ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY BÁN RẮN LÊN SỰ HÌNH THÀNH BÀO TỬ Metarhizium anisopliae Ngành Công nghệ sinh học Chuyên ngành Công nghệ sinh học Người hướng dẫn ThS NGUY[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY BÁN RẮN LÊN SỰ HÌNH THÀNH BÀO TỬ Metarhizium anisopliae Ngành : Công nghệ sinh học Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Người hướng dẫn : ThS NGUYỄN NHƯ NHỨT KS NGUYỄN QUỐC LINH Sinh viên thực : NGUYỄN DIỄM PHÚC MSSV: 1211100159 Lớp: 12DSH01 TP Hồ Chí Minh, 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi hướng dẫn khoa học ThS Nguyễn Như Nhứt KS Nguyễn Quốc Linh Các nội dung nghiên cứu, kết đề tài trung thực chưa cơng bố hình thức trước Những số liệu bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá tác giả thu thập từ nguồn khác có ghi rõ phần tài liệu tham khảo Ngoài ra, đồ án sử dụng số nhận xét, đánh số liệu tác giả khác, quan tổ chức khác có trích dẫn thích nguồn gốc Nếu phát có gian lận Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm nội dung đồ án TP Hồ Chí Minh, ngày 18 tháng 08 năm 2016 Sinh viên thực tập NGUYỄN DIỄM PHÚC LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập trường Đại học Cơng Nghệ TP.HCM, quan tâm giúp đỡ tận tình quý thầy khơng quản cơng lao khó nhọc trang bị kiến thức cần thiết cho chúng em, tạo điều kiện cho chúng em có hội áp dụng kiến thức vào thực tiễn thơng qua đợt thực tập Tuy thời gian thực tập ngắn ngủi trang bị cho em nhiều kiến thức thực tiễn bổ ích cho cơng việc sau Em xin chân thành biết ơn: - Ban giám hiệu toàn thể giáo viên giảng dạy trường Đại học Cơng Nghệ TP HCM nói chung thầy khoa Cơng nghệ sinh học nói riêng cho em có hội thực tập - Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn đến ThS Nguyễn Như Nhứt, người tạo điều kiện, hướng dẫn giúp em hồn thành tốt đồ án - Em xin cảm ơn anh Nguyễn Quốc Linh hướng dẫn hỗ trợ em hoàn thành đồ án Em xin tri ân giúp đỡ tận tình của: - Các anh, chị phịng thí nghiệm Chi nhánh Cơng ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương tồn thể anh, chị phịng ban Cơng ty tạo điều kiện hướng dẫn giúp đỡ em suốt thời gian thực tập để hoàn thành luận văn Sinh viên thực tập NGUYỄN DIỄM PHÚC Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BIỂU ĐỒ vi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Tình hình nghiên cứu Mục đích nghiên cứu .4 Nhiệm vụ nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu .5 Các kết đạt đề tài Kết cấu ĐATN Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược Metarhizium anisopliae .6 1.1.1 Phân loại .6 1.1.2 Phân bố 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Đặc điểm sinh học 1.1.5 Khả gây hại chế tác động nấm lên côn trùng .16 1.1.6 Ảnh hưởng Metarhizium anisopliae đến người môi trường 20 1.1.7 Phổ ký chủ nấm Metarhizium anisopliae 20 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Địa điểm thời gian tiến hành thí nghiệm 22 2.1.1 Địa điểm .22 2.1.2 Thời gian 22 i Đồ án tốt nghiệp 2.2 Vật liệu thí nghiệm .22 2.3 Máy móc, thiết bị .22 2.4 Môi trường nuôi cấy 22 2.5 Phương pháp .24 2.5.1 Phương pháp nghiên cứu .24 2.5.2 Bố trí thí nghiệm 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Khảo sát hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) chủng nấm Metarhizium anisopliae điều kiện phịng thí nghiệm 31 3.2 Ảnh hưởng môi trường ni cấy bán rắn lên hình thành bào tử chủng nấm M4 33 3.3 Ảnh hưởng loại khống bổ sung vào mơi trường ni cấy bán rắn lên hình thành bào tử chủng nấm M4 35 3.4 Ảnh hưởng thời gian ni cấy lên hình thành bào tử chủng nấm M4 .37 3.5 Hoạt lực diệt sâu chủng nấm M4 tăng sinh điều kiện ni cấy thích hợp chọn chọn nồng độ thử nghiệm thích hợp .38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 PHỤ LỤC ii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CAM : Complete Media CDA : Czapek – Dox M anisopliae : Metarhizium anisopliae M1 : chủng nấm M1 M2 : chủng nấm M2 M3 : chủng nấm M3 M4 : chủng nấm M4 NT : nghiệm thức NSGN : ngày sau gây nhiễm PGA : Potato Glucose Agar TNHH : trách nhiệm hữu hạn SDAY1 : Sabouraud dextrose Yeast SDAY3 : Sabouraud dextrose Yeast có thêm khoáng chất iii Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các chủng Metarhizium anisopliae dùng nghiên cứu 22 Bảng 2.2 Thành phần môi trường dùng thử nghiệm khảo sát môi trường nuôi cấy Metarhizium anisopliae 23 Bảng 2.3 Thành phần khoáng chất dùng thử nghiệm khảo sát môi trường nuôi cấy Metarhizium anisopliae 24 Bảng 3.1 Hoạt lực (%) diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) chủng nấm M anisopliae điều kiện phịng thí nghiệm 31 Bảng 3.2 Mật độ bào tử chủng nấm M4 tạo thành môi trường nuôi cấy 34 Bảng 3.3 Mật độ bào tử chủng nấm M4 mơi trường khống khác nhau… 36 Bảng 3.4 Mật độ bào tử chủng nấm M4 tạo thành mốc thời gian nuôi cấy khác 37 Bảng 3.5 Hoạt lực diệt sâu ăn tạp chủng nấm M4 mốc thời gian với nồng độ 106, 107, 108 bào tử/ml 38 iv Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơn trùng, sâu hại bị nấm Metarhizium anisopliae kí sinh Hình 1.2 Khuẩn lạc Metarhizium anisopliae Hình 1.3 Đặc điểm hình thái Metarhizium anisopliae Hình 1.4 Hai dạng bào tử nấm Metarhizium anisopliae Hình 1.5 Cơ chế xâm nhiễm nấm lên côn trùng bướm 17 Hình 1.6 Tiến trình lây nhiễm nấm lên côn trùng 18 Hình 3.1 Sâu ăn tạp sau gây nhiễm với chủng nấm M4 33 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) chủng nấm M anisopliae NSGN 32 Biểu đồ 3.2 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy lên hình thành bào tử chủng nấm M4 34 Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng dung dịch khống lên hình thành bào tử chủng nấm M4 36 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên hình thành bào tử chủng nấm M4 37 vi Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài - Đặt vấn đề Hiện nay, việc nông dân sử dụng không hợp lý, lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật sản xuất nông nghiệp gây hậu nghiêm trọng trực tiếp đến môi trường sức khỏe người Có thể kể đến như: gây nhiễm mơi trường, làm nguồn nước, đất đai bị nhiễm độc ảnh hưởng đến sức khỏe người trồng, nông sản bị nhiễm độc không tiêu thụ được, gây độc cho sinh vật có ích, tạo lồi sâu, bệnh, cỏ dại, chuột hại mang tính kháng thuốc cao Trong năm gần đây, có nhiều nghiên cứu ứng dụng Metarhizium anisopliae nước giới như: Philippin nghiên cứu sử dụng nấm M anisopliae để trừ rầy nâu hại lúa (Rombach A.C., cộng 1986), Úc nghiên cứu để phòng trừ bọ hại mía đạt hiệu 68% ( Milner, 1991), Nhật Bản sử dụng nấm xanh để phòng trừ dòi hại rễ củ cải đạt hiệu 70% sau 10 ngày (1988), Malaysia nghiên cứu để phòng trừ mối đất đạt hiệu 64,75% sau 14 ngày Ở nước, M anisopliae nghiên cứu phòng trừ mối (Nguyễn Dương Khuê, 2005), trừ sâu, rầy nâu hại công nghiệp, lâm nghiệp lúa (Phạm Thị Thùy cộng sự, 2000-2004; Nguyễn Thị Lộc cộng sự, 2002) áp dụng sản xuất hộ nơng dân quy mơ cịn nhỏ, thời gian ni cấy cịn dài, chất lượng chưa ổn định Vì vậy, đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng điều kiện ni cấy bán rắn lên hình thành bào tử Metarhizium anisopliae” thực nhằm góp phần hồn thiện qui trình tạo chế phẩm sinh học phục vụ cho nông nghiệp - Ý nghĩa đề tài • Ý nghĩa khoa học Đánh giá tiềm ứng dụng chủng M anisopliae nghiên cứu Đồ án tốt nghiệp Đánh giá ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy bán rắn lên hình thành bào tử chủng M anisopliae • Ý nghĩa thực tiễn Góp phần hồn thiện qui trình tạo chế phẩm sinh học phục vụ cho nông nghiệp từ M anisopliae Tình hình nghiên cứu - Trên giới Năm 1878, nhà Bác học người Nga Metschnhikov nghiên cứu bệnh bọ cứng hại lúa mì để tìm phương pháp phịng trừ phát nấm Entomophthora anisopliae, đổi tên M anisopliae Năm 1880 đến 1886, Metschnhikov học trị Isac Craxinstic nghiên cứu hàng loạt môi trường nuôi cấy nấm M anisopliae sản xuất thử hàng nghìn kilogram nấm để tách bào tử khiết Sau đó, dùng bào tử nấm trộn với đất mịn đem bón đồng ruộng Theo tác giả sau 10 - 14 ngày thí nghiệm sâu non trưởng thành bọ đầu dài hại củ cải đường chết với tỷ lệ 55 - 80% Năm 1968, Theo báo cáo Veen M anisopliae ký sinh 200 lồi trùng khác Năm 1984, Albonoz Parada nghiên cứu khả phòng trừ Sogatodes oryzickola (Muir) M anisopliae Kết cho thấy, tỷ lệ chết đạt 100 nồng độ 109 bào tử/ml tỷ lệ chết đạt 50% nồng độ 107 bào tử/ml Năm 1987, Malaysia, nấm xanh M anisopliae nghiên cứu để phòng trừ mối đất đạt hiệu 64,75% sau 14 ngày Tại Philippines, nghiên cứu sử dụng nấm xanh để diệt rầy nâu hại lúa đạt hiệu lực 60% sau 10 ngày Năm 1991, Úc Milner nghiên cứu nấm M anisopliae để phịng trừ bọ hại mía đạt hiệu 68% Năm 2004, V Rachappa cộng nghiên cứu ảnh hưởng gạo, bo bo, bắp, lúa mì, lúa mạch… lên phát triển chủng nấm M anisopliae kết cho thấy gạo chất tốt cho mật độ bào tử đạt 4,03 x 109 bào tử/g Đồ án tốt nghiệp Năm 2008, Rajesh Anand cộng nghiên cứu hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) chủng nấm M anisopliae, L muscar C Cardinalis Kết cho thấy, chủng M anisopliae cho hoạt lực diệt sâu cao hai chủng cịn lại Năm 2014, Rẳl Daniel Kruger cộng nghiên cứu sản xuất bào tử môi trường bán rắn gạo trắng, gạo luộc, tấm, gạo thóc, gạo lức, vỏ trấu lúa mì Kết cho thấy, cho hiệu hình thành bào tử cao Năm 2015, LiGao nghiên cứu phương pháp để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy thu sinh khối bào tử Metarhizium anisopliae chủng Metarhizium SQZ-1-21 M anisopliae RS-4-1 Kết cho thấy, chủng Metarhizium SQZ-1-21 đạt 2,53 x 105 bào tử/ml chủng M anisopliae RS-4-1 đạt 2,25 x 105 bào tử/ml ngày nuôi cấy Trong đó, Metarhizium SQZ-1-21 ni theo điều kiện mơi trường riêng biệt: -1,2 MPa, độ pH9, 12 sáng, 29oC -1,2 MPa, pH 9, ánh sáng h, 29oC M anisopliae RS-4-1 nuôi theo điều kiện: -0,3 MPa, pH 8, ánh sáng 24 h, 29oC -3,9 MPa, pH 5, ánh sáng 12 h, 26oC - Ở Việt Nam Năm 1981, GS.TS Nguyễn Lân Dũng mơ tả hình thái, phân tích chế tác dụng, hướng dẫn cách phân lập, nuôi cấy phương pháp sản xuất sinh khối Metarhizium Năm 1992, Phạm Thị Thùy cộng thuộc Viện Bảo vệ thực vật phân lập, nuôi cấy thử nghiệm chủng Metarhizium thuộc hai lồi M anisopliae M flavoviride để phịng trừ lồi sâu hại nơng, lâm nghiệp phương pháp phun trực tiếp bào tử Metarhizium đồng ruộng Năm 1996, Tạ Kim Chỉnh phân lập, nuôi cấy số chủng M anisopliae thử nghiệm để diệt châu chấu di cư loài sâu bệnh hại nông nghiệp Năm 1998, Dương Ngọc Khuê cộng thuộc viện Khoa học lâm nghiệp nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm Metarhizium để thử khả diệt mối Coptotemes fomosanus phịng thí nghiệm Các nghiên cứu đưa Đồ án tốt nghiệp chế phẩm LT50, LT100, LD50, LD100 chủng Metarhizium tuyển chọn với Coptotemes fomosanus cho biết ba chủng có hiệu lực diệt mối tốt Năm 2000, lần Bến Tre, Phạm Thị Thùy sử dụng nấm M anisopliae để trừ bọ dừa Kết ban đầu cho thấy, nấm M anisopliae có hiệu bọ dừa Bến Tre phịng thí nghiệm, nhà lưới ngồi đồng Năm 2009, Lê Hữu Phước phân lập nghiên cứu mơi trường nhân sinh khối lồi nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok (Ma), Beauveria Basiana (Bals.) Vuill (Bb) Paecilomyces spp (Pae) nhóm rau ăn đồng sông Cửu Long Kết cho thấy, môi trường SDAY3 môi trường cho mật độ bào tử (bào tử/ml) cao loại môi trường lỏng CDA, CAM, SDAY1 SDAY3 Mục đích nghiên cứu - Xác định chủng nấm M anisopliae có hoạt lực diệt sâu cao số chủng nghiên cứu - Xác định số điều kiện nuôi cấy bán rắn chủng nấm M anisopliae chọn Nhiệm vụ nghiên cứu - Khảo sát hoạt lực diệt sâu ăn tạp (Spodoptera litura) chủng nấm M anisopliae điều kiện phịng thí nghiệm - Khảo sát ảnh hưởng môi trường nuôi cấy bán rắn lên hình thành bào tử chủng nấm M anisopliae - Khảo sát ảnh hưởng loại khoáng bổ sung vào môi trường nuôi cấy bán rắn lên hình thành bào tử chủng nấm M anisopliae - Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên hình thành bào tử chủng M anisopliae - Khảo sát lại hoạt tính chủng M anisopliae tăng sinh điều kiện nuôi cấy chọn chọn nồng độ xử lý thích hợp Đồ án tốt nghiệp Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp cấy chuyền giữ giống - Phương pháp nuôi cấy bán rắn M anisopliae - Phương pháp xác định độ ẩm - Phương pháp đếm mật độ bào tử buồng đếm hồng cầu - Phương pháp thu thập sâu ăn tạp - Phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học - Phương pháp xử lý số liệu: xử lý phần mềm SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) Các kết đạt đề tài - Tìm chủng M anisopliae có hiệu lực diệt sâu cao số chủng nghiên cứu - Tìm mơi trường bán rắn số điều kiện tăng sinh thu nhận bào tử thích hợp cho M anisopliae Kết cấu Đồ án tốt nghiệp Gồm có chương - Chương 1: Tổng quan tài liệu (Sơ lược M anisopliae) - Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (Thời gian, địa điểm, vật liệu thí nghiệm phương pháp nghiên cứu) - Chương 3: Kết thảo luận (kết đạt thí nghiệm nhận xét) - Chương 4: Kết luận kiến nghị (kết luận đề xuất nghiên cứu) Đồ án tốt nghiệp Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược Metarhizium anisopliae 1.1.1 Phân loại Xếp theo hệ thống phân loại nấm G C Anisworth (1971), nấm Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ nấm bất toàn (Deuteromycetes), giống Metarhizium Một số tác giả khác lại cho rằng, nấm M anisopliae thuộc ngành phụ nấm túi Ascomycotina giống Metarhizium [12] Theo Sorokin (1883) nấm xanh phân loại sau: [9] Ngành (Phylum) : Ascomycota Lớp (Class) : Sordariomycetes Bộ (Order) : Hypocreales Họ (Family) : Clavicipitaceae Chi (Genus) : Metarhizium Loài (Species) : Metarhizium anisopliae 1.1.2 Phân bố Nấm M anisopliae tìm thấy khắp châu lục, ký sinh 50 họ gồm khoảng 200 lồi trùng rầy lá, rầy mềm, bọ xít đen nhiều loài sâu hại khác Sau xâm nhiễm, chúng hình thành bề mặt trùng lớp phấn màu xanh vàng đến màu xanh đậm, mạng sợi nấm chằng chịt màu trắng [12] Hình 1.1 Cơn trùng, sâu hại bị nấm Metarhizium anisopliae kí sinh “Nguồn: hình 1_Lê Hữu Phước (2010), hình 2_Phan Công Nhật (2011)” [7],[11] Đồ án tốt nghiệp Nấm M anisopliae nấm hại côn trùng, xuất phổ biến tự nhiên, phân lập từ xác côn trùng chết hay phân lập từ đất Người ta phân lập M anisopliae điều kiện thời tiết đặc biệt như: nơi có nhiệt độ -2oC, khu đất rừng sâu bị đốt cháy, chất thải hữu trầm tích sơng chứa đất đầm lầy trồng loại đước, tổ số loài chim rễ dâu tây phân lập nấm M anisopliae [8] 1.1.3 Đặc điểm hình thái Hình 1.2 Khuẩn lạc Metarhizium anisopliae “Nguồn: hình 2_Phan Cơng Nhật (2011), hình 3_Phan Trọng Nhật (2009)” [9],[10] Nấm M anisopliae có dạng sợi phân nhánh, có vách ngăn ngang, đường kính – µm, cuống sinh bào tử bện chặt, cuống sinh bào tử riêng rẻ phân nhánh nhiều lần, tế bào sinh bào tử có đỉnh trịn Sợi nấm phát triển bề mặt trùng có màu từ trắng đến xanh, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn đám sợi nấm dày đặc Bào tử trần hình que có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám đến ôliu - lục, bào tử xếp thành chuỗi chặt chẽ nhìn mắt thường thấy bào tử tạo bề mặt thể côn trùng lớp phấn rõ màu xanh lục Sợi nấm phát triển bên côn trùng có chiều rộng khoảng - µm, dài khoảng 20 µm, chia thành nhiều tế bào ngắn, tế bào thấy rõ nhiều giọt mỡ [14] Đồ án tốt nghiệp Hình 1.3 Đặc điểm vi thể Metarhizium anisopliae “Nguồn: hình 1_Joseph F Bischoff (2006), hình 2_Nguyễn Thúy Nhung (2016)” [10],[16] a b Hình 1.4 Hai dạng bào tử nấm Metarhizium anisopliae a Dạng bào tử hình ovale b Dạng bào tử hình trụ “Nguồn: Huỳnh Hữu Đức (2010)” [3] Nấm M anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, hình thành theo dạng chuỗi, khuẩn lạc có màu xanh, có màu tối màu hồng vỏ quế Lồi M anisopliae có dạng bào tử nhỏ lớn, dạng bào tử nhỏ M anisopliae var major có kích thước bào tử 3,5 - 5,0 x 2,5 - 4,5 µm, dạng bào tử lớn M anisopliae var major có kích thước bào tử 10,0 - 14,0 µm [8] Đồ án tốt nghiệp Chúng phát triển nhanh môi trường Czapek - Dox nuôi nhiệt độ 28oC sau - 10 ngày ni cấy khuẩn lạc có đường kính - 8,5 cm [13] 1.1.4 Đặc điểm sinh học 1.1.4.1 Khả sử dụng chất Các loại vi nấm kí sinh trùng thường khơng địi hỏi khắc khe loại thức ăn carbon định Chúng có khả sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau, có loại hợp chất đồng hóa tốt loại hợp chất khác Có nhiều trường hợp mơi trường ni cấy có mặt vài nguồn carbon khác nhau, nấm phát triển mạnh có riêng lồi Các cơng trình nghiên cứu Hegendus cộng (2010) xác định môi trường tốt để phân lập nấm M anisopliae mơi trường có chứa chitin làm nguồn carbon [13] Để thực q trình sinh lý khác nhau, nấm thường có nhu cầu nguồn carbon khác Theo Hegendus cộng (2010) cho biết M anisopliae ni cấy chìm có bổ sung chitin hexosamine glucose thu lượng bào tử cao Nhờ khả đồng hóa nguồn carbon phức tạp mà M anisopliae nhiều nhà khoa học giới nghiên cứu thông qua chế diệt côn trùng khẳng định trình xâm nhập nấm vào thể côn trùng trước hết phân hủy lớp vỏ chitin lớp da Tiếp theo phân hủy protein mô, đồng thời với protein phá hủy lipid Q trình thực nhờ vai trò phức hệ enzyme ngoại bào nấm kí sinh sâu hại trồng [8] Khi ni chủng nấm M anisopliae mơi trường có nguồn carbon khác người ta thấy chúng đồng hóa tốt loại đường glucose, maltose, sacharose, lại đồng hóa đường rafinose yếu [8] Mối quan hệ nguồn thức ăn carbon với hình thành phát triển bào tử nấm M anisopliae tác giả Jenking Prior (1993) xác định Các tác giả cho biết tỷ lệ thích hợp giàu sacharose peptone dịch ni cấy nấm M anisopliae có ảnh hưởng tới sinh trưởng hình thành bào tử nấm [13] Đồ án tốt nghiệp Thành phần chitin môi trường nuôi cấy cần thiết chủng vi nấm ký sinh trùng chất chitin giúp cho sinh trưởng, phát triển hình thành bào tử đính bào tử chồi nấm [13] Tuy nhiên, tất nguồn thức ăn carbon hỗ trợ cho sinh trưởng phát triển nảy mầm hình thành bào tử nấm Nghiên cứu hiệu nguồn carbon, nitơ vitamin nấm M anisopliae phân lập từ sâu Inoplus ruoricus, người ta nhận thấy trình nảy mầm, sinh trưởng hình thành bào tử nấm M anisopliae sử dụng nguồn nitrat nitơ amôn Trong nguồn nitơ thử, có cystein ức chế sinh trưởng hình thành bào tử nấm Những vitamin thử không làm tăng sinh trưởng hình thành bào tử nấm M anisopliae [8] Ngồi việc sử dụng nguồn nitơ vơ cơ, nấm cịn sử dụng tốt nguồn nitơ hữu protein, peptone axit amin Axit glutamic axit amin thích hợp cho phát triển nấm M anisopliae Nguồn thức ăn nitơ protein từ thể côn trùng chất giàu dinh dưỡng cho nấm gây bệnh côn trùng sinh trưởng phát triển [8] Theo nghiên cứu V Rachappa cộng (2005), M anisopliae có khả sử dụng hiệu chất gạo, bo bo, bắp, lúa mì, lúa mạch [18] Raúl Daniel Kruger cộng (2014), nghiên cứu sản xuất bào tử môi trường bán rắn gạo trắng, cơm, tấm, gạo thóc, gạo lức, vỏ trấu lúa mì Kết cho thấy mơi trường thích hợp để sản xuất bào tử M anisopliae [20] 1.1.4.2 Nhu cầu chất kích thích sinh trưởng Vi nấm có mối quan hệ khác loại vitamin chất kích thích sinh trưởng Ngồi tác dụng kích thích nảy mầm bào tử tăng trưởng hệ sợi nấm, có loại vitamin kìm hãm hạn chế sinh trưởng nấm Trường hợp bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy người ta thấy có ức chế khoảng 30- 40% q trình sinh trưởng phát triển nấm Các chủng nấm M anisopliae, bổ sung thêm chitin tự nhiên châu chấu vào môi trường nuôi 10 Đồ án tốt nghiệp cấy làm tăng khả sinh bào tử (Li Holdom, 2002) Các nguyên tố vi lượng có tác dụng kích thích phát triển vi nấm, ví dụ loại khỏi mơi trường ngun tố vi lượng Mo, người ta nhận thấy hàm lượng nitratreductaza tế bào vi nấm giảm chín lần [8] 1.1.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển M anisopliae - Ảnh hưởng phương pháp ni cấy Nấm trùng ni cấy chìm xốp Tuy nhiên, phương pháp ni cấy chìm thường tạo bào tử dạng bào tử chồi, dễ hoạt tính có cấu trúc khơng bền vững thời gian sống ngắn Vì vậy, phương pháp nuôi cấy xốp áp dụng rộng rãi để tạo chế phẩm nấm côn trùng Phương pháp nuôi cấy xốp tạo chế phẩm dạng đính bào tử ổn định bền vững dạng bào tử chồi [4] Theo tác giả Rombach (1986), Hegedus cộng (2010), Jenkins Prior (1993), sử dụng phương pháp ni cấy chìm để sản xuất nấm thu kết tốt Vì ni cấy chìm, người ta xác định khả sinh bào tử chồi lượng sinh khối Metarhizium anisopliae cao Bằng phương pháp ni cấy chìm (tại Trung Quốc), Li cộng (1996) thí nghiệm tách chiết theo phương pháp mỏng xác định độc tố nấm Metarhizium anisopliae Destruxin A, B, C D [3] - Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy yếu tố quan trọng cho sinh trưởng phát triển, khả tiết độc tố nấm, môi trường không phù hợp, nấm mọc yếu hay không mọc giảm độc tố Nấm M anisopliae phát triển mơi trường khơng có chitin Nhưng theo Phạm Thị Thùy (2010), mơi trường thích hợp cho nấm phát triển mơi trường có chitin làm nguồn carbon Nếu bổ sung thêm chitin glucose q trình ni cấy, nấm M anisopliae hình thành lượng bào tử cao chitin giúp hình thành phát triển bào tử đính bào tử trần Quá trình hình thành bào tử đính kích thích số axit amin đặc biệt lysine, alanine, axit glutamic 11 ... trường nuôi cấy bán rắn lên hình thành bào tử chủng nấm M anisopliae - Khảo sát ảnh hưởng loại khoáng bổ sung vào môi trường nuôi cấy bán rắn lên hình thành bào tử chủng nấm M anisopliae - Khảo sát. .. nông nghiệp - Ý nghĩa đề tài • Ý nghĩa khoa học Đánh giá tiềm ứng dụng chủng M anisopliae nghiên cứu Đồ án tốt nghiệp Đánh giá ảnh hưởng điều kiện ni cấy bán rắn lên hình thành bào tử chủng M anisopliae. .. Biểu đồ 3.3 Ảnh hưởng dung dịch khống lên hình thành bào tử chủng nấm M4 36 Biểu đồ 3.4 Ảnh hưởng thời gian ni cấy lên hình thành bào tử chủng nấm M4 37 vi Đồ án tốt nghiệp