Xác định kiểu gen của virus viêm gan b ở một số bệnh nhân nhiễm virus tại thái nguyên bằng phương pháp PCR lồng (nested PCR)​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG (NESTED - PCR) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2017 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG (NESTED - PCR) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Đắc Trung THÁI NGUYÊN - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình Mọi kết thu nguyên bản, không chỉnh sửa, chép từ nghiên cứu khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Lê Thị Thu Hà ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Đắc Trung TS Nguyễn Phú Hùng định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt suốt trình tơi tiến hành nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô Bộ môn Vi sinh, trường Đại học Y Dược - Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện cho tơi q trình tiến hành thí nghiệm nghiên cứu phịng thí nghiệm Tơi xin tỏ lịng biết ơn tới thầy cô cán Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên tận tình dạy dỗ, bảo truyền cho niềm đam mê nghiên cứu khoa học Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp nhiệt tình động viên cho tơi thêm động lực hồn thành tốt q trình học tập nghiên cứu khoa học Thái Nguyên, tháng năm 2017 Tác giả Lê Thị Thu Hà iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương bệnh viêm gan B virus viêm gan B .3 1.1.1 Lịch sử phát bệnh viêm gan B .3 1.1.2 Tình hình bệnh viêm gan B giới Việt Nam 1.1.3 Virus HBV (Hepatitis B virus) 1.2 Các kiểu gen HBV tình hình nghiên cứu kiểu gen HBV nước 13 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Vật liệu nghiên cứu 17 2.1.1 Mẫu bệnh phẩm nghiên cứu 17 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 17 2.2 Địa điểm nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 20 2.3.1 Phương pháp thu nhận xử lý mẫu bệnh phẩm 20 2.3.2 Phương pháp tách chiết HBV DNA 21 2.3.3 Định lượng DNA HBV kỹ thuật real-time PCR 21 iv 2.3.4 Xác định kiểu gen HBV kỹ thuật PCR lồng (Nested - PCR) .22 2.3.5 Điện di gel agarose đọc kết điện di 27 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Kết tách chiết HBV-DNA tổng số 28 3.2 Kết xác định kiểu gen (genotype) virus viêm gan B kỹ thuật PCR lồng (Nested – PCR) 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism ATP Adenosin triphosphat Bp Base pair CS Cộng CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide ddNTP Dideoxy Nucleotide Triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxy Nucleotide Triphosphate EDTA Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid HBV Hepatitis B virus HBcAg Hepatitis B Core Antigen HBeAg Hepatitis B Early Antigen HBsAg Hepatitis B Surface Antigen HCC Hepatocellular carcinoma IgM Immuno Globulin M Kb Kilobase KDa Kilodalton LiPA Line probe assay LMA Kết hợp kháng thể LTC Lympho T cytotoxic MHR Major Hydrophilic Region ORF Open - reading frame PCR Polymerase Chain Reaction RAPD Random Amplified Polymorphism DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RNA Ribonucleic Acid SDS Sodium Doecyl Sulphat vi SGOT Serum Glutamo-oxalo transaminase SGPT Serum Glutamo-pyruvic transaminase SSR Simple Sequence Repeats TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA Tris Trioxymetylaminometan WHO World Health Organization vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự phân bố kiểu gen HBV số tác giả nước nước khu vực 13 Bảng 2.1 Các dung dịch đệm sử dụng thí nghiệm 17 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng thí nghiệm 18 Bảng 2.3 Cặp mồi khuếch đại vùng gen S HBV 23 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR vịng ngồi 24 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt phản ứng PCR vịng ngồi 24 Bảng 2.6 Mồi sử dụng cho phản ứng PCR vịng (nhóm 1) 25 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR vịng nhóm I 25 Bảng 2.8 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR vịng (nhóm I) .25 Bảng 2.9 Mồi sử dụng cho phản ứng PCR vịng (nhóm II) 26 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng PCR vịng (nhóm II) 26 Bảng 2.11 Chu trình nhiệt phản ứng PCR vịng (nhóm II) 26 Bảng 3.1 Tỷ lệ kiểu gen HBV số bệnh nhân viêm gan B tỉnh Thái Ngun 36 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sự phân bố HBV giới Hình 1.2: Hạt virus hồn chỉnh .6 Hình 1.3: Hình ảnh hiển vi điện tử HBV Hình 1.4: Cấu trúc gen HBV tương ứng với mRNA (A) với protein (B) Hình 1.5: Gen S P gối cấu trúc genome HBV Hình 1.6: Tiểu thể nhỏ hình cầu (A) hình ống (B) HBV Hình 1.7: Chu trình nhân lên HBV tế bào gan 11 Hình 2.1: Sơ đồ bước thực trình nghiên cứu 20 Hình 2.2: Sơ đồ xác định kiểu gen HBV phản ứng nested-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu (nt, nucleotide) 22 Hình 3.1: Kết xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) bệnh nhân nhiễm HBV kỹ thuật Real-time PCR 29 Hình 3.2: Kết thơng số phản ứng Realtime-PCR thực .30 Hình 3.3: Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM mầu JOE chứng dương chứng âm 31 Hình 3.4: Tín hiệu huỳnh quang mầu FAM mầu JOE mẫu xét nghiệm dương tính 32 Hình 3.5: Kết xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) bệnh nhân Trần Văn H nhiễm HBV kỹ thuật Realtime PCR 33 Hình 3.6: Kết xét nghiệm tải lượng HBV (HBV-DNA dương tính) bệnh nhân Tơ Văn Kh nhiễm HBV kỹ thuật Realtime PCR 33 Hình 3.7: Sản phẩm PCR vịng với nhóm I (kiểu gen A, B, C) gel điện di 35 41 19 Chomczynski P, Sacchi N (1987), “Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction”, Ana Biochem 162, 156–159 20 Chu CJ, Keeffe EB, Han SH, Perrillo RP, Min AD, Soldevila-Pico C, Carey W, Brown RS Jr, Luketic VA, Terrault N, Lok AS (2003), “Hepatitis B virus genotypes in the United States: results of a nationwide study’, Gastroenterology, 125(2): p 444-51 21 Fung S.K and A.S Lok (2004), “Hepatitis B virus genotypes: they play a role in the outcome of HBV infection?”, Hepatology, 40(4): p 790792 22 Garfein R.S, Bower W.A, Loney C.M, Hutin Y.J, Xia G.L, Jawanda J (2004), “Factors associated with fulminant liver failure during an outbreak among injection drug users with acute hepatitis B”, Hepatology, v 40, p 865-873 23 Ganem D, Prince AM (2004), Hepatitis B virus infection - natural history and clinical consequences, N Engl J Med; 350:1118-1129 24 Geramizadeh B, Kaboli R, Behzad-Behbahani A, Rahsaz M, Azarpira N, Aghdai M, Aytollahi M, Yaghoobi R, Baneehashemee M (2008), “A Nested PCR Method for the Identification of Hepatitis B Virus Genotype in Paraffin Blocks of Formalin-Fixed Liver Biopsies ”, Arch Iran Med., Jul;11(4):455-8 doi: 08114/AIM.0019 25 Guirgis BSS, Abbas RO, Azzazy H.M.E (2010), “Hepatitis B virus genotyping: current methods and clinical implications”, Int J Infect Dis, 14:E941– E953 26 Holliday S.M and Faulds D (1994), ‘Hepatitis B vaccine: a pharmacoeconomic evaluation of its use in the prevention of hepatitis B virus infection”, Pharmacoeconomics, 5(2): p 141-71 27 Jing-Jing Nie, Kui-Xia Sun, Jie Li, Jie Wang, Hui Jin, Ling Wang, Feng-Min Lu, Tong Li, Ling Yan, Jing-Xian Yang, Mi-Shu Sun and Hui Zhuang (2012), “A type-specific nested PCR assay established and applied for investigation of HBV genotype and subgenotype in Chinese patients with chronic HBV infection”, Virology Journal, :121 42 28 Kirschberg O, Schüttler C, Repp R, Schaefer S (2004), “A multiplexPCR to identify hepatitis B virus enotypes A-F”, J Clin Virol, 29(1): p 39-43 29 Kreutz C (2002), “Molecular, immunological and clinical properties of mutated hepatitis B viruses”, J Cell Mol, Med, (1), 113-143 30 Liu WC, Lindh M, Buti M, Phiet PH, Mizokami M, Li HH, Sun KT, Young KC, Cheng PN, Wu IC, Chang TT (2008), “Genotyping of hepatitis B virus genotypes A to G by multiplex polymerase chain reaction”, Intervirology, 51:247–52 31 Mamun-Al Mahtab, Salimur Rahman, Mobin Khan and Fazal Karim (2008), Hepatitis B virus geneotypes: an overview, Hepatobiliary Pancreat Dis Int 32 Mayerat C, Mantegani A, Frei P.C (1999), “Does hepatitis B virus (HBV) geneotype influence the clinical outcome of HBV infection?”, J Viral Hepat, v 6, p 299-304 33 Mizokami M, Nakano T, Orito E, Tanaka Y, Sakugawa H, Mukaide M, Robertson BH (1999), “Hepatitis B virus genotype assignment using restriction fragment length polymorphism patterns”, FEBS Lett, 450(1-2): p 66-71 34 Naiel Bisharat, Mazen Elias, Raul Raz & Edith Flatau (1998), “Familial pattern of infection with hepatitis B virus among immigrating Ethiopian Jews in Israel”, Eur J Epidemiol, 14(1): p 89-91 35 Naito H, Hayashi S, and Abe K (2001), “Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers”, J Clin Microbiol, 39(1): p 362-4 36 Norio Akuta and Hiromitsu Kumada (2005), “Influence of hepatitis B virus geneotypes on the response to antiviral therapies”, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v 55, p 139 - 142 43 37 Okamoto H, Tsuda F, Sakugawa H, Sastrosoewignjo RI, Imai M, Miyakawa Y, Mayumi M (1988), “Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes”, J Gen Virol, 69 ( Pt 10): p 2575-83 38 Rodriguez-Frias F, Buti M, Jardi R, Cotrina M, Viladomiu L, Esteban R (1995), “Hepatitis B virus infection: precore mutants and its relation to viral geneotypes and core mutations”, Hepatology, v 22, p 1641-1647 39 Sánchez-Tapias J, Costa J, Mas A, Bruguera M, Rodes J (2002), “Influence of hepatitis B virus geneotype on the longterm outcome of chronic hepatitis B in western patients”, Gastroenterology, v 123, p 18481856 40 Shiina S, Fujino, Uta, Tagawa K, Unuma T, Yoneyama M (1991), “Relationship of HBeAg subtypes with HBeAg/anti-HBe status and chronic liver disease Part I: Analysis of 1744 HBeAg carriers”, Am J Gastroenterol, v 86, p 866-871 41 Song Y, Dai E, Wang J, Liu H, Zhai J, Chen C, Du Z, Guo Z, Yang R (2006), “Genotyping of hepatitis B virus (HBV) by oligonucleotides microarray”, Mol Cell Probes, 20(2): p 121-7 42 Sumi H, Yokosuka, Seki N, Arai, Imazeki, Kurihara T (2003), “Influence of hepatitis B virus geneotypes on the progression of chronic type B liver disease”, Hepatology, v 7, p 19-26 43 Tsang TK, Blei AT, O'Reilly DJ, Decker R (1986), “Clinical significance of concurrent hepatitis B surface antigen and antibody positivity”, Dig Dis Sci, 31:620 44 Veronica L Mathet and Maria L Cuestas (2009), Genetic diversity and variability of hepatitis B virus, Nova Science Publishers, Inc 45 William M, Lee (1997), “Haepatitis B virus infection”, Medical aprogress 337, v 24, p 1733-1745 44 46 World Health Organization (2001), Introduction of hepatitis B vaccine into childhood immunization services, WHO/V&B/01.31 47 World Health Organization (2002), WHO/CDS/CSRL/LYO/2002: Hepatitis B 48 Xin Ding, Hongxi Gu (2003), “Molecular epidemiology of Hepatitis virus and Geneotypic distribution Hepatitis B and C virusin Harbin China” Jpn.J.Infect.Dis, p 19-22 49 Yeh S.H, Tsai C.Y, Kao J.H, Liu C.J, Kuo T.J, Lin M.W, Huang W.L, Lu S.F, Jih J, Chen D.S, and Chen P.J (2004), “Quantification and genotyping of hepatitis B virus in a single reaction by real-time PCR and melting curve analysis”, J Hepatol, 41(4): p 659-66 C Tài liệu Website: 50 http: //uscis.gov/graphics/share/aboutus/statistics/yearbook/2002.pdf PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B ĐƯỢC XÁC ĐỊNH KIỂU GEN HBV BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG (NESTED - PCR) STT Họ tên Dương Quốc Nguyễn Việt Nguyễn Thị Thu Nguyễn Văn Đặng Văn Trần Văn Quách Thị Dương Trung Nguyễn Thị 10 Phạm Văn 11 Tô Văn 12 Chu Văn 13 Nguyễn Khương STT Họ tên 14 Nông Thị 15 Trần Trung 16 Trần Đình 17 Lị Văn 18 Nguyễn Duy 19 Hà Thị Kim 20 Nguyễn Thị Thùy 21 Phan Thị 22 Phạm thị 23 Dương Trung 24 Hoàng Thị 25 Đoàn Thị 26 Nguyễn Đình 27 Đặng Văn 28 Nguyễn Trường 29 Nguyễn Văn STT Họ tên 30 Luân Minh 31 Lê Văn 32 Dương Thị 33 Hoàng Văn 34 Ngô Văn 35 Vi Hồng 36 Nguyễn Thị 37 Nguyễn Văn 38 Nguyễn Văn 39 Đoàn Minh 40 Phạm Thị Ngọc 41 Phạm Thị 42 Phùn Thị 43 Vũ Thị 44 Nguyễn Đình 45 Dương Thị STT Họ tên 46 Nguyễn Thị 47 Phaàn Thị 48 Dương Văn 49 Trần Văn 50 Đỗ Văn 51 Trần Thị 52 Vũ Văn 53 Nguyễn Xuân 54 Đinh Văn 55 Lê Kiên 56 Bùi Văn 57 Đặng Hồng 58 Nông Văn 59 Đồng Thị 60 Nguyễn Văn 61 Trần Thế STT Họ tên 62 Ngô Thị 63 Nguyễn Thị 64 Đào Thị 65 Lê Thanh 66 Nguyễn Văn 67 Đặng Hoàng 68 Nguyễn Văn 69 Cao Thị 70 Hoàng Thị 71 Triệu Bảo 72 Nông Văn 73 Nguyễn Thị 74 Vũ Văn Phụ lục KẾT QUẢ ĐO HÀM LƯỢNG VÀ TINH SẠCH CỦA CÁC MẪU HBV-DNA SAU TÁCH CHIẾT STT 10 11 12 13 14 15 16 17 Họ tên bệnh nhân Dương Quốc Nguyễn Việt Nguyễn Thị Thu Nguyễn Văn Đặng Văn Trần Văn Quách Thị Dương Trung Nguyễn Thị Phạm Văn Tô Văn Chu Văn Nguyễn Khương Nơng Thị Trần Trung Trần Đình Lị Văn STT 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Họ tên bệnh nhân Nguyễn Duy Hà Thị Kim Nguyễn Thị Thùy Phan Thị Phạm thị Dương Trung Hoàng Thị Đồn Thị Nguyễn Đình Đặng Văn Nguyễn Trường Nguyễn Văn Ln Minh Lê Văn Dương Thị Hồng Văn Ngơ Văn Vi Hồng Nguyễn Thị Nguyễn Văn STT 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Họ tên bệnh nhân Nguyễn Văn Đoàn Minh Phạm Thị Ngọc Phạm Thị Phùn Thị Vũ Thị Nguyễn Đình Dương Thị Nguyễn Thị Phaàn Thị Dương Văn Trần Văn Đỗ Văn Trần Thị Vũ Văn Nguyễn Xuân Đinh Văn Lê Kiên Bùi Văn Đặng Hồng STT 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 Họ tên bệnh nhân Nông Văn Đồng Thị Nguyễn Văn Trần Thế Ngô Thị Nguyễn Thị Đào Thị Lê Thanh Nguyễn Văn Đặng Hoàng Nguyễn Văn Cao Thị Hồng Thị Triệu Bảo Nơng Văn Nguyễn Thị Vũ Văn ... ? ?Xác định kiểu gen virus viêm gan B số b? ??nh nhân nhiễm virus Thái Nguyên phương pháp PCR lồng (Nested - PCR) ” Mục tiêu nghiên cứu Xác định kiểu gen virus viêm gan B số b? ??nh nhân nhiễm virus viêm. .. HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC –––––––––––––––––––– LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B Ở MỘT SỐ B? ??NH NHÂN NHIỄM VIRUS TẠI THÁI NGUYÊN B? ??NG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG (NESTED. .. 3.2 Xác định kiểu gen virus viêm gan B kỹ thuật PCR lồng (Nested - PCR) Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương b? ??nh viêm gan B virus viêm gan B 1.1.1 Lịch sử phát b? ??nh viêm gan B Năm 1964 Baruch