 365 nm khuếch tán qua giếng thạch Irobi cộng dùng thuốc thử dung dịch vanilin - H2SO4 5% metanol (1996) Các chủng vi sinh vật kiểm định dự kiến: chủng vi khuẩn Gram (–) (Escherichia coli ATCC 185 T.T.T.Huong/ No.21_Jun 2021|p.185-189 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 25923), Sắc ký lớp mỏng (SKLM): Sử dụng mỏng chủng Gram (+) (Bacillus subtillis ATCC 27212, nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 (Merck) độ dày Staphylococcus aureus ATCC 11632), chủng nấm 0,2 mm sợi (Aspergillus niger 439, Fusarium oxysporum Sắc ký cột: Sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt M42), chủng nấm men (Candida albicans ATCC 0,063 – 0,200 mm cỡ hạt 0,04 – 0,063 mm (230 7754, Saccharomyces cerevisiae SH20) Môi trường nuôi cấy vi sinh vật + Mơi trường trì bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Borth (SDB – Sigma) cho nấm men nấm mốc Trypcase Soya Broth (TSB – Sigma) cho vi khuẩn - 400 mesh) Dung môi chiết tách: Dung môi sử dụng để chiết tách loại sản xuất công nghiệp, gồm nhexan, ethyl acetate, acetone, dichloromethane, chloroform, methanol Phát vết chất: đèn UV 254 nm 366 nm, thuốc màu H2SO4 10% ethanol + Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm Tiến hành thí nghiệm Nhỏ dịch mẫu nghiên cứu (nồng độ 20 mg/ml cặn chiết thô mg/ml hợp chất tinh) vào lỗ thạch đĩa petri cấy vi sinh vật kiểm định, giữ C giờ, sau đặt o đĩa thạch 37 C vi khuẩn kiểm định 30 o ºC nấm kiểm định Sau 24 quan sát vịng kháng khuẩn tạo thành Tính kết Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng vi khuẩn tuyển chọn tính đường kính vịng kháng khuẩn Tính kháng khuẩn biểu vịng kháng khuẩn rộng 2mm Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định 2.3.2 Thiết bị Bình tam giác, cốc đong, bình cầu quay, bình triển khai mỏng, phễu chiết lê, cột sắc ký đường kính khác Máy siêu âm gia nhiệt Memmert GmbH + Co.KG D-91126 Schwabach FRG (Đức) Máy cất quay Rotavapor R-114, Buchi (Đức) sử dụng để cất loại dung môi Máy BOTIUS (Heiztisch Mikroskop) - Đức sử dụng để đo điểm nóng chảy Máy Bruker Avance 500, sử dụng TMS làm chất nội chuẩn để đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều 1H-NMR (500MHz) 13C-NMR (125MHz), DEPT, HMBC, HMQC, HSQC Kết thảo luận 3.1 Thu nhận cặn chiết Thân rễ Ké hoa đào (Urena lobata) sấy khô, xay nhỏ thu 3,1 kg bột mẫu khô, đem chủng vi khuẩn tuyển chọn tính đường ngâm chiết với ethanol Quá trình chiết thực kính vịng kháng khuẩn (ΔD) gián đoạn nhiệt độ 40 °C thiết bị chiết ΔD = D - d (mm) Đường kính vịng kháng khuẩn < mm: tính kháng yếu Đường kính vịng kháng khuẩn từ đến 10 mm: tính kháng trung bình Đường kính vịng kháng khuẩn > 10 mm: tính kháng mạnh siêu âm gia nhiệt lần, lần khoảng 4-5 Dịch chiết gom lại, lọc qua giấy lọc cất loại dung môi áp suất giảm thu cặn chiết tổng Ké hoa đào (KHV, 235 g) Cặn tổng sau tiến hành chiết phân bố với nhexan, ethyl acetate, methanol thu ba dịch chiết tương ứng Cất loại dung môi áp suất giảm thu cặn chiết tương ứng KH (cặn 2.3 Hóa chất thiết bị nghiên cứu n-hexan, 50 g), KE (cặn ethyl acetate, 140 g), KM 2.3.1 Hóa chất (cặn methanol, 45 g) Quy trình xử lý mẫu tạo cặn chiết theo quy trình sơ đồ sau: 186 T.T.T.Huong/ No.21_Jun 2021|p.185-189 Hình Sơ đồ quy trình ngâm chiết Ké hoa đào acetate tỷ lệ (40:1), thu ba phân đoạn nhỏ từ 3.2 Phân lập hợp chất từ cặn n-hexan Cặn n-hexan (KH – 30 g) tiến hành sắc ký KH2A→KH2C Kết tinh lại phân đoạn KH2B dung môi acetone điều kiện nhiệt độ phòng qua cột silica gel với hệ dung mơi n-hexan: ethyl thu hợp chất hình kim màu vàng (KH2; 9,8 acetate (HE) (50:1→1:1) Dung dịch rửa giải thu từ cột silica gel khoảng cách lần 100 mg), Rf = 0,50 (hệ dung mơi n-hexan:EtOAc (HE)= 2:1) ml200 ml, sau cất lại dung môi thu phân đoạn nhỏ 510 ml ta phân đoạn Phân đoạn KH3 (3,0 g) kết tinh lại dung môi ethyl axetat điều kiện nhiệt độ phòng Kiểm tra phân đoạn nhỏ sắc ký lớp mỏng thu chất bột vơ định hình khơng màu (KH3; màu thuốc thử vanilin-H2SO4, sau dồn phân đoạn giống lại, ta thu 11,4 mg), nhiệt độ nóng chảy 159-161 oC, Rf = 0,55 (hệ dung mơi chloroform:methanol (C:M)= 9:1) phân đoạn KH1→KH4 Trên sở phân tích liệu phổ NMR, kết hợp so sánh liệu phổ công bố điểm Ké hoa đào Phân đoạn KH1 (7,0 g) kết tinh lại ethyl acetate điệu kiện nhiệt độ phịng thu nóng chảy hợp chất cho phép khẳng định hợp hợp chất tinh thể hình kim, không màu (KH1; 1,1 g), điểm chảy 138-140 oC, Rf = 0,50 (hệ dung chất KH1 β-sitosterol hay stigmast-5-en-24R-3- môi n-hexan-EtOAc (HE)= 4:1) dimetoxyflavanon [9] hợp chất KH3 3βhydroxy-urs-12en-28-oic [10], có cấu trúc hố học ol Phân đoạn KH2 (7,5 g) phân tách lại [8], hợp chất KH2 5-hydroxy-6,7- sau: cột silica gel hệ dung môi n-hexan:ethyl 30 29 20 21 19 12 18 26 28 16 23 KH1 HO OH 13 14 10 22 17 11 25 15 O 27 24 KH2 KH3 Hình Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ Ké hoa đào 187 T.T.T.Huong/ No.21_Jun 2021|p.185-189 học thực nghiệm Viện Hóa học Hợp chất Thiên 3.3 Kết thử hoạt tính Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cặn dịch chiết KHV, KH, KE, KM hợp chất KH2, nhiên phương pháp đục lỗ chủng vi sinh vật kiểm định Kết thử hoạt tính kháng vi sinh KH3 phân lập từ thân rễ loài Ké hoa đào (Urena lobata) thử nghiệm Phòng Sinh vật kiểm định trình bày bảng sau: Bảng 3.3 Kết thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cặn chiết hợp chất từ Ké hoa đào (Urena lobata) Ký Nồng độ hiệu mẫu mẫu đầu (mg/ml) Đường kính vịng kháng khuẩn (D-d, mm) Vi khuẩn Gr (-) Vi khuẩn Gr (+) Nấm mốc Nấm men E P coli aeruginosa B subtillis S aureus A niger F oxysporum S cerevisiae C albicans KHV 20 28 17 18 14 22 20 26 24 KH 20 24 19 23 16 28 20 20 28 KE 20 12 15 11 14 18 15 16 KM 20 10 KH2 25 13 20 19 17 11 20 15 KH3 26 12 19 18 12 15 Kết cho thấy, tất mẫu thể có hoạt tính hoạt tính khác chủng vi khuẩn kiểm định khác Hoạt tính kháng khuẩn cặn chiết thô từ Ké hoa đào (Urena lobata) có hoạt tính tốt với chủng vi khuẩn gram âm, gram dương, vi khuẩn, nấm mốc nấm men Cặn chiết tổng KHV KH thể hoạt tính cao với chủng vi khuẩn kiểm định với đường kính vịng kháng khuẩn (ΔD) lớn 16mm thấp 14 mm tương ứng với chủng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus Cặn chiết KE KM thể hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định mức với giá trị đường kính vịng kháng khuẩn (ΔD) từ đến 18 mm Điều cho thấy, hoạt tính kháng khuẩn mạnh Ké hoa đào chủ yếu tập trung cặn chiết tổng (KHV) cặn chiết phân đoạn (KH) Các hợp chất phân lập KH2 KH3 có hoạt tính kháng khuẩn khác chống lại chủng vi khuẩn thử nghiệm Hai hợp chất KH2 KH3 thể hoạt tính kháng khuẩn tố với giá trị ΔD từ 12 đến 28 mm Hợp chất KH2 cho kết giá trị đường kính vịng kháng khuẩn lớn KH3, khác biệt không đáng kể 188 Các cặn chiết KHV, KH, KE hợp chất KH2, KH3 thể hoạt tính tốt với chủng vi khuẩn Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae Candida albicans với giá trị ΔD từ 15 đến 28 mm Các kết phù hợp với cơng trình cơng bố trước hoạt tính cặn chiết hợp chất phân lập từ Ké hoa đào (Urena lobata) [14], [20], [24] KẾT LUẬN Cặn chiết ethanol tổng (KHV), n-hexane (KH), ethyl acetate (KE) hợp chất KH2, KH3 thể hoạt tính ức chế mức khác chủng vi sinh vật kiểm định thử nghiệm với đường kính vịng kháng khuẩn lớn mm Thể hoạt tính tốt với chủng vi khuẩn Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae Candida albicans với giá trị ΔD từ 15 đến 28 mm Cặn chiết methanol (KM) thể hoạt tính mức trung bình yếu với giá trị giá trị ΔD từ đến 10 mm LỜI CẢM ƠN Chúng cảm ơn Học viện Y Dược học Cổ truyền Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi hỗ trợ kinh phí cho nhóm nghiên cứu thực đề tài REFERENCES [1] Ban, N.T (2003) List of plant species in Vietnam Agriculture Publishing House, Vietnam T.T.T.Huong/ No.21_Jun 2021|p.185-189 [2] Loi, D.T (2004) Vietnamese medicinal [6] Singh, D., Singh, V.S (2016) Isolation and plants and herbs Medicine Publishing House, characterrization of flavonoids in Urena lobata Hanoi, Vietnam Leaves European Journal of Medicinal Plants, [3] Xuyen, D.T & Thin, N.N (2004) Study on the diversity of cotton genera (Malvaceae) in Vietnam Journal of Genetics and Applications, 1:9-13, Vietnam [4] Dhanapal, R., Ratna, J.V., Gupta, M., Sarathchandran, I (2012) Preliminary study on antifertility activity of Enicostemma axillare leaves and Urena lobata root used in Indian traditional folk medicine Asian Pac J Trop Med, 5:16-22 [5] Ali, S., Faruq, K.O., Rahman, A.A., Hossain, M.A (2013) Antioxidant and cytotoxic ativities of methanol extract of Urena lobata (L.) Leaves Pharm Innov J, 2(2):9-14 11(1):1-6 [7] Fagbohun, E.D., Asare, R.R., Egbebi, A.O (2012) Chemical composition and antimicrobial activities of Urena lobata L (Malvaceae) Journal of Medicinal Plants Research, 6(12):2256-2260 [8] Goad, L.J., Akihisa, T (1997) Analysis of sterols Chapman & Hall, 324-333 [9] Kamperdick, C., Van, N.H., Sung, T.V (2002) Constituents from Miliusa balansae (Annonaceae) Phytochemistry, 61(8):991-994 [10] Jaki, B.U., Franzblau, S.G., Chadwick L.R., Lankin, D.C., Zhang, F., Wang, Y., Pauli, G.F (2008) Puriy – Activity Relationships of Natural Products: The Case of Anti-TB Active Ursolic Acid J.Nat.Prod, 71:1742-1748 189 ... nhiên phương pháp đục l? ?? chủng vi sinh vật kiểm định Kết thử hoạt tính kháng vi sinh KH3 phân l? ??p từ thân rễ loài Ké hoa đào (Urena lobata) thử nghiệm Phịng Sinh vật kiểm định trình bày bảng sau:... phân l? ??p từ loài Ké hoa đào (Urena lobata) thể hoạt tính kháng tốt chủng vi khuẩn Gram (? ?) (Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa), chủng Gram ( +) (Bacillus subtillis Staphylococcus aureus),... |p.183-189 TẠP CHÍ KHOA HỌC ĐẠI HỌC TÂN TRÀO ISSN: 2354 - 1431 http://tckh.daihoctantrao.edu.vn/ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH CỦA LOÀI KÉ HOA ĐÀO (URENA LOBATA L. ) Trương Thị Thu