Đồ án tốt nghiệp khảo sát ảnh hưởng của dịch chiết lên sự sinh trưởng và phát triển của lan oncidium sp in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP HCM Ngành : Cơng Nghệ Sinh Học Chuyên ngành : Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn : ThS Phan Quốc Tâm Sinh viên thực : Mai Duy Vinh MSSV: 107111227 Lớp: 07DSH02 TP Hồ Chí Minh, năm 2012 Đồ án tốt nghiệp SVTH : Mai Duy Vinh GVHD: ThS Phan Quốc Tâm Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm 1.1 Sơ lược hoa lan 1.1.1 Tình hình sản xuất hoa lan giới Việt Nam 1.1.1.1 Tình hình sản xuất hoa lan giới Hoa lan mệnh danh nữ hoàng loài hoa, thị trường tiêu thụ hoa lan rộng khắp giới, mang lại lợi nhuận kinh tế cao cho nhiều nước Thị trường tiêu thụ hoa lan khối châu Âu hấp dẫn Hình 1.1 Giàn treo lan Năm 2006 khối EU có sản lượng xuất hoa lan giới đạt 55 tỉ sản phẩm, mang lại giá trị kim ngạch xuất hoa lan 73 tỉ EUR Trong đó, Hà Lan quốc gia Châu Âu có cơng nghiệp trồng lan xuất khẩu, trồng nhà kính nên Hà Lan xuất hoa quanh năm, đồng thời đầu mối trung gian nhập hoa lan (37%) từ nước khác giới Năm 2006, Hà Lan xuất hoa lan chiếm 95% tổng sản lượng hoa lan khối EU Mặc dù khối Châu Âu có sản lượng xuất hoa lan cao so với khối khác, nhu cầu tiêu thụ lan khối EU cao nên năm 2006 sản lượng nhập hoa lan từ nước lên tới 155 tỉ sản phẩm, giá trị kinh ngạch nhập đạt gần 90 tỉ EUR (International Statistics Flowers and Plants, 2007) Hoa lan mặt hàng xuất chiến lược, mang nguồn lợi kinh tế cho nhiều Quốc gia Châu Á Thái Lan nước xuất chủ yếu hoa lan nhiệt đới, đặc biệt Dendrobium, phổ biến Dendrobium Sonia Jumbo White Ngồi cịn số lồi tiếng khác Aranda, Mokara, Oncidium Vanda Hơn 80% Dendrobium thị trường giới từ Thái Lan Chỉ với loại hoa lan chủ lực Dendrobium, Thái Lan đạt doanh thu năm gần 600 triệu USD từ giá trị xuất loại hoa SVTH : Mai Duy Vinh Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm Giá trị xuất năm 2000 khoảng 1.765 triệu baht Dendrobium chọn sản phẩm vơ địch sản phẩm xuất liên tục năm Hiện tại, Thái Lan nước đứng đầu giới hoa lan Nó trở thành niềm kiêu hãnh người trồng hoa lan Thái Lan Hiện Thái Lan có khoảng 24 triệu m2 trang trại trồng hoa lan Đài loan nước đứng đầu giới sản xuất xuất hoa lan Hồ Điệp qui trình cơng nghệ cao, giá trị doanh thu từ xuất loại hoa hàng năm khoảng 43 triệu USD Trên thị trường giới, sản phẩm chủ yếu hoa lan Hồ Điệp hoa chậu, sản phẩm có giá trị kinh tế cao gấp nhiều lần so với hoa Hồ Điệp cắt cành Hàng năm, Đài Loan sản xuất 36 triệu Phalaenopsis Trong đó, 12 triệu hoa lan xuất nước như: triệu đến Nhật Bản, triệu đến Trung Quốc, 2,5 triệu tới Hoa Kì 3,5 triệu cho quốc gia khác Trong tháng năm 2004, Hoa Kì cung cấp giấy phép xuất Phalaenopsis cho Đài Loan thị trường Hoa Kì 1.1.1.2 Tình hình sản xuất hoa lan Việt Nam Diện tích trồng hoa Việt Nam 2500 hoa lan chiếm – % Nước ta bắt đầu sản xuất thương mại hoa lan tập trung khoảng năm trở lại tốc độ phát triển nhanh Chỉ riêng Tp.HCM diện tích vườn lan lên tới 80 ha, hoa lan mang lại thu nhập cao cho nhiều nông dân Tuy nhiên, giống nước không đủ cung cấp cho sản xuất, nhà vườn nhập giống ạt từ nước Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc (Báo cáo điều tra thống kê Sở NN&PTNT Tp.HCM, 2008) Theo thống kê Sở NN & PTNT Tp.HCM năm 2003 doanh số kinh doanh hoa lan kiểng đạt 200 - 300 tỉ đồng đến năm 2005 tăng đến 600 - 700 tỉ đồng Theo TS Dương Hoa Xô – Trung tâm Cơng nghệ sinh học, đến hồn thiện quy trình nhân giống in vitro cho nhóm giống hoa lan, có khả cung cấp 200.000 hoa lan ni cấy mơ thuộc nhóm Mokara, Dendrobium, SVTH : Mai Duy Vinh Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm Phaleanopsis, Catlleya Năm 2007, cung cấp cho nhà vườn khoảng 50.000 hoa lan nuôi cấy mô loại Năm 2008, sản xuất 100.000 giống hoa lan cấy mô, tập trung cho nhóm hoa lan cắt cành Mokara, Dendrobium số giống lan rừng quý Đến 2009, chiếm lĩnh thị trường hoa Tết loại hoa cao cấp tiểu quỳnh, lily, tulip, địa lan, hồ điệp… nhân giống công nghệ in vitro Hiện nay, nhiều loại hoa sản xuất phương pháp nuôi cấy mô Việt Nam, lan Dendrobium, phalaenopsis, vanda, catlleya, Oncidium, vạn thọ Pháp, cúc Đài Loan, hoa salem, cẩm chướng, hoàng thảo, hoa đồng tiền nhập nội (các giống Tamara, Banesa, Caliente…) Thị trường tiêu thụ hoa nước ngày mở rộng, năm tiêu thụ hàng triệu hoa loại, riêng hoa lan gần triệu Đặc biệt Đà Lạt nơi sản xuất hoa lan sớm nước với nguồn giống phong phú săn tìm rừng sâu Lâm Đồng dẫn đầu nước nguồn lợi lan rừng với 101 chi 396 loài, chiếm 55,3 % chi 76,5 % loài lan rừng Việt Nam Khơng lồi lan phát lần giới mang tên Đà Lạt, 10/12 loài lan quý Việt Nam phân bố vùng rừng Lâm Đồng Những năm sau 1980, Đà Lạt xuất số lượng lớn cành hoa sang nước Đông Âu Những năm gần đây, ngành sản xuất hoa lan Đà Lạt hồi sinh phát triển mạnh mẽ nhờ ứng dụng kĩ thuật công nghệ cao sản xuất Với công nghệ đại, giúp làm giảm chi phí trồng từ 40.000 - 70.00 đồng/gốc lan trước đây, xuống 4.000 - 7.000 đồng/gốc Sử dụng công nghệ nuôi cấy mô, đặc biệt phương pháp gây vết thương kết hợp nuôi cấy lỏng PGS.TS Dương Tấn Nhựt cộng Viện Sinh học Tây Nguyên nhân giống thành công Hồng hài - loài lan hài giới có hương thơm, Tổ chức Bảo vệ động thực vật hoang dã giới đưa vào danh mục thực vật cần bảo vệ phân bố hẹp Việt Nam, khó sống, khó sinh sản Theo PGS TS.Dương Tấn Nhựt, thành phố Đà Lạt cỗ máy điều hòa khổng lồ cho phép sản xuất địa lan tự nhiên theo hướng cơng nghiệp với chi phí sản SVTH : Mai Duy Vinh Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm xuất 1/10 so với quốc gia phải trồng lan nhà kính, có hệ thống điều hịa nhiệt độ Lan Đà Lạt mở rộng thị trường nhiều châu lục, có thị trường khó tính Mĩ, Nhật Bản, Đài Loan… Nhiều doanh nghiệp nước tiến hành khảo sát lập trang trại sản xuất hoa lan quy mô lớn tiềm năng, triển vọng đầu tư Đà Lạt lớn so với Trung Quốc nước ASEAN khác 1.1.2 Sơ lược lan Oncidium Lan Vũ Nữ (Oncidium) loại lan gồm khoảng chừng 600 giống phân bố rộng rãi Nam Mỹ, với hình dạng màu sắc hoa đẹp đa dạng Loại lan có củ bẹ to nhỏ, phía có Hình 1.2 Lan vũ nữ đỏ Tùy theo giống, có lồi có dầy cứng, có lồi dài mềm Dị hoa có lồi dài Onc falcipetalum, Onc carthagenense, Onc divaricatum v.v… có dị hoa ngắn Onc cheirophorum Mỗi dò mang từ 30 đến 100 hoa có nhiều giống hoa lớn đến 4-5 cm Oncidium giống Lan thích nghi với biên độ sinh thái rộng, nhiệt độ thích hợp từ 20 – 25 oC 1.1.2.1 Phân loại Vị trí phân loại: Lan Oncidium thuộc: Giới : Phantae (Thực vật) Ngành : Angiospermatophyta (Hạt kín) Lớp : Monodicotyledonae (cây mầm) Bộ : Asparagales Họ : Orchidaceae SVTH : Mai Duy Vinh Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm Chi : Oncidium Loài : Oncidium sp 1.1.2.2 Đặc điểm hình thái lan Oncidium Oncidium có khoảng 750 lồi phân bố rộng rãi nên đặc điểm hình thái đa dạng, với phân bố rộng rãi nên hoa loài lan thuộc giống Oncidium thường có nhiều màu sắc khác * Rễ Lan Sự đa dạng hình thái cấu trúc rễ làm cho Oncidium phù hợp với nhiều điều kiện sống: rễ mảnh mai, thân rễ bò dài hay ngắn sống đất Hình 1.3 Oncidium Red Thơng thường rễ thường mọc nách cuối đâm sâu xuống đất hay giá thể Một vài loài Oncidium: Oncidium sphacelatum rễ mọc thành đám rối dày đặc * Thân lan Oncidium thuộc nhóm đa thân (cịn gọi nhóm hợp trục) Thân lan ngắn hay kéo dài, đơi phân nhánh, mang Ở nhóm đa thân vừa có thân vừa có giả hành Giả hành nơi dự trữ chất dinh dưỡng nước để nuôi * Giả hành Giả hành đoạn phình, bên có mơ mềm chứa dịch nhày làm giảm nước dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cấy điều kiện khô SVTH : Mai Duy Vinh Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm hạn sống bám cao Ngồi giả hành cịn chứa diệp lục tố nên quang hợp được, giả hành có nhiều hình dạng như: hình cầu, thn dài, hình trụ xếp chồng lên * Lá Hình dạng cấu trúc da dạng, có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng, dạng mềm mại, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy thuộc vị trí sống Các mọc song song ơm lấy thân giả * Hoa Hoa có vịng bao quanh ba mảnh bao gồm ba cánh đài ba cánh tràng Ba cánh đài thường có dạng ba cánh hoa giống hay cánh đài lưng dài cánh đài bên Các cánh đài dựng đứng hay trải Ba cánh tràng có hai cánh bên giống với cánh đài, rời hay dính với cánh đài bên, cánh tràng cịn gọi cánh mơi, có màu sắc biến đổi sặc sỡ, hấp dẫn côn trùng giúp hoa thụ phấn Sự đa dạng màu sắc hình dạng có đóng góp cánh mơi lớn Cánh mơi có dạng ngun chia thuỳ, khía răng, có tua viền hay chia thành sợi mảnh Những bơng hoa giống Oncidium có sắc thái màu vàng với đốm nâu, dài Các cánh hoa thường xù cạnh, môi Môi lớn, phần ngăn chặn cánh hoa đài hoa nhỏ Một số hoa lan Oncidium dài: Oncidum altissimum Oncidium baueri phát triển lên tầm cao m, sarcodes Oncidum đạt tới m * Trái Họ Orchidaceae có thuộc loại nang Khi hạt chín, nang bung cịn đính lại với đỉnh gốc Ở số lồi, chín khơng nứt nên hạt khỏi vỏ bị mục nát SVTH : Mai Duy Vinh Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm * Hạt Một chứa từ 10.000 đến 100.000 hạt Đôi đến triệu hạt nên hạt có kích thước nhỏ (trước phong lan xem họ tử vi – microspermeae) nên phơi hạt chưa phân hố Sau - 12 tháng, hạt chín phát tán nhờ gió Khi gặp nấm cộng sinh tương thích điều kiện phù hợp, hạt nảy mầm 1.1.3 Đặc điểm sinh thái lan Oncidium 1.1.3.1 Ánh sáng Oncidium loài ưa ánh sáng không chịu ánh sáng trực tiếp, giống trồng ánh đèn Những giống to dày cần nhiều ánh sáng giống nhỏ mềm Cường độ ánh sáng khoảng 50% Ánh sáng yếu phát triển tốt thân, xanh đẹp, nhiên cho hoa Để hoa tốt cần 70% ánh sáng 1.1.3.2 Nhiệt độ Về nhiệt độ phát triển tốt nhiệt độ 15 – 35oC khoảng nhiệt độ trung bình ấm, giảm nhiệt độ xuống 15oC vài không chết kéo dài không hoa, nhiệt độ tăng cao cần tăng độ ẩm tích cực thơng thống gió 1.1.3.3 Ẩm độ Cần ẩm độ trung bình 50 - 70% Oncidium cần ẩm độ cao, đặc biệt thời kỳ tăng suốt mùa sinh trưởng cần tưới lần/ngày vào mùa khô, lần/ngày mùa mưa Mùa nghỉ (sau trổ hoa) cần tưới nước cho lần/ngày để trì sống SVTH : Mai Duy Vinh Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm 1.1.3.4 pH môi trường Độ PH mơi trường thích hợp cho mơ phát triển, khoảng 4,8 - 5,5, thông thường biên độ pH khoảng - 5,2 tốt 1.1.3.5 Nước Nước quan trọng cho để tăng trưởng Nếu thiếu nước không phát triển bị chết khơ Nhìn thấy thân hay bị nhăn nheo, thiếu nước Còn nhiều nước bị úng, thối rễ, điều kiện tốt cho vi khuẩn, nấm xâm nhập làm chết Nước giúp trì độ ẩm giai đoạn tăng trưởng Nếu giữ khô lần tưới nước sau giai đoạn tăng trưởng làm cứng cáp Chế độ nước tưới cần cung cấp cho khoảng - ngày tưới lần tùy thuộc vào điều kiện thời tiết ngày, mùa năm Vào mùa đông trời rét cần giảm số lần tưới nước, nước tưới cần phải tránh nguồn nước ô nhiễm làm chết 1.1.3.6 Giá thể Giá thể dùng trồng lan phải xốp, thống khí khơng giữ nước q lâu Có thể sử dụng loại giá thể hoăc trộn giá thể với vỏ khô, đá núi lửa, xơ dừa đá Để trồng lan Oncidium cần ẩm thoát nước tốt than xơ dừa 1.1.3.7 Phân bón Trong q trình chăm sóc hoa cần bón phân cho hoa với loại phân bón chủ yếu là: phân 20-20-20 phân 30-10-10 phun số loại phân bón hay chất kích thích sinh trưởng để điều khiển hoa Vì có giả hành có khả dự trữ dinh dưỡng để ni Có thể bón phân tuần lần, cần tăng cường phân Kali SVTH : Mai Duy Vinh Trang Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm 1.1.3.8 Phòng trừ sâu bệnh hại Sâu bệnh hại chủ yếu nhóm lan vũ nữ: - Ốc: Phịng trừ cách sử dụng Deadline 40 (nồng độ theo khuyến cáo), Dioto - Bệnh thối mềm vi khuẩn: vi khuẩn Pseudomonas gladioli gây Vết bệnh có hình dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thường lan rộng theo chiều rộng Gặp thời tiết ẩm ướt mô bệnh bị thối úng, thời tiết khô hanh mơ bệnh khơ tóp có màu trắng xám, sử dụng hỗn hợp: Saipan + Mexyl.MZ, Saipan + Alpine, Mexyl.MZ + Alpine Tóm lại: Việc ni trồng chăm sóc hoa lan khơng thể bỏ qua giai đoạn thay chậu thường thay chậu vào mùa xuân non mọc khoảng gang tay giai đoạn thay chậu tốt nhất, dùng vỏ loại nhỏ cho giống có rễ nhỏ giống có rễ lớn dùng vỏ loại trung bình, nén chặt vỏ vào chậu trồng cho đứng thẳng, vững giữ độ ẩm cao ngừng tưới nước đến rễ, số loài cứng, dầy Oncidium mule ears hay Oncidium amplitum…vv buộc chặt chúng vào vỏ thân cây, sau thời gian chúng bám vào thân hút chất dinh dưỡng từ Đối với lồi lan vũ nữ hoa nở vào tất mùa năm, chúng ưa bóng mát nên tránh để ngồi trời Cơng việc tưới phân tưới nước phải tiến hành vào buổi sáng sớm chiều mát nên tưới nước trước khoảng 15 phút sau tưới phân để hấp thụ tốt Tưới liều lượng không chết rụng SVTH : Mai Duy Vinh Trang 10 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm 1.2 Nhân giống vơ tính in vitro 1.2.1 Khái niệm Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô thuật ngữ mô tả phương pháp nuôi cấy phận thực vật ống nghiệm có chứa mơi trường dinh dưỡng điều kiện vô trùng (Dương Công Kiên, 2003) Môi trường có chứa chất dinh dưỡng thích hợp muối khoáng, vitamin, hormone tăng trưởng đường Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh chồi quan (sự phát sinh quan) từ mô như: lá, thân, hoa rễ Trước người ta thường dùng phương pháp nuôi cấy tế bào mô thực vật để nghiên cứu đặc tính tế bào phân chia, di truyền tác dụng hóa chất tế bào mơ q trình ni cấy (Dương Cơng Kiên, 2003) Ngày phương pháp nuôi cấy mô thực vật hướng ứng dụng thực tiễn, liên hệ mật thiết với giống trồng 1.2.2 Lịch sử Những mốc lịch sử phát triển công nghệ tế bào thực vật: - 1665, Robert Hooke quan sát tế bào sống kính hiển vi đưa khái niệm tế bào - 1838, Matthias Schleiden Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế bào - 1902, Haberlandt lần đầu thí nghiệm ni cấy mô mầm ống nghiệm khơng thành cơng - 1922, Kotte (học trị Haberlandt) Robbins thành cơng việc lặp lại thí nghiệm Haberlandt - 1926, FW Went chứng minh bao mầm lúa mạch có mặt chất sinh trưởng - 1934, White thành công nuôi cấy mô rễ cà chua thời gian dài Kogl F cộng xác định loại hormone thực vật IAA - 1939, Gautheret, Nobecourt White lần nuôi cấy mô sẹo thành công thời gian dài từ mô thượng tầng cà rốt thuốc SVTH : Mai Duy Vinh Trang 11 Đồ án tốt nghiệp - GVHD: ThS Phan Quốc Tâm 1940, Gautheret nghiên cứu hình thành chồi bất định nuôi cấy mô tế bào thượng tầng Ulmus - 1941, Overbeek cộng sử dụng nước dừa nuôi cấy phôi non cà rốt Sau chiến tranh giới thứ hai, lĩnh vực phát triển nhanh nhiều kết nghiên cứu quan trọng nông nghiệp công bố 1.2.3.Ưu điểm hạn chế vi nhân giống 1.2.3.1 Ưu điểm - Nâng cao chất lượng giống: loại trừ virus, nấm Cây giống bệnh tạo thường tăng suất 15 - 30% so với giống gốc - Đưa sản phẩm nhanh hơn: từ ưu việt tạo quần thể có độ đồng cao với số lượng không hạn chế, phục vụ sản xuất thương mại, dù dị hợp mặt di truyền - Có khả tái sinh từ vùng mô quan khác trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, chồi phát hoa… mà tự nhiên thực - Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao, sản xuất số lượng lớn giống thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu cho người trồng thương mại Từ vịng - năm tạo thành hàng triệu - Sản phẩm đồng nhất: vi nhân giống công nghệ nhân dịng Nó tạo quần thể có độ cao dù xuất phát từ mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp - Tạo dịng tồn (cây chà là) hay toàn đực (cây măng tây) theo mong muốn - Tiết kiệm thời gian: mật độ tạo đơn vị diện tích lớn nhiều so với sản xuất đồng ruộng nhà kính theo phương pháp truyền thống - Dễ dàng vận chuyển SVTH : Mai Duy Vinh Trang 12 Đồ án tốt nghiệp - GVHD: ThS Phan Quốc Tâm Sản xuất quanh năm chủ động kiểm sốt yếu tố ngoại cảnh, khơng phụ thuộc mùa vụ Vì nhân giống xem cơng cụ tối ưu phục vụ cho công nghệ di truyền Giảm nhiều cơng sức chăm sóc, nguồn mẫu dự trữ lâu dài chiếm khơng gian so với phương pháp nhân giống truyền thống 1.2.3.2 Hạn chế - Hạn chế chủng loại sản phẩm: nhiều loại trồng có giá trị kinh tế quý chưa nhân nhanh - Chi phí sản xuất cao, địi hỏi trình độ khoa học kĩ thuật cao, chi phí cho công nhân thường chiếm khoảng 60% cao tổng giá trị toàn sản phẩm - Giá thành cao, cao so với phương pháp truyền thống chiết, ghép, nhân giống hạt… nên thường khó áp dụng để thương mại hóa - Hiện tượng biến đổi kiểu hình: tượng biến dị tế bào soma Tỉ lệ biến dị thường thấp giai đoạn đầu nhân giống, sau có chiều hướng tăng lên nuôi cấy kéo dài tăng hàm lượng chất kích thích sinh trưởng - Q trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan cần khoảng thời gian dài trước thích ứng trồng vườn ươm 1.2.4 Các bước kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng - Tạo thể nhân giống in vitro - Nhân giống in vitro - Tái sinh thành hoàn chỉnh in vitro - Chuyển vườn ươm để hóa - Nhân giống in vitro - Tạo bầu đất - Đưa đồng ruộng - Chọn lọc đầu dòng SVTH : Mai Duy Vinh Trang 13 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm ♦ Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Hình 1.4 Sơ đồ lát cắt dọc đỉnh sinh trưởng chồi lan Mẫu ni cấy thường cịn giai đoạn non, q trình phân chia phân hóa mạnh Đỉnh sinh trưởng chồi bên sử dụng hầu hết loại trồng Ngoài ra, chồi đỉnh chồi non hạt nảy mầm sử dụng Đỉnh sinh trưởng nhỏ tách kính lúp Môi trường sử dụng rộng rãi nhân giống môi trường MS Đối với mẫu dễ bị hóa nâu mơi trường thường bổ sung than hoạt tính hay ngâm mẫu với hỗn hợp ascorbic acid citric acid (25 - 150 mg/l) ♦ Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu nuôi cấy cấy mơi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi (multiple shoot) thể cắt (cutting) đốt ngồi cịn giị (protocorm) Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngồi tự nhiên trồng Tuy nhiên có trồng khơng có khả nhân giống người ta thường nhân giống cách tạo cụm chồi mô sẹo Để tạo thể nhân giống môi trường thường bổ sung Cytokinin, Auxin, GA3 chất hữu khác ♦ Nhân giống in vitro Là giai đoạn quan trọng việc nhân giống trồng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu SVTH : Mai Duy Vinh Trang 14 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm nuôi cấy thể chồi, nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với q trình ni cấy kéo dài Điều kiện ni cấy thích hợp giúp cho q trình tăng sinh nhanh chóng Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ trì thời gian vơ hạn ♦ Tái sinh hồn chỉnh in vitro Đây giai đoạn tạo hồn chỉnh có đầy đủ thân rễ chuẩn bị chuyển vườn ươm Cây phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống ngồi mơi trường bên ngồi Các chất có tác dụng tạo chồi loại bỏ thay vào chất kích thích q trình tạo rễ Điều kiện ni cấy tương tự với q trình ni cấy ngồi tự nhiên, bước hóa trước tách khỏi điều kiện in vitro Thường dung chất thuộc nhóm auxin kích thích rễ ♦ Chuyển in vitro vườn ươm Đây giai đoạn khó khăn trình nhân giống vơ tính Cây in vitro ni cấy điều kiện ổn định dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ Khi chuyển đất với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn, dễ bị nước, mau bị héo Để tránh tình trạng này, vườn ươm nuôi cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ khơng khí mát, độ ẩm cao… Cây thường cấy luống ươm có chất dễ thoát nước, tơi xốp giữ ẩm Trong ngày đầu cần phủ nilon để giảm trình nước Rễ tạo q trình ni cấy mơ dần lụi rễ xuất Cây thường xử lý với chất kích thích rễ cách ngâm hay phun lên để rút ngắn thời gian rễ ♦ Nhân giống in vitro Cây sau chuyển luống ươm hay cấy vào bầu đất sau - 10 ngày bắt đầu rễ Sau phun dinh dưỡng với hỗn hợp N, P, K (1g/l cho loại) Tuy nhiên trình nhân giống in vitro có nhiều tốn sử dụng mẹ tiếp tục nhân giống luống ươm Điều kiện nhân giống luống ươm phải tiếp tục đảm bảo mẹ trạng thái cách điều kiện khống chế cách giảm dinh dưỡng, trì độ ẩm cao, nhiệt độ khơng khí thấp… Hệ số nhân giống luống ươm phải tiếp tục đảm bảo mẹ trạng SVTH : Mai Duy Vinh Trang 15 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm thái cân bằng, khống chế cách giảm dinh dưỡng, trì độ ẩm cao, nhiệt độ khơng khí thấp… Hệ số nhân giống luống ươm cao giúp cho việc giảm giá thành có ý nghĩa ♦ Cây bầu đất Cây từ ống nghiệm hay nhân giống luống ươm cấy luống đất 15 - 20 ngày cho rễ phát triển khỏe, sau cấy vào bầu đất (cây chuối) Bầu đất có chất xốp đầy đủ chất dinh dưỡng tỉ lệ đất/phân 1/1, hàng tuần phun dinh dưỡng khoáng - lần/tuần thường dùng phân khống có tỉ lệ N - P - K: 20-20-20 Thời gian giai đoạn bầu đất phụ thuộc đặc điểm trồng khoảng 20 ngày (khoai tây) đến 2,5 tháng (cây chuối) Cây bầu đất đặt nơi có nhiều ánh sáng, độ ẩm cao, nhiệt độ khơng khí mát để phát triển nhanh khỏe ♦ Chọn lọc đầu dòng Là vấn đề quan trọng ăn trái nhằm tạo quần thể đồng có suất cao ổn định Những chọn đầu dòng đưa vào nhân giống trở lại nuôi cấy mô Hiện công nghiệp nhân giống ứng dụng nhiều kinh tế để giải nhu cầu giống cho sản xuất, giống cho lâm nghiệp, trồng rừng, rau, ngũ cốc, ăn trái, hoa dược liệu 1.2.5 Các phương pháp nhân giống in vitro - Gieo hạt in vitro - Nhân giống chồi nách - Nhân giống chồi đỉnh - Nhân giống chồi bất định - Nhân giống qua nuôi cấy mô sẹo - Nhân giống đoạn giả hành - Nuôi cấy bao phấn hạt phấn - Nuôi cấy tế bào trần (protoplast) SVTH : Mai Duy Vinh Trang 16 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm 1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mô thực vật 1.2.6.1 Ảnh hưởng mẫu cấy - Kiểu di truyền - Tuổi - Tuổi mơ quan - Tình trạng sinh lí - Vị trí mẫu cấy - Kích thước mẫu cấy - Vết thương - Phương pháp cấy Không có hướng dẫn cụ thể việc chọn mơ cấy Về ngun tắc, trừ mơ cấy hóa gỗ, mơ khác thể thực vật làm mơ cấy Tuy nhiên, nhận xét chung mô phát triển, thịt non, non, cuống hoa, đế hoa, mô phân sinh đặt vào mơi trường có chứa lượng chất sinh trưởng thích hợp có khả phân chia phân hóa Để bắt đầu nghiên cứu nhân giống vơ tính định, trước tiên phải ý đến chồi nách mô phân sinh Tuy mang lượng thông tin di truyền nhau, mơ khác sinh trưởng phát triển với khả tái sinh chồi, rễ hay hồn chỉnh khác Vì vậy, khởi chọn giống, nhân giống cụ thể phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, trước hết cần thí nghiệm tìm hiểu phản ứng phận khác nuôi cấy nồng độ chất sinh trưởng khác Sau cấy, mô cấy cần đặt điều kiện nhiệt độ ánh sáng ổn định Tùy vào mục đích nghiên cứu mà có chế độ chiếu sáng khác nhau, chẳng hạn trình tạo callus cần bóng tối chiếu sáng q trình tái sinh nhân giống vơ tính thiết cần ánh sáng Nhiệt độ phịng ni nên giữ ổn định máy điều hòa nhiệt độ Cường độ chiếu sáng khoảng 2000 - 3000 lux SVTH : Mai Duy Vinh Trang 17 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm ♦ Một số điểm cần lưu ý - Các dụng cụ dùng cho thí nghiệm ni cấy mô sau tiệt trùng nồi khử trùng phải tiệt trùng sau lần dùng đến cách nhúng vào cồn 90o hơ lửa đèn cồn - Trước cấy, phải vệ sinh toàn khu vực cấy cồn 70o - Nên để số mẫu cấy đĩa petri từ - mẫu, tránh để nhiều không kịp cấy bị khô - Cồn dùng để đốt dụng cụ phải thay sau đợt cấy 1.2.6.2 Ảnh hưởng môi trường Khi bắt đầu nuôi cấy mô tế bào số đối tượng định, vấn đề đặt chọn môi trường sở để phối hợp tỉ lệ chất dinh dưỡng Cách thường làm qua tài liệu xuất bản, xem tác giả nuôi cấy mô đối tượng đối tượng gần gũi mặt phân loại dùng mơi trường Bước đầu giữ ngun mơi trường tác giả sở mà cải tiến cho phù hợp Trong hàng trăm môi trường nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại khác nhau, nhiều mục đích khác nhau, chia làm loại: - Môi trường nghèo dinh dưỡng: Môi trường White, Knop, Knudson C - Mơi trường trung bình: Mơi trường B5 Gamborg - Môi trường giàu dinh dưỡng: Môi trường Murashige Linsmaier - Skoog Vì vậy, bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô số đối tượng mới, chưa có tài liệu trước nên thăm dị so sánh ba loại môi trường xem đối tượng nghiên cứu thích hợp với mơi trường Hiện nay, mơi trường MS coi mơi trường thích hợp với nhiều loại Vì vậy, người bắt đầu nuôi cấy thường bắt đầu với môi trường trước tìm mơi trường riêng SVTH : Mai Duy Vinh Trang 18 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm 1.2.6.3 Đảm bảo điều kiện vô trùng ♦ Vô trùng mô nuôi cấy Mô nuôi cấy hầu hết phận khác thực vật hạt giống, phơi, nỗn sào, đế hoa, lá, đỉnh sinh trưởng, đầu rễ, thân củ… Tùy theo tiếp xúc với điều kiện bên ngoài, phận chứa hay nhiều vi khuẩn nấm Hầu vô trùng mô nuôi cấy nấm khuẩn nằm sâu tế bào bên không hạn chế bề mặt Phương thức vô trùng mô nuôi cấy thông dụng dùng hóa chất có hoạt tính diệt nấm khuẩn Hiệu lực diệt nấm khuẩn chất phụ thuộc vào thời gian xử lí, nồng độ khả xâm nhập chúng vào kẻ ngách lồi lõm bề mặt mô nuôi cấy, khả đẩy hết bọt khí bám bề mặt mơ ni cấy Để tăng tính linh động khả xâm nhập chất diệt khuẩn, thông thường người ta xử lí mơ ni cấy vịng 30 giây cồn 70o sau xử lí dung dịch diệt khuẩn Các chất kháng sinh thực tế sử dụng tác dụng khơng triệt để có ảnh hưởng xấu lên sinh trưởng mơ cấy Trong thời gian xử lí, mơ cấy phải ngập hoàn toàn dung dịch diệt khuẩn Đối với phận thực vật có nhiều bụi đất, trước xử lí nên rửa kĩ xà phịng dịng nước chảy Khi xử lí xong, mơ cấy rửa nhiều lần nước cất vô trùng (3 - lần) Những phần mô cấy bị tác nhân vô trùng làm cho trắng cần phải cắt bỏ trước đặt mô cấy lên môi trường Để tránh ảnh hưởng trực tiếp tác nhân vô trùng lên mô cấy, nên ý để lại lớp bọc ngồi ngâm mơ vào dung dịch diệt khuẩn Lớp cuối cắt bỏ bóc trước đặt mơ cấy lên mơi trường Vơ trùng mơ cấy thao tác khó, thành công lần đầu Tuy nhiên kiên trì tìm nồng độ thời gian vơ trùng thích hợp sau vài lần thử, đạt kết SVTH : Mai Duy Vinh Trang 19 ... tháng, hạt chín phát tán nhờ gió Khi gặp nấm cộng sinh tương thích điều kiện phù hợp, hạt nảy mầm 1.1.3 Đặc điểm sinh thái lan Oncidium 1.1.3.1 Ánh sáng Oncidium lồi ưa ánh sáng khơng chịu ánh... Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng - Tạo thể nhân giống in vitro - Nhân giống in vitro - Tái sinh thành hoàn chỉnh in vitro - Chuyển vườn ươm để hóa - Nhân giống in vitro - Tạo bầu đất - Đưa đồng ruộng -... Chọn lọc đầu dòng SVTH : Mai Duy Vinh Trang 13 Đồ án tốt nghiệp GVHD: ThS Phan Quốc Tâm ♦ Ni cấy đỉnh sinh trưởng Hình 1.4 Sơ đồ lát cắt dọc đỉnh sinh trưởng chồi lan Mẫu nuôi cấy thường cịn giai