Đánh giá hoạt tính kháng vi khuẩn propionibacterium acnes của liposomal acid lauric trong việc trị mụn trứng cá

1 Khái quát: • Mụn trứng cá bệnh viêm da phổ biến • Nghiên cứu năm 2011 trường Cần Thơ 80% học sinh mắc phải • Thường xuất nơi có nhiều tuyến bã nhờn: mặt, vai,… • Phân loại: mụn đầu đen/ trắng, mụn mủ, mụn bọc, • Nguyên nhân: nội tiết tố, môi trường, stress, chế độ dinh dưỡng,… => Sự hoạt động mức tuyến bã nhờn => phát triển vi khuẩn Propionibacterium acnes => Ảnh hưởng đến ngoại hình, tâm lý người bệnh => trầm cảm Hình 1.1: Phân loại mụn trứng cá Gram dương hình que, kỵ khí Chiếm số lượng lớn hệ vi sinh da P acnes Cư trú nơi nhiều bã nhờn Giúp cân nội môi, trì da khỏe mạnh, ngăn vi sinh vật có hại khác cơng da Hình 1.2: Hình dạng vi khuẩn P acnes kính hiển vi Sự phát triển mức P acnes => MỤN TRỨNG CÁ Cơ chế hình thành mụn: Hình 2.1: Quá trình hình thành mụn viêm Hình 2.2: Cơ chế hình thành mụn P acnes • Tạo lipase => phân hủy triglycerides thành acid béo tự • Phá vỡ biệt hóa tế bào sừng nang lơng kích thích viêm, nhận diện TLR2, TLR4 => Kích hoạt yếu tố hạt nhân κB (NFκB) • Thành peptidoglycan P acnes tạo cytokine: IL-1β, IL-8, TNF-α => u hạt Liposomal Lauric Acid (LipoLA) 3.1 Lauric Acid (C12H24O2) Hình 3.1: Cấu trúc Lauric Acid - Axit béo bão hồ (12C) - Tìm thấy chất béo thực vật từ: sữa dừa dầu dừa, dầu nguyệt quế dầu hạt cọ - Đã chứng minh kháng vi khuẩn gram dương số loại nấm, virus 3.2 Liposome - Tiểu phân tử hình cầu, kích thước nhỏ - Có nhiều lớp lipid kép tạo thành từ cholesterols phospholipids -> Được xem phương tiện vận chuyển thuốc hiệu Hình 3.2: Cấu trúc Liposome 3.3 Liposomal Lauric acid: Hình 3.3: Cấu trúc thành phần LipoLA: phospholipid, cholesterol lauric acid - Điều trị mụn trứng cá hiệu an toàn - Thành phần: • Hydrogenated l-aphosphatidylcholine (eggpc) • Cholesterol • Lauric acid - Đường kính: 119.9 ± 0.3 nm - Điện tích bề mặt trung bình: 43.8 ± 1.5 mV Hình 3.4: Sơ đồ sử dụng LipoLA điều trị mụn trứng cá gây vi khuẩn P acnes (A) Hình da bị mụn (B) cấu trúc thành phần LipoLA : phospholipid, cholesterol lauric acid (C) Cơ chế tác động LipoLA (D) Da sau điều trị (E) đường kính (nm) điện tích bề mặt (thế zeta, mV) LipoLA 10 Mơ hình thực nghiệm 4.1 Chuẩn bị vi khuẩn hóa chất - P acnes: nuôi cấy đĩa thạch môi trường (RCM), điều kiện yếm khí 37 ° C ngày - Sau đó, khuẩn lạc đơn lẻ cấy vào RCM cho thêm 5% máu cừu nuôi cấy 37°C điều kiện yếm khí - Thu hoạch vi khuẩn cách ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút phút, rửa PBS, lặp lại lần sau ngâm vi khuẩn vài lượng PBS thích hợp để làm thí nghiệm 11 Mơ hình thực nghiệm 4.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn P.acnes Liposomal Lauric acid (LipoLA) in vitro - Kiểm tra hoạt động kháng khuẩn LipoLA Test sample P.acnes (1x10^7 CFU/ml) LipoLA (2 mg / mL) Control P.acnes (1x10^7 CFU/ml) PBS PBS => Các nhóm ủ điều kiện kị khí ngày, sau đem pha lỗng đếm số vi khuẩn lại - Kiểm tra ảnh hưởng LipoLA đến hình thái vi khuẩn: Vi khuẩn P acnes ủ với LipoLA với 2% glutaraldehyde, sau quan sát kính hiển vi điện tử qt (SEM) 16 Hình 4.3.1 Lượng vi khuẩn sau ngày ủ với LipoLA PBS Hình 4.3.2 Hình dạng vi khuẩn quan sát kính hiển vi điện tử (SEM) - Sau ngày, số vi khuẩn P.acnes bị tiêu diệt hồn tồn số vi khuẩn nhóm control 6.5x10^6 CFU/mL  Việc tích hợp thêm cấu trúc liposomal khơng làm ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn P.acnes LA - Hình dạng vi khuẩn bị biến dạng bất thường thu nhỏ lại => LipoLA tương tác tiêu diệt vi khuẩn P.acnes qua chế phá vỡ cấu trúc màng vi 17 khuẩn Mơ hình thực nghiệm 4.4 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn P.acnes Liposomal Lauric acid (LipoLA) in vivo Kiểm hoạt tính kháng khuẩn LipoLA môi trường sinh lý (tai chuột) Sau 24h Tai thu thập cách sử dụng lỗ sinh thiết mm để định lượng lượng P acnes lại cách đếm Tiêm vào tai hỗn hợp • Test sample: P.acnes (10^8 CFU/mL) + LipoLA nồng độ khác • Control: P.acnes (10^8 CFU/mL) + PBS • Positive control: P.acnes (10^8 CFU/mL) + BPO (16mg/mL) + DMSO • Normal: 18 => LipoLA tiêu diệt hiệu P.acnes mơi trường sinh lý Hình 4.4.1 Lượng vi khuẩn sống sau ủ với LipoLA, BPO, PBS nhóm chuột normal 19 Mơ hình thực nghiệm 4.5 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn P.acnes gel Liposomal Lauric acid (gel LipoLA) in vivo Kiểm hoạt tính kháng P.acnes bơi lên da (tai chuột) Làm trầy cấy vào tai chuột P.acnes (10^6 CFU/mL) => Gây viêm Bôi mg/mL gel LipoLA ngày Sau ngày Tai thu thập cách sử dụng lỗ sinh thiết mm để định lượng lượng P acnes lại cách đếm Hỗn hợp gel LipoLA gồm: • Hydroxyetyl xenluloza (7,0% trọng lượng) • Glycerin (5,6% trọng lượng) • Polyetylen glycol 400 (1,8% trọng lượng) 20 => Gel LipoLA cho thấy hiệu tương đương với kem BPO thương mại thị trường Hình 4.5.1 Lượng vi khuẩn cịn lại sau bôi gel LipoLA kem BPO thương mại 21 Mơ hình thực nghiệm 4.6 Độc tính LipoLA da Cạo lông lưng chuột, sau 24h bôi gel/kem trực tiếp lên da giữ nguyên • • • • • Sau 24h Da cắt ngang lỗ sinh thiết mm, nhuộm hematoxylin eosin (H&E), chụp ảnh kính hiển vi Gel LipoLA: test sample Kem BPO thương mại (BPO): positive control Kem nair tẩy lông thương mại (nair): positive control Kem axit salicylic thương mại (SA): positive control Đệm PBS (PBS): normal 22 Hình 4.6.1 Da lưng chuột cắt ngang chup kính hiển vi sau sử dụng gel LipoLA, kem BPO, kem SA, kem tẩy lổng Nair - Các mẫu xử lý LipoLA cho thấy da không bị xáo trộn với lớp tế bào biểu bì khỏe mạnh đầu lớp hạ bì, giống với mẫu da điều trị PBS => LipoLA khơng gây phản ứng da khoảng thời gian 24h 23 Tổng kết Hiệu kháng P.acnes in vitro Hiệu kháng P.acnes in vivo LipoLA Hiệu kháng P.acnes sử dụng bôi qua da Khơng gây kích ứng sử dụng qua da => LipoLA chất tiềm sử dụng để ngăn ngừa phát triển vi khuẩn P.acnes từ ngăn chặn mụn trứng cá da 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO: Hanh TT Clinical and related factors in Acne-Experiences from Can Tho, Viet Nam Malaysian J Dermatology 2011;26:6-11 Kanwar IL, Haider T, Kumari A, Dubey S, Jain P, Soni V Models for acne: A comprehensive study Drug Discov Ther 2018;12(6) doi:10.5582/ddt.2018.01079 Castillo DE, Nanda S, Keri JE Propionibacterium (Cutibacterium) acnes Bacteriophage Therapy in Acne: Current Evidence and Future Perspectives Dermatol Ther (Heidelb) 2019;9(1):19-31 doi:10.1007/s13555-018-0275-9 McLaughlin J, Watterson S, Layton AM, Bjourson AJ, Barnard E, McDowell A Propionibacterium acnes and acne vulgaris: New insights from the integration of population genetic, multi-omic, biochemical and host-microbe studies Microorganisms 2019;7(5) doi:10.3390/microorganisms7050128 Lee EH, Shin JH, Kim SS, Joo JH, Choi E, Seo SR Suppression of propionibacterium acnes-induced skin inflammation by laurus nobilis extract and its major constituent eucalyptol Int J Mol Sci 2019;20(14) doi:10.3390/ijms20143510 Nakatsuji T, Kao MC, Fang JY, et al Antimicrobial property of lauric acid against propionibacterium acnes: Its therapeutic potential for inflammatory acne vulgaris J Invest Dermatol 2009;129(10) doi:10.1038/jid.2009.93 Pornpattananangkul D, Fu V, Thamphiwatana S, et al In vivo treatment of propionibacterium acnes infection with liposomal lauric acids Adv Healthc Mater 2013;2(10) doi:10.1002/adhm.201300002 A P Desbois , V J Smith Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential Appl Microbiol Biotechnol 2010 , 85 , 1629 – 1642 doi:10.1007/s00253-009-2355-3 Abolfazl Akbarzadeh, Rogaie Rezaei-Sadabady, Soodabeh Davaran , Sang Woo Joo, Nosratollah Zarghami, Younes Hanifehpour, Mohammad Samiei, Mohammad Kouhi and Kazem Nejati-Koshki Liposome: classification, preparation, and applications Akbarzadeh et al Nanoscale Research Letters 2013, 8:102 doi: 10.1186/1556-276X-8-102 26 Một số câu hỏi đặt ra: Tại lại dùng thí nghiệm tai chuột? Bởi cấu trúc tai chuột có nhiều hạn chế, nên tiêm vi khuẩn vơ khơng bị đào thải ngồi => Giữ lượng vi khuẩn nhiều Tại thêm 5% máu cừu phần chuẩn bị vi khuẩn hóa chất? Bởi chủng P acnes có nguồn gốc từ người động vật, nên phải thêm máu động vật vào để ni cấy đếm số lượng vi khuẩn chúng sinh trưởng Tại kiểm tra ảnh hưởng LipoLA đến hình thái vi khuẩn phải thêm 2% glutaraldehyde? Vì glutaraldehyde chất khử trùng y tế, thêm vào giúp khử vi khuẩn khác xâm nhập để tránh ảnh hưởng đến kết P acnes quan sát quét kính hiển vi 27 Đơn vị CFU gì? Đây đơn vị dùng để đếm số lượng vi khuẩn khả thi (có khả sinh sơi điều kiện kiểm sốt) Giải thích hỗn hợp gel LipoLA? Hydroxyetyl xenluloza, Polyetylen glycol 400 dùng để làm chất ổn định, bôi trơn tăng cường trì hình dạng để làm đặc; Glycerin dùng để dưỡng ẩm giúp lượng LipoLA giữ nhiều da chuột Tại phần đánh giá hoạt tính kháng khuẩn LA in vitro lại đo bước sóng 600nm? Bởi vi khuẩn hấp thu bước sóng này, đồng thời bước sóng không làm tổn hại đến phát triển vi khuẩn 28 Tại lại thực nhiều mơ hình khác in vitro? Vì LA acid béo có khả ức chế vi khuẩn P acnes nên ta làm thí nghiệm để đánh giá hoạt tính LA để chứng minh LA có khả kháng khuẩn Tuy nhiên, LA acid béo khó tan nước nên phải tích hợp thêm liposome để tăng tính tan nhằm tăng hiệu kháng khuẩn Sự khác MIC MBC? MIC – nồng độ ức chế tối thiểu, nghĩa nồng độ nhỏ ức chế phát triển vi khuẩn MBC – nồng độ diệt khuẩn tối thiểu, nghĩa nồng độ nhỏ tiêu diệt hồn tồn vi khuẩn Tại mơ hình đánh giá kháng khuẩn LA in vitro phải ủ điều kiện kỵ khí từ 3-5 giờ? Vì P acnes vi khuẩn kỵ khí nên phải tạo điều kiện để ni cấy không tác động đến phát triển Việc ủ thời gian 3-5 29 khoảng thời gian đủ để LA/ LipoLA tiêu diệt P acnes 10 Tại phần kết lại thấy vi khuẩn PBS nhỏ LipoLA? Khi PBS, vi khuẩn cịn có màng bao bọc, riêng lẻ Sau ủ LipoLA, màng peptidoglycan P acnes bị phá hủy khiến vi khuẩn tụ lại với 11 LA nghiên cứu có dầu dừa, thoa trực tiếp dầu dừa lên mặt gặp vấn đề mụn có tốt khơng (bởi mụn hình thành tiết dầu mức), có bị bí lỗ chân lơng khơng? Về bản, dầu chất giữ ẩm cho da, có khả làm mềm mượt cải tạo tình trạng da dầu dừa nghiên cứu có tác dụng tốt cho da mặt Tuy nhiên, việc thoa dầu dừa cần dựa vào địa cá nhân có hợp khơng Khi sử dụng dầu dừa trực tiếp lên mặt, cần đảm bảo dầu dừa phải tinh khiết, không lẫn tạp chất; tiếp đến ta cần rửa mặt thật để loại bỏ lượng dầu thừa mặt nên bôi lượng dầu dừa mỏng, vừa đủ để khóa ẩm mà khơng gây bít tắc lỗ chân lơng làm tình trạng mụn tồi tệ thêm Đồng thời, nên để dầu dừa da khoảng thời gian ngắn cần rửa nước ấm sau sử dụng để da thơng thống giảm tình trạng hình thành 30 mụn ... diệt vi khuẩn P .acnes qua chế phá vỡ cấu trúc màng vi 17 khuẩn 4 Mơ hình thực nghiệm 4.4 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn P .acnes Liposomal Lauric acid (LipoLA) in vivo Kiểm hoạt tính kháng khuẩn. .. đem đo máy đọc vi khuẩn với bước sóng 600 nm để ước tính phát triển vi khuẩn 12 Mơ hình thực nghiệm 4.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn P .acnes acid lauric (LA) in vitro - Đánh giá MBC (Minimum... 4.3 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn P .acnes Liposomal Lauric acid (LipoLA) in vitro - Kiểm tra hoạt động kháng khuẩn LipoLA Test sample P .acnes (1x10^7 CFU/ml) LipoLA (2 mg / mL) Control P.acnes