Ứng dụng tannase trong công nghiệp thực phẩm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Enzyme thực phẩm Ứng dụng tannase công nghiệp thực phẩm GVGD: TS Trần Quốc Tuấn i MỤC LỤC i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG BIỂU vi MỞ ĐẦU 1 Tổng quan 1.1 Giới thiệu tannase 1.2 Cấu trúc tannase 1.3 Cơ chế hoạt động 1.4 Các nguồn tannase 1.5 Đặc tính sinh hóa tannase vi sinh vật 1.5.1 Khối lượng phân tử 1.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ pH 1.5.3 Tác dụng ion kim loại 1.5.4 Ảnh hưởng dung môi hữu chất hoạt động bề mặt 1.6 Điều kiện lên men 1.7 Sản xuất tái tổ hợp tannase 11 1.8 Tinh tannase 11 1.9 Cố định enzyme 12 1.10 Tannin - Nguồn chất tự nhiên 13 1.11 Các ứng dụng tannase 16 1.11.1 Ngành chè 16 1.11.2 Nước ép trái 17 1.11.3 Ngành công nghiệp rượu bia 18 1.11.4 Thức ăn chăn nuôi 18 1.11.5 Xử lý môi trường 19 ii Nghiên cứu tannase giúp cải thiện lượng gallic acid có nước ép xồi 19 2.1 Đặt vấn đề 19 2.2 Vật liệu phương pháp 20 2.2.1 Vật liệu 20 2.2.2 Phương pháp 21 2.3 Kết 23 2.3.1 Quá trình tiêu hóa nước xồi đường miệng in vitro tác dụng tannase gallotannin xoài protein nước bọt 23 2.3.2 Ảnh hưởng tannase đến khả tiếp cận sinh học gallic acid q trình tiêu hóa dày ruột ống nghiệm 26 2.3.3 Ảnh hưởng tannase đến màu nước xoài độ ổn định lưu trữ polyphenol 29 2.4 Kết luận 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 iii iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT L-AA: L – ascorbic acid GA: Gallic acid v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể tannase từ Lactobacillus plantarum Hình 1.2 Phản ứng tiêu biểu tannase 16 Hình 2.1 Thành phần viên nén làm lại từ nước bọt người chiết xuất gallotannin xoài 25 Hình 2.2 Sự thay đổi nồng độ gallic acid nước xồi q trình tiêu hóa ống nghiệm 29 Hình 2.3 Sự thay đổi độ hấp thụ bước sóng 420 nm nước xoài thời gian bảo quản tuần 31 Hình 2.4 Sự thay đổi nồng độ gallic acid nước xoài 32 vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Đặc tính tannase Bảng 1.2 Điều kiên lên men vi sinh vật sản xuất tannase Bảng 1.3 Chiến lược tinh tannase 12 Bảng 2.1 So sánh nồng độ gallic acid (mg/L) nước xoài với nước xồi có nước bọt q trình tiêu hóa ống nghiệm từ 0–2 giờ, 3–4 6–10 thể giai đoạn tiêu hóa dày, ruột non ruột già 24 MỞ ĐẦU Tannase, tannin acylhydrolases, nhóm quan trọng enzyme liên quan đến công nghệ sinh học, sử dụng số ứng dụng công nghiệp, bao gồm sản xuất trà uống, bia, nước trái cây, số loại rượu vang sản xuất gallic acid Tannase thường tạo vi sinh vật bao gồm Aspergillus, Paecilomyces, Lactobacillus Bacillus Nó phân bố nhiều tìm thấy từ nguồn động vật, thực vật vi sinh vật Tuy nhiên, tannase từ nguồn vi sinh sử dụng công nghiệp nhiều Tannase thường sản xuất tannic carbon tannic acid, cám lúa mì, chiết xuất vỏ trà cà phê Các tannase vi sinh vật chủ yếu enzyme ngoại bào cảm ứng tạo cách lên men chìm lên men rắn Trong báo cáo này, nhóm trình bày tổng quan tannase nghiên cứu cụ thể tannase cải thiện hàm lượng gallic acid trì chất lượng nước ép xồi Tổng quan 1.1 Giới thiệu tannase Tannase tannin acylhydrolase (EC 3.1.1.20) enzyme cảm ứng ngoại bào, xúc tác trình thủy phân tannin gallic acid esters Enzyme thuộc nhóm serine esterase xúc tác q trình thủy phân liên kết ester (ester galloyl gốc rượu liên kết depside (ester galloyl gallic acid) tannin để giải phóng gallic acid Gallic acid chất để tổng hợp hóa học enzyme propyl gallate, chất chống oxy hóa mạnh [1] Tannase lần phát Tieghem [2] thí nghiệm hình thành gallic acid thành dung dịch tannin nước, phát triển hai lồi nấm xác định Penicillium glaucum Aspergillus niger Cho đến nấm sợi chủ yếu loài sau: Aspergillus, Penicillium, Fusarium Trichoderma phát sản xuất tannase Vi khuẩn nấm men tạo loại enzyme [3] Tannin hợp chất polyphenol tạo thực vật để kháng lại vi sinh vật động vật ăn cỏ xâm nhập Quá trình sản xuất tannase vi sinh vật xem trình tự bảo vệ vi sinh chống lại tannin Thực vật giàu tannin sản xuất gallic acid từ sản phẩm phụ thực vật ứng dụng enzyme tannase Gallic acid sản xuất từ tannin bột tara trình thủy phân vi sinh vật với tổng suất khoảng 30% (đối với trọng lượng nguyên liệu thô) Tannase ứng dụng ngành công nghiệp mỹ phẩm, thực phẩm công nghiệp thức ăn chăn nuôi, công nghiệp da công nghiệp hóa chất Nồng độ tannin cao đồ uống trà đá, bia, rượu, nước trái đồ uống có hương vị cà phê dẫn đến hình thành kết tủa tương tác chúng với phân tử khác có đồ uống Những tác dụng khơng mong muốn tannin làm giảm loại bỏ cách xử lý hóa chất enzyme 1.2 Cấu trúc tannase Cấu trúc tinh thể thu từ Lactobacillus plantarum Ren et al (2013) (Hình 1), mơ hình phân giải ngun tử 3D khác từ L plantarum Enzyme giữ cấu trúc α/β với nếp gấp serine hydrolase Cấu trúc mang vùng lớn nhơ vào nếp gấp serine hydrolase Vị trí hoạt động chứa Ser 163, His 451 Asp 419 ba xúc tác Gallic acid liên kết với chất hoạt hóa amino acid để tạo thành tương tác liên kết hydro Cả depsidase hoạt động esterase vị trí liên kết galloyl đơn liên kết chất tương tác vị trí Do đó, enzyme thuộc α/β-hydrolase Glycerol liên kết với vị trí liên kết galloyl với chất Đặc điểm cấu trúc thứ cấp Penicillium herquei tạo thành chuỗi xoắn α (14%), đối song song β-sheet (32,4%), β-sheet (4,8%), β-turn (18,8%) 30% cuộn ngẫu nhiên (Qiu et al 2011) [12] Hình 1.1 Cấu trúc tinh thể tannase từ Lactobacillus plantarum 1.3 Cơ chế hoạt động Tannase xúc tác cho hai phản ứng khác hoạt động esterase hoạt động depsidase Vị trí liên kết galloyl đơn lẻ đóng góp hoạt động esterase depsidase enzyme [12] Hoạt động Esterase liên quan đến việc thủy phân liên kết esters gallic acid galloyl glucose methyl gallate Mặt khác, hoạt động depsidase liên quan đến 20 cho gan, giảm khả hấp thụ protein hoạt tính từ ion sắt Bởi lý này, việc hạn chế hàm lượng tannin có thực phẩm thức ăn chăn nuôi điều cần thiết Trong nghiên cứu này, mơ hình thí nghiệm tiêu hố ống nghiệm cơng cụ hữu ích để đánh giá thay đổi mặt hoá học polyphenol trình tiêu hố Các mơ hình tiêu hố khác yếu tố tiêu hoá miệng, dày, ruột, thời gian tiêu hoá điều kiện sinh lý pH Do nhiều polyphenol coi có khả hấp thụ từ thực phẩm mơ hình in vitro giúp xác định mức độ hấp thụ bị ảnh hưởng điều kiện sinh lý ruột, hoạt động enzyme tương tác với chất dinh dưỡng đa lượng vi lượng q trình tiêu hố khả sử dụng polyphenol từ nguồn thực phẩm Ứng cử viên sử dụng thí nghiệm tannase, enzyme có khả phân cắt gallotannin việc phân cắt liên kết este depside để giải phóng gallic acid Tannase ứng dụng nhiều nghành công nghiệp thực phẩm năm qua nghành cơng nghiệp sản xuất đồ uống có cồn, trà, cà phê,… Việc sử dụng tannase giải pháp có tính khả thi nhằm tăng cường hàm lượng gallic acid có nước ép xồi mà khơng gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm trình bảo quản Trong nghiên cứu tác giả nhằm xác định xem tannase có ảnh hưởng đến trình tự oxy hố nâu nước ép xồi khả hấp thụ gallic acid qua đường miệng, dày, ruột q trình tiêu hố 2.2 Vật liệu phương pháp 2.2.1 Vật liệu 1,2,3,4,6-Pentagal- loyl glucose (5-GG), L-ascorbic acid (L-AA), porcine pancreatin (4 USP), mật lợn thu nhận từ Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA) Dịch vị, 88% formic acid methanol dùng chạy HPLC 0.1% formic acid mua từ Fisher Scientific (Hampton, NH, USA) Ethanol mua từ Koptec (King of Prussia, PA, USA) Tannase thu nhận từ Aspergillus oryzae (EC 3.1.1.20) có nguồn gốc từ tổng cơng ty Kikkoman (quận Chiba, Japan) 21 2.2.2 Phương pháp 2.2.2.1 Chuẩn bị nước ép xoài Xoài tươi Mexico cv Ataulfo giao đến Khoa dinh dưỡng khoa học thực phẩm đại học Texas A&M dạng xanh tươi Sau xồi để điều kiện tự nhiên cắt lấy phần thịt, đóng gói chân không túi nhựa bảo quản nhiệt độ âm 200C dùng để làm nước ép 0,02% cellulase 0,01% pectinase thêm vào hỗn hợp thịt xoài đồng ủ điều kiện 400C để thu nước ép có thịt xồi Hỗn hợp thịt xồi sau ly tâm 3500g 20 phút thu phần dịch phía ta có dịch ép xồi thô tinh điều kiện chân không nhẹ thông qua lớp đất tảo cát dày 0,5 cm, lớp đất tảo cát xử lý với nước acid hoá với 0,2% acid citric Nước ép xoài tinh thêm vào 200 mg/L gallic acid đương lượng (GAE) gallotannin, chất chiết xuất từ thịt xoài ethanol, làm bay hơi, phân tách từ sắc ký pha đảo C18 hoà tan nước Nước ép xoài tăng cường sau điều chỉnh đến pH 3,8 acid citric, ngâm nước sơi vịng 10 phút để trùng khử hoạt tính enzyme cịn sót lại làm lạnh nước đá 2.2.2.2 Mô q trình tiêu hố nước xồi qua đường miệng, dày ruột ống nghiệm Nước ép xoài tinh trùng thí nghiệm theo mơ hình điều chỉnh Green cộng (2007) Hỗn hợp 2ml nước ép xồi, có khơng có mg L-ascorbic acid, ml dịch vị (trong dày) ml dung dịch muối 0,9%, sau hỗn hợp định đến pH ± 0,1 HCl 1N ống falcon 15 ml Một phần mẫu sau sử dụng làm đường chuẩn ( 0h) Sau thời điểm 0h thu thập, 0,5 U/ml tannase thêm vào, vùng đầu rửa nitơ chất tiêu hố ủ bóng tối điều kiện 370C bể lắc Được khảo sát khoảng thời gian 0,5; Sau giờ, bắt đầu khảo sát giai đoạn tiêu hoá đường ruột, ml dung dịch enzyme đường ruột ( mg/ml pancreatin 12 mg/ml mật), ml NaHCO3 0,2M 22 thêm vào để điều chỉnh pH đến 0,9% dung dịch muối thêm vào đến thể tích cuối 10 ml Sau xả nitrogen, trình ủ giữ thêm mẫu thu nhận cách có hệ thống để đánh giá polyphenol Q trình phân huỷ dừng lại cách thêm methanol acid hố acid formic 1% đơng lạnh nhiệt độ âm 200C phân tích Mơ q trình tiêu hố miệng, ml nước ép xoài trộn với ml nước bọt người trộn với ml dịch dày ml nước ép xoài trộn với ml dung dịch muối 0,9% sử dụng để làm đối chứng Q trình tiêu hố dày ruột sau thực tương tụ mơ hình Green cộng Nước bọt thu nhận từ hai tình nguyện viên khác giới khơng hút thuốc, mẫu ly tâm 10000 g 10 phút để loại bỏ chất khơng hồ tan Để mơ tannase ảnh hưởng đến tương tác protein- tannin giai đoạn tiêu hố miệng, 400 µl nước bọt trộn với 400 µl gallic acid đương lượng gallotannin nồng độ 100 mg/l phân lập từ xoài theo nghiên cứu Strumeyer Malin ( 1975) Nước bọt gallotannin ly tâm 10000 g vòng 10 phút để tạo thành dạng tủa Sau đó, phần dịch loại bỏ phần tủa rửa nước, ly tâm, loại bỏ phần dịch cân U/ml tannase thêm vào phần tủa ủ giờ, mẫu đối chứng không chứa tannase ủ lúc Sau giờ, phần tủa cân lại phân bị phân giải phân tích LC- MS 2.2.2.3 Màu nước ép xoài độ ổn định polyphenol lưu trữ Độ ổn định lưu trữ polyphenol có nước ép xồi bổ sung gallotannin đánh giá qua diện không diện tannase thêm vào acid ascorbic Nước xoài tinh chia thành hai phần, nửa sử lý với 1,67 U/ml tannase so với đối chứng không thêm enzyme, hai ủ điều kiện 350C nồi đun cách thuỷ Theo dõi trình thuỷ phân tannase, phần lại chia thành hai phần, thêm vào 200% so với lượng L- acid ascorbic khuyến nghị ngày mẫu đối chứng không thêm vào Natri azide 50 mg/l thêm vào để ngăn chặn phát triển vi sinh vật, loại mẫu 23 thêm vào ống thuỷ tinh nắp vặn 10 ml, rửa nitơ, trùng 1000C phút, làm lạnh bể nước đá bảo quản điều kiện tối nhiệt độ 200C Nước trái đánh giá nồng độ gallic acid sau 0, 1, 2, 4, tuần bảo quản LC-MS độ hấp thụ bước sóng 420 nm để đánh giá màu nâu dịch ép 2.2.2.4 Phân tích HPLC- ESI- MS Polyphenol phân tích cách sử dụng Thermo- Finnigan khảo sát HPLC- PDA song song với máy quang phổ bẫy ion LCQ Deca XP Max với nguồn ESI Các hợp chất phân tách cột Kinetex C18 2,6 µm ( 150 x 4,6 mm) rửa giải gradient nồng độ 0,1% acid formic nước ( pha động A) 0,1% acid formic methanol ( pha động B) với dòng chảy tốc độ 0,45 ml/ phút Gradient nồng độ bắt đầu với 100% pha động A phút, sau giảm xuống 90% pha động A 10 phút, 60% 25 phút, 35% 15 phút 15% 41 phút giữ thêm 15 phút Nhiệt độ mao quản 3250C, dịng khí vỏ bọc 8; điện áp nguồn, dòng điện điện áp mao quản 4,5 kV, 80 µA 7V Nồng độ gallic acid định lượng cách sử dụng điểm dựng thành đường chuẩn nồng độ gallic acid biết dạo động từ 6- 100 mg/L với hệ số trung bình R2 0,994 ± 0,002 2.2.2.5 Phân tích số liệu Tất thí nghiệm thực lặp lại lần so sánh cách sử dụng thống kê HSD Turkey test, trừ thí nghiệm lặp lại hai lần sử dụng kiểm định hai phía ( two-tailed t-test) Phân tích thống kê cũ thực thơng qua gói phần mềm thống kê JMP ( NC, Hoa Kỳ) Các giá trị báo cáo độ lệch chuẩn trung bình 2.3 Kết 2.3.1 Q trình tiêu hóa nước xồi đường miệng in vitro tác dụng tannase gallotannin xồi protein nước bọt Mơ hình hóa giai đoạn tiêu hóa đường miệng bao gồm nước bọt thường bị bỏ qua mơ hình tiêu hóa ống nghiệm, điều dẫn đến việc đánh giá 24 mức khả tiếp cận sinh học polyphenol tương tác polyphenol-protein (Obreque-Slier et al., 2011) Người ta nghiên cứu xem việc bổ sung nước bọt q trình tiêu hóa miệng có làm giảm khả tiếp cận sinh học GA hay không Ở 0, GA thấp đáng kể (P