Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG (NESTED P[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG (NESTED - PCR) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG (NESTED - PCR) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Đắc Trung THÁI NGUYÊN - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình Mọi kết thu nguyên bản, không chỉnh sửa, chép từ nghiên cứu khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Lê Thị Thu Hà ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Đắc Trung TS Nguyễn Phú Hùng định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt suốt trình tơi tiến hành nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô Bộ môn Vi sinh, trường Đại học Y Dược - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện cho tơi q trình tiến hành thí nghiệm nghiên cứu phịng thí nghiệm Tơi xin tỏ lịng biết ơn tới thầy cô cán Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tận tình dạy dỗ, bảo truyền cho niềm đam mê nghiên cứu khoa học Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp nhiệt tình động viên cho tơi thêm động lực hồn thành tốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Thái Nguyên, tháng năm 2017 Tác giả Lê Thị Thu Hà iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương bệnh viêm gan B virus viêm gan B 1.1.1 Lịch sử phát bệnh viêm gan B 1.1.2 Tình hình bệnh viêm gan B giới Việt Nam 1.1.3 Virus HBV (Hepatitis B virus) 1.2 Các kiểu gen HBV tình hình nghiên cứu kiểu gen HBV nước 13 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm nghiên cứu 17 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 17 2.2 Địa điểm nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp thu nhận xử lý mẫu bệnh phẩm 20 2.3.2 Phương pháp tách chiết HBV DNA 21 2.3.3 Định lượng DNA HBV kỹ thuật real-time PCR 21 iv 2.3.4 Xác định kiểu gen HBV kỹ thuật PCR lồng (Nested - PCR) 22 2.3.5 Điện di gel agarose đọc kết điện di 27 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết tách chiết HBV-DNA tổng số 28 3.2 Kết xác định kiểu gen (genotype) virus viêm gan B kỹ thuật PCR lồng (Nested – PCR) 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ATP Adenosin triphosphat Bp Base pair CS Cộng CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide ddNTP Dideoxy Nucleotide Triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate EDTA Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid HBV Hepatitis B virus HBcAg Hepatitis B Core Antigen HBeAg Hepatitis B Early Antigen HBsAg Hepatitis B Surface Antigen HCC Hepatocellular carcinoma IgM Immuno Globulin M Kb Kilobase KDa Kilodalton LiPA Line probe assay LMA Kết hợp kháng thể LTC Lympho T cytotoxic MHR Major Hydrophilic Region ORF Open - reading frame PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphism DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic Acid SDS Sodium Doecyl Sulphat vi SGOT Serum Glutamo-oxalo transaminase SGPT Serum Glutamo-pyruvic transaminase SSR Simple Sequence Repeats TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA Tris Trioxymetylaminometan WHO World Health Organization vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự phân bố kiểu gen HBV số tác giả nước nước khu vực 13 Bảng 2.1 Các dung dịch đệm sử dụng thí nghiệm 17 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 18 Bảng 2.3 Cặp mồi khuếch đại vùng gen S HBV 23 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR vịng ngồi 24 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR vịng ngồi 24 Bảng 2.6 Mồi sử dụng cho phản ứng PCR vòng (nhóm 1) 25 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR vịng nhóm I 25 Bảng 2.8 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR vịng (nhóm I) 25 Bảng 2.9 Mồi sử dụng cho phản ứng PCR vịng (nhóm II) 26 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng PCR vịng (nhóm II) 26 Bảng 2.11 Chu trình nhiệt phản ứng PCR vịng (nhóm II) 26 Bảng 3.1 Tỷ lệ kiểu gen HBV số bệnh nhân viêm gan B tỉnh Thái Nguyên 36 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sự phân bố HBV giới Hình 1.2: Hạt virus hoàn chỉnh Hình 1.3: Hình ảnh hiển vi điện tử HBV Hình 1.4: Cấu trúc gen HBV tương ứng với mRNA (A) với protein (B) Hình 1.5: Gen S P gối cấu trúc genome HBV Hình 1.6: Tiểu thể nhỏ hình cầu (A) hình ống (B) HBV Hình 1.7: Chu trình nhân lên HBV tế bào gan 11 Hình 2.1: Sơ đồ bước thực trình nghiên cứu 20 Hình 2.2: Sơ đồ xác định kiểu gen HBV phản ứng nested-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu (nt, nucleotide) 22 Hình 3.1: Kết xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) bệnh nhân nhiễm HBV kỹ thuật Real-time PCR 29 Hình 3.2: Kết thơng số phản ứng Realtime-PCR thực 30 Hình 3.3: Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM mầu JOE chứng dương chứng âm 31 Hình 3.4: Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM mầu JOE mẫu xét nghiệm dương tính 32 Hình 3.5: Kết xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) bệnh nhân Trần Văn H nhiễm HBV kỹ thuật Realtime PCR 33 Hình 3.6: Kết xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) bệnh nhân Tơ Văn Kh nhiễm HBV kỹ thuật Realtime PCR 33 Hình 3.7: Sản phẩm PCR vịng với nhóm I (kiểu gen A, B, C) gel điện di 35 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện nay, tình trạng nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV) vấn đề quan tâm giới nói chung Việt nam nói riêng Virus viêm gan B nguyên nhân chủ yếu gây xơ gan, ung thư gan [7], [8] Theo thống kê Tổ chức Y tế giới (World Health Organization WHO), có khoảng tỷ người bị nhiễm virus viêm gan B; có 350 triệu người mang virus viêm gan B mạn tính Những người mang virus viêm gan B mạn tính nguồn lây nhiễm quan trọng cộng đồng có nguy cao mắc bệnh gan nguy hiểm liên quan đến nhiễm vi rút viêm gan B bệnh viêm gan hoại tử (necroinflammatory) cấp mạn, xơ gan đặc biệt ung thư biểu mô tế bào gan (hepatocellular carcinoma: HCC), làm cho khoảng trăm đến triệu bệnh nhân tử vong năm [46], [47] Tại Việt Nam có khoảng 15% - 20% người nhiễm HBV, có khoảng 80- 92% bệnh nhân xơ gan ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV [4] Kiểu gen HBV phát lần năm 1988 Okamoto cs dựa vào khác biệt 8% trình tự nucleotide tồn bộ gen HBV [37] Ở vùng địa lý khác có phân bố khác kiểu gen HBV [12], [13] Để xác định genotype HBV sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử khác phân tích đa hình đoạn giới hạn (restriction fragment length polymorphism - RFLP) [6], phương pháp PCR đa mồi (multiplex PCR) [9,28,30], phương pháp realtime - PCR [49], phương pháp oligonucleotide microarray [41] Sự hiểu biết phân bố kiểu gen virus HBV có vai trị quan trọng cơng việc điều trị theo dõi diễn tiến bệnh, phòng ngừa biến chứng bệnh Đặc biệt điều có ý nghĩa cơng tác quản lý giám sát mặt dịch tễ học phục vụ cho cơng tác phịng chống bệnh viêm gan siêu vi B Xuất phát từ thực tế tiến hành đề tài: “Xác định kiểu gen virus viêm gan B số bệnh nhân nhiễm virus Thái Nguyên phương pháp PCR lồng (Nested - PCR)” Mục tiêu nghiên cứu Xác định kiểu gen virus viêm gan B số bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B Thái Nguyên Nội dung nghiên cứu 3.1 Tách chiết HBV DNA tổng số từ mẫu huyết bệnh nhân nhiễm HBV (có kết xét nghiệm HBsAg dương tính) Xác định hàm lượng HBV DNA mẫu kỹ thuật Real-time PCR 3.2 Xác định kiểu gen virus viêm gan B kỹ thuật PCR lồng (Nested - PCR) Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương bệnh viêm gan B virus viêm gan B 1.1.1 Lịch sử phát bệnh viêm gan B Năm 1964 Baruch Blumberg mô tả loại kháng nguyên (KN) đặc trưng thổ dân châu Đại Dương gọi “KN Australia” Đến năm 1968, phát thấy máu bệnh nhân viêm gan B mãn tính có tiểu thể hình cầu hình sợi, đường kính 27nm khơng chứa DNA Đó KN bề mặt HBsAg (hepatitis B surface antigen) Hai tiểu thể HBV (Hepatitis B virus) hồn chỉnh thiếu genome Năm 1970, người ta phát thấy máu bệnh nhân viêm gan B hình cầu, đường kính 42nm, bên chứa ADN kép gọi tiểu thể Dane Nghiên cứu sau xác định tiểu thể Dane HBV thực [13] 1.1.2 Tình hình bệnh viêm gan B giới Việt Nam 1.1.2.1 Trên giới Nhiễm virus viêm gan B vấn đề có tính chất tồn cầu HBV xuất quần thể dân chúng sống cách biệt người sống đảo Tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B cách thức lây truyền có khác biệt rõ rệt vùng khác giới Trên sở điều tra huyết học dấu ấn miễn dịch virus viêm gan B đặc biệt HBsAg, Tổ chức Y tế Thế giới chia mức độ nhiễm virus viêm gan B thành mức độ khác nhau: cao, trung bình, thấp [45], [46], [47] Vùng lưu hành dịch cao Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg 8% tỷ lệ người nhiễm virus viêm gan 60% Gần 45% dân số giới nằm vùng bao gồm hầu thuộc khu vực Châu Á (trừ Nhật Bản, Ấn Độ), Châu Phi, hầu Trung Đông, vùng lưu vực sông Amazon (Nam Mỹ), hầu hết đảo thuộc khu vực Thái Bình Dương, số dân tộc sống Bắc cực Eskimo, Maoris Việt Nam nước xếp vùng lưu hành dịch cao [20] Hình 1.1: Sự phân bố HBV giới [50] Vùng lưu hành dịch trung bình Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg từ 2-7% tỷ lệ người nhiễm virus viêm gan B từ 20-60%, 43% dân số giới nằm vùng bao gồm Ấn Độ, phần Trung Đông, Tây Á, Nhật Bản, Nga, Đông Âu, hầu Nam Trung Mỹ Phương thức lây truyền đa dạng, xảy tất lứa tuổi từ trẻ sơ sinh đến người lớn Hay gặp trường hợp nhiễm cấp virus viêm gan B phần lớn nhiễm trùng xảy lứa tuổi niên người lớn [34], [45] Vùng lưu hành thấp Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg 2% tỷ lệ người nhiễm virus viêm gan B 20% 12% dân số giới nằm vùng bao gồm nước Mỹ, Canada, Tây Âu, Úc, New Zealand, Bắc Mỹ, Nam Mỹ Phương thức lây truyền lây truyền ngang lứa tuổi trưởng thành, chủ yếu xảy nhóm người có nguy cao tiêm chích ma tuý, đồng tính luyến ái, nhân viên y tế, người truyền máu lây nhiễm gia đình người nhiễm virus viêm gan B [16], [46] 1.1.2.2 Tại Việt Nam Việt Nam quốc gia nằm vùng lưu hành viêm gan B cao Tỷ lệ mang HBV cộng đồng dân cư 15% - 25% Hàng năm, có khoảng 20.000 người mắc viêm gan tỷ lệ tử vong từ 0,7% - 0,8% [6] Giai đoạn từ năm 1988 đến năm 1996, Việt Nam có hàng chục nghiên cứu tỉ lệ mang HBsAg người bình thường Mặc dù nghiên cứu dừng lại vài nhóm đối tượng địa phương cụ thể, phân bố nhiều vùng nước Theo nghiên cứu Hoàng Thủy Nguyên, Phạm Song, giai đoạn 1990-1997, tỉ lệ nhiễm HBV cộng đồng người Việt Nam: Cộng đồng người khỏe mạnh 15% mang HBsAg người bệnh có HBV 45% (IgM anti-HBc) [8] Nhìn chung, nghiên cứu cho kết tỉ lệ nhiễm HBsAg đối tượng nghiên cứu mức số Theo nghiên cứu tình hình viêm gan virus B Việt Nam (Chương trình Quốc gia - Mã số KY 01 - 09), Hà Nội, tỉ lệ mang HBV cộng đồng dân cư 11,35 % Tỉ lệ nhiễm HBV thành phố Hồ Chí Minh 19,7% [6] 1.1.3 Virus HBV (Hepatitis B virus) 1.1.3.1 Hình thái HBV HBV thuộc loại siêu vi trùng (virus): Nhóm VII (dsDNA-RT) Họ (familia): Hepadnaviridae Chi (genus): Orthohepadnavirus Loài (species): viêm gan B Các nghiên cứu hiển vi điện tử xác định hình thái HBV Về cấu tạo, hạt virus HBV hồn chỉnh (Virion) có hình cầu nhỏ, đường kính 22-45 nm, gồm lớp: lớp bao dày khoảng nm, lớp vỏ Capsit hình hộp, có đường kính khoảng 27 - 28 nm lõi chứa gen virus Trong huyết bệnh nhân giai đoạn hoạt động nhân đôi virus, kính hiển vi điện tử người ta thấy có tiểu thể khác virus: Tiểu thể hình cầu nhỏ có đường kính 22 nm; Tiểu thể hình ống (hình que) có đường kính 20-22 nm, dài 40-400 nm; Tiểu thể hình cầu lớn có đường kính 42-45 nm cịn gọi tiểu thể Dane, virus hồn chỉnh [17] Hình 1.2: Hạt virus hồn chỉnh Hình 1.3: Hình ảnh hiển vi điện tử (tiểu thể Dane) HBV [17] HBV [17] 1.1.3.2 Cấu trúc HBV Cấu tạo virus HBV giống đại đa số virus khác Chúng có lớp vỏ ngồi protein, có chứa bề mặt nhiều kháng nguyên HBs, cấu trúc DNA bên HBV chủng virus có cấu trúc DNA có khả lây truyền qua đường máu Quá trình chép DNA trình phiên mã ngược nhờ RNA trung gian Protein kháng nguyên lắp ráp cách đồng dạng DNA phần, trình tự protein tương đồng phản ứng chéo huyết học [25], [26] Bộ gen HBV phân tử DNA mạch kép, dạng vòng khơng hồn chỉnh, kích thước khoảng 3,2Kb, cấu tạo hai chuỗi đơn ngược dấu có chiều dài khơng Chuỗi dài (chuỗi âm) nằm ngồi tạo nên vịng trịn liên tục có chiều dài cố định 3,2Kb mang tồn thơng tin di truyền HBV Chuỗi ngắn (chuỗi dương) nằm có kích thước thay đổi chiếm khoảng 50-80% chuỗi dài Hình 1.4: Cấu trúc gen HBV tương ứng với mRNA (A) với protein (B) [37] Hệ gen HBV có bốn khung đọc mở (open-reading frame) ORF gối lên hồn tồn khơng hồn tồn nhằm giảm thiểu chiều dài gen, bao gồm: gen lõi C, gen bề mặt S, gen X, gen polymerase P Các gen mã hóa cho tồn protein virus [44] Sự bắt cặp bổ sung nucleotide vùng gối hai sợi (âm dương) giới hạn hai trình tự lặp trực tiếp DR1 DR2 cho phép trình khép vòng hệ gen xảy protein P (polymerase) liên kết đồng hóa trị với đầu 5’ sợi âm (hình 1.4) [37] Gen S gen mã hóa cho cấu trúc vỏ bề mặtcủa HBV gồm vùng: pre S1 (108 axít amin) pre S2 (55 axít amin); hai vùng mã hóa cho kháng nguyên bề mặt HBsAg, vùng S (226 axít amin) mã hóa kiểu gen bề mặt HBsAg, vùng S (226 axít amin) mã hóa kiểu gen 8 Hình 1.5: Gen S P gối cấu trúc genome HBV [37] Gen C mã hóa cho cấu trúc lõi bao gồm hai vùng: pre C (29 axít amin) mã hóa cho HBeAg vùng C (183 axít amin) mã hóa cho HBcAg Gen P (832 axít amin) gen dài mã hóa cho DNA polymerase với RNA trung gian tham gia vào trình chép ngược virus Gen X gồm 154 axít amin mã hóa cho hai protein HBV mà chức chúng tham gia vào giai đoạn phiên mã chép q trình nhân đơi HBV, đóng vai trị chủ yếu phát triển thành ung thư gan bệnh nhân Sự thay đổi trình tự nucleotide gen S dẫn đến thay đổi trình dịch mã chép gen HBV, dẫn đến có khác biệt cấu trúc vùng vỏ bề mặt HBV nguyên nhân tạo thành kiểu gen khác virus [37] 9 1.1.3.3 Thành phần cấu trúc kháng nguyên HBV có ba loại kháng ngun chính: kháng ngun bề mặt HBsAg, kháng nguyên lõi HBcAg HbeAg [15], [43] HBsAg (Hepatitis B surface antigen) tìm thấy huyết tế bào gan người bị nhiễm HBV dạng hồn chỉnh hay khơng hồn chỉnh Kháng ngun bề mặt có hai dạng hình cầu hình ống Thành phần cấu tạo hai dạng gồm protein, lipid, carbonhydrat, khơng có acid nucleic nên xem dạng khơng hồn chỉnh HBV HBsAg điểm huyết học thường dùng để xác định nhiễm HBV [15], [43] Hình 1.6: Tiểu thể nhỏ hình cầu (A) hình ống (B) HBV [15] HBsAg xuất sớm trước có triệu chứng lâm sàng, tăng cao dần biến sau 4-8 tuần kể từ có triệu chứng Nếu sau tháng mà cịn HBsAg có nguy chuyển thành người mang HBsAg mạn tính [15] Sự diện HBsAg huyết chứng tỏ có DNA virus HBV tế bào gan Định lượng HBsAg có giá trị tiên lượng, giai đoạn bình phục hàm lượng HBsAg khơng nhỏ ¼ so với trị số ban đầu có nguy trở thành người mang virus mạn tính [12] HBcAg (Hepatitis B core antigen) tìm thấy tế bào gan người nhiễm HBV Trong huyết thanh, HBcAg diện thành phần virus hồn chỉnh khơng dạng tự [43] 10 1.1.3.4 Cơ chế nhân lên HBV Q trình chép HBV chia làm nhiều bước: Gắn kết virus vào tế bào ký chủ; Xâm nhập virus vào tế bào (sự nhập bào); Phóng thích gen virus; Biểu sản phẩm gen virus; Sao chép gen virus; Lắp ráp hạt virion (virus hồn chỉnh); Phóng thích virus [2] Sự gắn kết HBV vào tế bào chủ bước then chốt, xác định tính hướng quan virus nhờ vào điểm gắn virus thụ thể tương ứng bề mặt tế bào Hạt HBV hồn chỉnh lưu thơng máu tìm cách gắn kết vào tế bào chủ Nhiều chứng cho thấy, vùng protein bề mặt lớn (vùng PreS1) nơi gắn kết thụ thể Sự gắn kết qua trung gian albumin huyết người biến đổi Vì thế, HBV dùng protein huyết biến đổi phương tiện chuyên chở để vào tế bào gan [2] Cơ chế HBV vào tế bào chủ chưa hiểu biết rõ ràng: vỏ HBV có protein dung hợp, protein dung hợp chèn chuỗi mã kị nước vào hai lớp lipid tế bào đích gây dung hợp màng virus với màng tế bào, qua phóng thích nucleocapsit virus vào bào tương; virus nhập nội bào qua trung gian thụ thể [2] Các nghiên cứu gần cho thấy, đường kính tối đa lỗ nhân 25nm nhỏ so với kích cỡ hạt lõi 36nm Tuy nhiên, hạt lõi vận chuyển gen virus đến phức hợp lỗ nhân bị phosphoryl hóa Vì kích cỡ hạt lõi lớn nên phóng thích gen sau phải xảy gen virus vào nhân, qua trung gian polymerase virus nối đồng hóa trị [3] ... ? ?Xác định kiểu gen virus viêm gan B số b? ??nh nhân nhiễm virus Thái Nguyên phương pháp PCR lồng (Nested - PCR) ” Mục tiêu nghiên cứu Xác định kiểu gen virus viêm gan B số b? ??nh nhân nhiễm virus viêm. ..ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B Ở MỘT SỐ B? ??NH NHÂN NHIỄM VIRUS TẠI THÁI NGUYÊN B? ??NG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG (NESTED. .. 3.2 Xác định kiểu gen virus viêm gan B kỹ thuật PCR lồng (Nested - PCR) Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương b? ??nh viêm gan B virus viêm gan B 1.1.1 Lịch sử phát b? ??nh viêm gan B Năm 1964 Baruch