ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI LUẬN VĂ[.]
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh THÁI NGUYÊN - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi trực tiếp thực với giúp đỡ cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hướng dẫn khoa học PGS TS Nghiêm Ngọc Minh Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố công trình khác Thái Nguyên, tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Nhã Quyên ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn tốt nghiệp này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh - Trưởng phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, người tận tình bảo, hướng dẫn tơi q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu; phịng Đào tạo; khoa Cơng nghệ sinh học Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, quý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu khoa học Tôi xin chân thành cảm ơn TS Võ Thị Bích Thủy, ThS Nguyễn Hồi Thu anh chị em, cán phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tơi hồn thành luận văn Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè tất thầy ln ln động viên, khuyến khích giúp đỡ tơi tiến trình tơi học tập làm luận văn Trong trình làm luận văn khơng tránh khỏi sai sót, tơi mong nhận đóng góp q báu từ phía thầy bạn bè để tơi có kết tốt Thái Nguyên, tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Nhã Quyên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học đề tài Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Salmonella 1.1.1 Tình hình nghiên cứu giới 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nước 1.2 Một số đặc điểm vi khuẩn Salmonella 1.2.1 Đặc điểm hình thái 1.2.2 Đặc tính ni cấy 1.2.3 Đặc tính hóa sinh 10 1.2.4 Cấu trúc Salmonella 10 1.2.5 Các yếu tố gây bệnh Salmonella 12 1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Salmonella 13 1.3.1 Ngộ độc thực phẩm 13 1.3.2 Ngộ độc thực phẩm vi khuẩn Salmonella 14 1.4 Hiện tượng kháng kháng sinh Salmonella 15 1.4.1 Hiện tượng kháng kháng sinh vi khuẩn 15 iv 1.4.2 Hiện tượng kháng kháng sinh Salmonella 15 1.5 Gen kháng kháng sinh 16 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Thu thập phương pháp lấy mẫu 19 2.1.2 Hóa chất nghiên cứu 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.1.1 Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Salmonella 20 2.2.2 Định type vi khuẩn Salmonella 21 2.2.3 Thử khả kháng kháng sinh 21 2.2.4 Phương pháp xác định số gen kháng kháng sinh chủng Salmonella Typhimurium phương pháp RT-PCR 22 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 25 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 Thu thập mẫu số loại thịt tươi 26 3.2 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp môi trường 27 3.1.1 Kết xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp mẫu thịt lợn, gà, bò 27 3.1.2 Kết giám định đặc tính sinh hóa chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập 29 3.2 Kết định type vi khuẩn Salmonella phân lập 30 3.3 Kết xác định tính kháng kháng sinh chủng Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập 32 3.4 Kết phát đánh giá gen kháng thuốc chủng Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập 35 3.4.1 Kết tách chiết RNA tổng số: Lựa chọn chủng Salmonella Typhimurrium S181, S360, S384 để tiến hành tách chiết RNA 35 v 3.4.2 Kết RT-PCR phát gen kháng kháng sinh chủng Salmonella Typhimurium 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 Kết luận 43 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp : Base pair cs : Cộng dH2O : Nước khử ion DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : deoxyribonucleotide triphosphates EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetace Axit EtBr : Ethidium Bromide Kb : Kilobase OD : Optical density PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic acid RT-PCR : Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction TAE : Tris-acetate-EDTA vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Trình tự mồi nhiệt độ gắn mồi gen sử dụng nghiên cứu 24 Bảng 3.1 Danh sách thu thập mẫu thịt tươi số địa điểm Hà Nội 26 Bảng 3.2 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp từ mẫu thịt 27 Bảng 3.3 Kết giám định đặc tính ni cấy hình thái khuẩn lạc chủng Salmonella spp trình phân lập 29 Bảng 3.4 Kết giám định số đặc tính sinh hố chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập 30 Bảng 3.5 Kết xác định serotype chủng vi khuẩn Salmonella spp 31 Bảng 3.6 Tổng hợp kết kháng nhóm kháng sinh type Salmonella Typhimurium (ST) phân lập 33 Bảng 3.7 Kết đánh giá gen kháng kháng sinh chủng Salmonella Typhimurium S181, S360, S384 41 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vi khuẩn Salmonella Hình 2.1 Sơ đồ nuôi cấy phân lập vi khuẩn Salmonella theo tiêu chuẩn ISO 6579 - 2005 20 Hình 3.3 Kết mức độ kháng nhóm kháng sinh type Salmonella Typhimurium (ST) phân lập 33 Hình 3.4 Kết điện di đồ sản phẩm RNA tổng số chủng Salmonella 1,2,3: S181, S360, S384 35 Hình 3.5 Kết RT-PCR phát có mặt gen 16S (550 bp) chủng Salmonella Typhimurium S181, S360, S384 36 Hình 3.6 Kết RT-PCR phát có mặt gen tetA (494bp), sull II (434bp, avrA (192bp), aadA (228bp), blaTEM (310bp), gyrB (219bp), prmA (187bp) chủng Salmonella Typhimurium S181, S360, S384 M: thang chuẩn (DNA 1Kb) 37 Hình 3.7 Tỷ lệ biểu gen tetA, sull II, avrA, aadA, blaTEM, gyrB, prmA/16S rRNA chủng Salmonella Typhimurium phân tích phương pháp RT-PCR Gen 16S rRNA dùng để so sánh 39 MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày trở nên cấp thiết, báo cáo cho thấy phần lớn vụ ngộ độc thực phẩm vi sinh vật Đã có nhiều cảnh báo ngộ độc thực phẩm gia tăng ngày nghiêm trọng Theo số liệu thống kê Cục vệ sinh An toàn thực phẩm, Bộ Y tế, năm Việt Nam có chừng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân 100 - 200 ca tử vong Tính riêng năm 2008, có 205 vụ ngộ độc thực phẩm, với 7828 người mắc, 161 người chết, 7,8% số vụ nguyên nhân vi sinh vật gây Sáu tháng đầu năm 2014, có 67 vụ ngộ độc thực phẩm với 2048 người mắc, 24 trường hợp tử vong Có nhiều lồi vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm Clostridium butolinum, Escherichia coli, Listeria monocytogenes Trong đó, Salmonella biết đến vi khuẩn hàng đầu gây ngộ độc thực phẩm giới với triệu chứng buồn nôn, nhức đầu, sốt nhẹ, sau xuất nơn mửa tiêu chảy nhiều lần, lẫn máu Thường bệnh nhân tự khỏi, trẻ em, người già người bị suy giảm miễn dịch bệnh gây nguy hiểm đến tính mạng Mặc dù nhiễm trùng đường ruột chủng Salmonella thường tự khỏi, việc điều trị kháng sinh để ngăn chặn trình lây lan nhiễm trùng điều cần thiết Việc lạm dụng kháng sinh điều trị người động vật ảnh hưởng đến khả kháng thuốc Salmonella Các chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm kháng thuốc phân lập mối đe dọa trực tiếp đến sức khỏe người chủng kháng thuốc cản trở việc điều trị mối đe dọa gián tiếp kháng chuyển giao cho mầm bệnh khác người Do việc giám sát tính mẫn cảm kháng sinh quan trọng cần thiết 2 Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn tầm quan trọng việc bảo vệ sức khỏe người tiến hành đề tài "Xác định gen kháng thuốc chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm phân lập từ thịt tươi số địa điểm Hà Nội” Mục tiêu nghiên cứu Xác định gen kháng thuốc chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm phân lập từ thịt tươi số địa điểm Hà Nội Nội dung nghiên cứu - Xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella mẫu thịt tươi (gồm: thịt lợn, thịt gà, thịt bò) thu thập địa điểm khác địa bàn Hà Nội - Nuôi cấy, phân lập định type chủng Salmonella từ mẫu thịt, xác định chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm - Kiểm tra biểu gen kháng thuốc từ chủng Salmonella Typhymurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập Ý nghĩa khoa học đề tài Xác định gen kháng thuốc chủng vi khuẩn Salmonella gây ngộ độc thực phẩm giúp cho việc nghiên cứu kit chẩn đoán nhanh vi khuẩn Salmonella thực phẩm 3 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1.Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Salmonella 1.1.1 Tình hình nghiên cứu giới Năm 1891, Jensen phân lập Salmonella Dublin từ bệnh phẩm bê bị tiêu chảy Cũng vào năm Salmonella typhimurium phát vùng Greiswald Breslau (Đức) Vào năm 1983, Breslau xảy vụ ngộ độc thịt ăn phải thịt bò ốm, kết ngộ độc xảy người [61] Vi khuẩn Salmonella phân lập từ thịt lợn chết bệnh phó thương hàn thường gặp miền Tây nước Mỹ S choleraesuis var kunzendorf, S typhimurium S typhisuis [28] Trong vài trường hợp, lợn cịn tìm thấy S dublin S enteritidis Hai serotype S dublin S enteritidis gặp lợn theo mẹ Từ năm 1990 trở lại tỷ lệ nhiễm Salmonella Châu Âu không giảm, năm 2007 có khoảng 152.000 ca nhiễm Salmonella người phát nhiên số thực tế cao gấp 10 lần Salmonellosis bệnh nhiễm trùng đường ruột phổ biến thứ hai Hoa Kỳ Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) ước tính có triệu người nhiễm Salmonella, Mỹ năm trung bình có khoảng 20.000 ca nhập viện gần 400 trường hợp tử vong nhiễm Salmonella, theo báo cáo năm 2011 [60] Tháng 11/2013, thành phố Brisbane Queensland (Australia) xảy vụ ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng vi khuẩn Salmonella khiến phụ nữ 77 tuổi thiệt mạng 220 người nhiễm bệnh Nguyên nhân gây vụ việc vi khuẩn Salmonella có trứng, thịt gia cầm loại thịt chưa nấu chín [40] Theo thơng tin cơng bố vào 2/4/2015 tổ chức Y tế giới (WHO), cho thấy mối đe dọa từ bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm vi khuẩn gây lên Những số công bố khiến người tiêu dùng tồn giới khơng khỏi hoang mang Bao gồm 582 triệu ca mắc phải 22 bệnh truyền qua thực phẩm; 351.000 số ca tử vong liên quan đến an tồn thực phẩm có 52.000 ca tử vong vi khuẩn Salmonella gây nên, 37.000 số ca tử vong vi khuẩn E.coli, 35.000 người chết norovirus (loại virus nguyên nhân hàng đầu gây nên dịch bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm Hoa Kỳ), 40% tỷ lệ người độ tuổi mắc bệnh truyền nhiễm qua thực phẩm Điều đáng ý vi khuẩn Salmonella gia tăng khả kháng thuốc vi khuẩn Trong năm gần đây, tốc độ gia tăng tính kháng kháng sinh vi khuẩn Salmonella báo cáo nhiều nước phát triển nước phát triển (Báo cáo Bộ Y tế, 2008) Các nhà nghiên cứu Wellcome Trust lập đồ mã gen 1.832 đối tượng nhiễm khuẩn Salmonella typhimurium thu thập từ 63 quốc gia khoảng thời gian từ năm 1992 đến 2013 cho thấy gần nửa số vi khuẩn không bị tiêu diệt loại kháng sinh theo quy chuẩn Trong nghiên cứu mô tả liệu từ chương trình giám sát tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc thịt gà Brazil (PREBAF) từ thời gian tháng 9/2004 đến tháng 7/2006 cho thấy 2.679 mẫu thịt gà thu thập 15 bang thuộc khu vực địa lý đất nước có tới 8,9% (trung bình 2,7%) mẫu nhiễm Salmonella spp Trong chủ yếu nhiễm loài Enteritidis (48,8%), Infantis (7,6%), Typhimurium (7,2%) Heidelberg (6,4%), nguy hiểm chủng đa kháng thuốc xuất với tỷ lệ cao 53,2% (133 chủng/250 chủng thử nghiệm kháng thuốc) [43] Trong nghiên cứu 236 mẫu nước sơng Đài Loan, có 54 mẫu (chiếm 22,9%) nhiễm Salmonella ssp, 15 chủng Salmonella phân lập xuất số typ thường gây nhiễm trùng cho người gia súc, bao gồm Albany (27,8%), Newport (14,8%), Bareilly (13,0%), Derby (11,1%) Typhimurium (7,4%) Đặc biệt 51,9% mẫu kháng với loại kháng sinh thử nghiệm chủng vi khuẩn tồn gen kháng thuốc [43] Các nhà khoa học chứng minh gen loài vi khuẩn Salmonella gây bệnh có loạt gen liên quan đến việc ứng phó với điều kiện thiếu dưỡng chất, sức đề kháng kháng sinh, trao đổi chất sắt phản ứng sốc nhiệt [58] Một số gen hilA, prgH, invF phát có mối quan hệ lớn đến khả kháng tetracycline chủng vi khuẩn Salmonella Typhimurium DT 104 DT 193 [32] Ngoài ra, amR yếu tố phiên mã protein Rama, yếu tố đa kháng quan trọng tìm thấy vi khuẩn [72] gen kháng thuốc Salmonella Typhimurium Salmonella Newport thường đặt plasmid CMY-2 [39] Sahu (2013) phát vùng đột biến locus có khả đa kháng thuốc vi khuẩn S typhimurium [59] Hiện nay, giới tiếp tục có nghiên cứu gen kháng thuốc vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt vi khuẩn Salmonella nhằm xác định xác chế đa kháng thuốc vi khuẩn Salmonella gây ngộ độc thực phẩm 1.1.2 Tình hình nghiên cứu nước Tại Việt Nam, số nghiên cứu ô nhiễm Salmonella thực công bố Salmonella thường tìm thấy thịt gà, thịt lợn, đồ nguội, trứng sống, nghêu sò nguyên nhân 70% vụ ngộ độc Trong tổng số 1.416 mẫu thịt sản phẩm từ thịt qua kiểm tra phát tới 40,9% số mẫu nhiễm khuẩn Salmonella gây bệnh đường tiêu hóa Vi khuẩn Salmonella bệnh chúng gây cho người gia súc năm 50 Viện Parteur Sài gòn năm 19511953 phân lập chủng Salmonella người (4 chủng từ máu, chủng từ nước tiểu) Cũng Sài gòn, thời gian phân lập 35 chủng từ 360 lợn, có 23 mẫu S choleraesuis [1] 6 Lê Văn Tạo Nguyễn Thị Vui (1994) phân lập xác định serotype vi khuẩn Salmonella gây bệnh lợn, kết cho thấy: 50% chủng phân lập thuộc S Choleraesuis; 12,5% S Enteritidis; 6,25% S Typhimurium số loại lại thuộc serotype khác [18] Trần Xuân Hạnh (1995) phân lập giám định vi khuẩn Salmonella lợn Thành phố Hồ Chí Minh cho kết quả: S Typhisuis lợn bệnh 16,9%; lợn bình thường 6-16 tuần tuổi 4,2%; S Paratyphi lợn 6-16 tuần tuổi 2,8% [6] Năm 2003, Võ Thị Bích Thủy nghiên cứu tình hình nhiễm Salmonella thực phẩm Hà Nội thấy tỷ lệ nhiễm cao giò sống 46,67%, thịt bò 40%, thịt gà 39,29%, thấp thịt lợn 33,33% [25] Cũng năm này, Lê Minh Sơn xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella thịt lợn giết mổ tiêu dùng nội địa từ 10,91-16,67% thịt lợn xuất trung bình 1,42% [15] Tơ Liên Thu (2005) xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella mẫu thịt gà Hà Nội cao 33% mẫu lấy siêu thị, 40% mẫu lấy chợ [22] Tại lò mổ địa điểm quan trọng có nguy cao nhiễm Salmonella vào thân thịt sau giết mổ Trần Thị Hạnh cs (2009) công bố tỷ lệ nhiễm Salmonella sở giết mổ lợn công nghiệp cho kết quả: Chất chứa manh tràng lợn 59,18%, mẫu lau thân thịt 70%, mẫu lau hậu môn 66%, mẫu lau chuồng nhốt lợn chờ giết mổ 40%, mẫu lau sàn nhà giết mổ 28%, cịn mẫu nước kiểm tra khơng phát Salmonella Tại sở giết mổ lợn theo phương thức thủ công cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella chất chứa manh tràng lợn chờ giết mổ 87,5%, mẫu lau thân thịt 75%, mẫu lau hậu môn 55%, mẫu lau chuống nhốt lợn chờ giết mổ 70%, mẫu lau sàn giết mổ 80%, mẫu nước 50% [7] 7 Ở nước ta, chăn nuôi lợn, gia cầm thủy sản thường bổ sung nhiều loại kháng sinh với mục đích kích thích tăng trưởng, phịng bệnh điều trị, nồng độ kháng sinh tồn dư thịt thường cao gấp vài lần so với quốc gia khác Các nhà nghiên cứu Nhật Bản Việt Nam thực nghiên cứu lan tràn chủng Salmonella kháng kháng sinh thịt lợn thịt gia cầm bán lẻ miền Bắc Việt Nam Kết phát 118 mẫu dương tính với vi khuẩn Salmonella phân lập từ 283 mẫu thịt bán lẻ (135 mẫu thịt lợn, 148 mẫu thịt gà) [65] Cùng với trình nghiên cứu chi tiết vi khuẩn, biện pháp phòng bệnh nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, có vacxin phịng bệnh Nguyễn Văn Lãm (1968) tiến hành nghiên cứu chế vacxin phó thương hàn lợn từ chủng Salmonella chuẩn Trung Quốc Hiện nay, loại vacxin phịng bệnh phó thương hàn số cơng ty, xí nghiệp thuốc thú y sản xuất vacxin nhược độc chủng TS-177, vacxin có bổ trợ vacxin keo phèn hay vacxin nhũ hóa có bổ trợ dầu [8] Trong năm gần đây, Việt Nam hầu hết nghiên cứu tập trung vào tìm hiểu tính kháng kháng sinh gen kháng kháng sinh vi sinh vật gây bệnh phân lập từ mẫu bệnh phẩm động vật Các nghiên cứu gen chế kháng kháng sinh vi sinh vật gây bệnh phân lập từ thực phẩm chưa đề cập nhiều, đặc biệt nhóm vi khuẩn Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm Như vậy, việc nghiên cứu vi khuẩn Salmonella Typhimurium gây ngộ độc thực phẩm cách toàn diện để từ đề biện pháp phịng chống bệnh hiệu quả, giữ gìn vệ sinh an tồn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe người yêu cầu cần thiết 1.2 Một số đặc điểm vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Salmon Smith phát vào năm 1886 xác định Salmonella Choleraesuis nguyên nhân gây bệnh dịch tả lợn (Hog Cholera) [17] Trực khuẩn Salmonella thuộc Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae Giống Salmonella gồm hai loài: S Enterica S Bongori phân chia thành 3000 serotype theo bảng phân loại Kauffmann-White sở cấu trúc kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H đơi có kháng ngun vỏ (kháng ngun K) 1.2.1 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn Salmonella trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu trịn, có kích thước khoảng 0,4 - 0,6 x - m, khơng hình thành giáp mơ nha bào, có lơng di động (trừ Salmonella Pullorum-gallinarum) Hình 1.1 Vi khuẩn Salmonella Vi khuẩn bắt màu gram âm Vi khuẩn có kháng nguyên thân O (Ohne Hauch) kháng ngun lơng H (Hauch), có số lồi Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi, Salmonella Dublin chứa kháng nguyên Vi (là loại kháng nguyên có khả ngưng kết kháng thể O phát triển nhiều) 1.2.2 Đặc tính ni cấy Salmonella trực khuẩn vừa hiếu khí vừa yếm khí, nhiệt độ thích hợp cho phát triển 37oC, độ pH 7,2 - 7,6 Vi khuẩn có sức chịu đựng tốt điều kiện ni cấy Chúng sống sót mơi trường thạch nhiệt độ -10oC 115 ngày, sống từ 4-8 tháng thịt ướp muối với tỷ lệ 29% nhiệt độ 6-12oC Có nhiều mơi trường dinh dưỡng chọn lọc dùng phân lập Salmonella, thường dùng Brilliant Green Agar (BGA), Bismuth Sulfite Agar (BSA), Triple Sugar Ion (TSI), Xylose Lysine Deroxycholate (XLD), Mueller Kauffmann, Xylose Lysine Tetrathionate (XLT4), Modified Semisolid Rappaport Vassiliadis (MSRV), Rambach, Kligler [58] Khi nuôi cấy vi khuẩn Salmonella môi trường nước thịt: Sau vài vẩn đục, sau 18 canh trùng đục Nếu ni lâu ống nghiệm đáy có cặn, bề mặt mơi trường có màng mỏng Trên mơi trường BSA: Sau 18 nuôi cấy 37 oC, vi khuẩn Salmonella mọc lên khuẩn lạc đặc trưng, xung quanh khuẩn lạc màu nâu thẫm, vào khuẩn lạc đậm chuyển gần sang màu đen, khuẩn lạc có màu ánh kim Trên mơi trường thạch thường: Khuẩn lạc dạng S (smooth) tròn, sáng xám, nhẵn bóng, rìa gọn lồi giữa, đường kính từ 1,5mm, thấy khuẩn lạc dạng R (rough), nhám, mặt mờ Trên môi trường BGA: Vi khuẩn Salmonella thể tính kiềm, hình thành khuẩn lạc màu đỏ Trên mơi trường XLD: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu đen H2S tạo từ phản ứng điển hình vi khuẩn Salmonella Trên mơi trường TSI: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc nhạt màu, mặt nghiêng mơi trường có màu đỏ, màu hồng đáy với sản sinh H2S làm cho mơi trường có màu đen Trên mơi trường MSRV: Là mơi trường chọn lọc Salmonella có khả di động, vi khuẩn di động xung quanh mơi trường tạo thành vịng màu trắng quan sát 10 Trên mơi trường XLT4: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trung bình, màu đen, bóng, lồi Trên mơi trường Rambach: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trung bình, màu đỏ tím, bóng Trên mơi trường Kligler: Mặt nghiêng môi trường không đổi màu vi khuẩn không lên men đường lactose, phần thạch đứng môi trường đổi màu vi khuẩn lên men đường glucose làm thay đổi pH môi trường sinh H2S có màu đen 1.2.3 Đặc tính hóa sinh Khơng len men đường : lactose, sucrose, andonitol, Lên men sinh loại đường: glucose, mannitol, sorbitol, Phản ứng indol âm tính (-), urease âm tính (-), Voges - Proskauer (VP) âm tính (-), H2S dương tính (+), Metyl - Red (MR) dương tính (+) Khả trao đổi chất đặc trưng Salmonella phân hủy nitrat thành nitrit, phân hủy đường glucose sinh hơi, phân hủy H2S sử dụng citrat làm nguồn cung cấp cacbon Đặc tính sinh hóa có ý nghĩa lớn q trình phân lập giám định vi khuẩn, xét nghiệm mẫu vật xác định có mặt Salmonella cần thiết phải tiến hành phản ứng sinh hóa 1.2.4 Cấu trúc Salmonella Vi khuẩn Salmonella có loại kháng nguyên, chất xuất thể tạo kích thích đáp ứng miễn dịch kết hợp đặc hiệu với sản phẩm kích thích đó, gồm: kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H kháng nguyên vỏ K Vi khuẩn thương hàn (S Typhi) có kháng nguyên V (Virulence) yếu tố chống thực bào giúp cho vi khuẩn thương hàn phát triển bên tế bào bạch cầu * Kháng nguyên thân O (O - Antigen) Kháng nguyên thân O nằm thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc lipopolysaccharide (LPS) thành phần cấu tạo nên lớp màng ngồi ... "Xác định gen kháng thuốc chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm phân lập từ thịt tươi số địa điểm Hà Nội? ?? Mục tiêu nghiên cứu Xác định gen kháng thuốc chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm phân. ..ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ NHÃ QUYÊN XÁC ĐỊNH GEN KHÁNG THUỐC CỦA CÁC CHỦNG SALMONELLA GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ THỊT TƯƠI TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM Ở HÀ NỘI... cấy, phân lập định type chủng Salmonella từ mẫu thịt, xác định chủng Salmonella gây ngộ độc thực phẩm - Kiểm tra biểu gen kháng thuốc từ chủng Salmonella Typhymurium gây ngộ độc thực phẩm phân lập