Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩmNghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩmNghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩmNghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩmNghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩmNghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩmNghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩmNghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩmNghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩmNghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm
LỜI CẢM ƠN Với tất chân thành biết ơn nhất, xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Xuân Sâm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TS Trần Thị Mai - Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ Sau thu hoạch tận tình hướng dẫn, động viên tinh thần cho tơi suốt thời gian làm luận án; cảm ơn Cô trang bị thêm cho em cách tiếp cận với phương pháp khoa học để em tự tin đường phía trước Tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô thuộc Viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội truyền tải cho em thêm nhiều kiến thức chuyên môn sâu cho góp ý q báu q trình học tập hoàn thiện nghiên cứu luận án Nhân dịp này, xin bày tỏ niềm tri ân tới Ban lãnh đạo Viện Cơ điện Nông nghiệp Công nghệ Sau thu hoạch, Bộ môn Nghiên cứu Công nghệ sinh học Sau thu hoạch bạn bè, đồng nghiệp, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho yên tâm học tập nghiên cứu Lúc đây, với tư cách người con, người vợ người mẹ, muốn gửi thật nhiều lời cảm ơn sâu sắc, tình cảm u thương vơ bờ tơi đến gia đình - nơi ln điểm tựa tinh thần vững tiếp sức cho suốt nghiệp phấn đấu Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2018 Nguyễn Thị Hồng Hà i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nêu luận án trung thực chưa tác giả khác công bố Nghiên cứu luận án có kế thừa đề tài ĐT.04.13/CNSHCB - Bộ Công thương đồng ý thành viên nhóm nghiên cứu Việc tham khảo nguồn tài liệu thực trích dẫn theo yêu cầu Hà Nội, ngày 19 tháng 10 năm 2018 GVHD Nguyễn Thị Xuân Sâm GVHD Trần Thị Mai ii Tác giả Nguyễn Thị Hồng Hà MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii DANH MỤC CÁC BẢNG viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ x CÁC PHỤ LỤC KÈM THEO xii MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 THÔNG TIN CHUNG VỀ GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL 1.1.1 Cấu tạo 1.1.2 Tính chất 1.1.3 Cơ chế tạo gel yếu tố ảnh hưởng tới trình tạo gel 1.1.4 Sphingomonas paucimobilis - nguồn sinh tổng hợp gellan 1.1.4.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 1.1.4.2 Cơ chế sinh tổng hợp gellan 1.1.4.2 Động học trình sinh trưởng tổng hợp gellan S paucimobilis 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL 11 1.2.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp gellan 11 1.2.1.1 Ảnh hưởng tuổi giống tỷ lệ giống 11 1.2.1.2 Ảnh hưởng thành phần môi trường lên men 11 1.2.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ, pH điều kiện cấp khí 14 1.2.1.4 Cải tạo chủng giống cho tăng khả sinh tổng hợp gellan 15 1.2.2 Thu hồi làm gellan từ dịch lên men 18 1.2.3 Chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl 20 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL 21 1.3.1 Ứng dụng tạo màng bảo quản trái 21 1.3.2 Ứng dụng chế biến thực phẩm 23 1.3.3 Ứng dụng lĩnh vực khác 25 1.4 VẤN ĐỀ CẦN NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN 26 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU VÀ TRANG THIẾT BỊ 29 2.1.1 Chủng giống, nguyên liệu chuối 29 2.1.2 Môi trường 29 2.1.3 Hóa chất 30 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ 30 iii 2.2 PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 31 2.2.1 Xác định hàm lượng gellan gellan khử acyl 31 2.2.2 Phân tích cấu trúc gellan gellan khử acyl (phổ MNR) 32 2.2.3 Xác định khối lượng phân tử gellan 33 2.2.4 Xác định mức độ deacyl hóa (ĐĐA) gellan khử acyl 34 2.2.5 Xác định độ bền gel gellan khử acyl 35 2.2.6 Xác định khả tạo gel với ion Ca+2 Na+ 35 2.2.7 Phân tích tiêu hóa lý vi sinh gellan 35 2.2.8 Xác định mật độ tế bào vi khuẩn 36 2.2.9 Xác định hàm lượng protein 36 2.2.10 Xác định hàm lượng màu carotenoid 36 2.2.11 Phương pháp xử lí số liệu 36 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.3.1 Nhân giống điều kiện bảo quản giống 36 2.3.2 Đánh giá khả sinh tổng hợp gellan S paucimobilis GL4 36 2.3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới khả sinh tổng hợp gellan chủng S paucimobilis GL12 37 2.3.3.1 Ảnh hưởng nguồn nitơ 37 2.3.3.2 Ảnh hưởng việc bổ sung axit amin 37 2.3.3.3 Ảnh hưởng việc bổ sung H2O2 37 2.3.4 Tối ưu hóa mơi trường sinh tổng hợp gellan cho chủng S paucimobilis GL12 38 2.3.5 Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan bình lên men 10 lít 40 2.3.5.1 Xác định tốc độ khuấy 40 2.3.5.2 Xác định thời gian thu gellan 40 2.3.6 Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men 40 2.3.6.1 Nghiên cứu kết tủa gellan dung môi hữu 40 2.3.6.2 Loại màu khỏi kết tủa gellan 41 2.3.7 Xác định điều kiện sấy, bảo quản chế phẩm gellan dạng bột 41 2.3.7.1 Sấy đối lưu kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột 41 2.3.7.2 Nghiên cứu lựa chọn bao bì 42 2.3.7.3 Xác định chế độ bảo quản 42 2.3.8 Nghiên cứu thu nhận gellan khử acyl 42 2.3.8.1 Xác định điều kiện phản ứng chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl 42 2.3.8.2 Xác định tỷ lệ dịch/ethanol cho kết tủa gellan khử acyl 43 2.3.8.3 Xác định hiệu suất sấy chế phẩm gellan khử acyl 43 2.3.8.4 Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl 43 2.3.9 Ứng dụng chế phẩm gellan tạo màng bao bảo quản chuối …………… 43 2.3.9.1 Xác định công thức dung dịch tạo màng gellan 44 iv 2.3.9.2 Xác định thông số công nghệ dung dịch tạo màng gellan 44 2.3.9.3 Đánh giá hiệu bảo quản màng 47 2.3.10 Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl sản xuất thạch dứa 48 2.3.10.1 Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho tạo gel thạch 48 2.3.10.2 Đánh giá hiệu bổ sung gellan khử acyl sản xuất thạch dứa 48 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 LỰA CHỌN CHỦNG CHO KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP GELLAN CAO 50 3.1.1 Đánh giá khả sinh tổng hợp gellan chủng S paucimobilis GL4 50 3.1.2 So sánh khả sinh tổng hợp gellan chủng S paucimobilis GL4 S paucimobilis GL12 53 3.2 NGHIÊN CỨU THU NHẬN GELLAN TỪ CHỦNG S PAUCIMOBILIS GL12 54 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến khả sinh tổng hợp gellan 54 3.2.1.1 Ảnh hưởng nitơ 54 3.2.1.2 Ảnh hưởng việc bổ sung axit amin 55 3.2.1.3 Ảnh hưởng việc bổ sung H2O2 56 3.2.1.4 Xác định thời gian lên men thích hợp cho thu nhận gellan 57 3.2.2 Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp gellan từ S paucimobilis GL12 58 3.2.3 Xác định điều kiện sinh tổng hợp gellan bình lên men 10 lít 61 3.2.3.1 Xác định tốc độ khuấy 61 3.2.3.2 Xác định thời gian thu hồi gellan 62 3.2.4 Nghiên cứu thu hồi gellan từ dịch lên men 63 3.2.4.1 Tiền xử lý dịch lên men ly tâm loại sinh khối 63 3.2.4.2 Nghiên cứu kết tủa gellan dung môi hữu 65 3.2.4.3 Loại màu khỏi kết tủa gellan 66 3.2.5 Sấy kết tủa gellan tạo chế phẩm dạng bột 68 3.2.6 Nghiên cứu xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan 70 3.2.6.1 Nghiên cứu lựa chọn bao bì thích hợp cho chế phẩm 70 3.2.6.2 Xác định điều kiện bảo quản 72 3.2.7 Đề xuất qui trình thu nhận gellan từ S paucimobilis GL12 74 3.3 CHUYỂN HÓA GELLAN THÀNH GELLAN KHỬ ACYL 76 3.3.1 Xác định điều kiện chuyển hóa gellan thành gellan khử acyl 76 3.3.1.1 Ảnh hưởng pH đến mức độ deacyl từ gellan 76 3.3.1.2 Ảnh hưởng thời gian phản ứng đến mức độ deacyl 78 3.3.2 Kết tủa gellan khử acyl ethanol 80 3.3.3 Sấy thu hồi chế phẩm gellan khử acyl 81 3.3.4 Bảo quản chế phẩm gellan khử acyl 82 3.3.5 Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm gellan khử acyl 83 3.4 ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG CÁC CHẾ PHẨM 85 3.4.1 Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S paucimobilis GL12 85 v 3.4.1.1 Xác định cấu trúc gellan 85 3.4.1.2 Xác định khối lượng phân tử gellan 87 3.4.1.3 Đánh giá tiêu hóa lý, kim loại nặng vi sinh vật gellan 88 3.4.2 Đánh giá chất lượng gellan khử acyl 90 3.4.2.1 Xác định cấu trúc gellan khử acyl 90 3.4.2.2 Đánh giá tiêu hóa lý, kim loại nặng vi sinh vật gellan khử acyl90 3.5 THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM GELLAN VÀ GELLAN KHỬ ACYL 91 3.5.1 Ứng dụng chế phẩm gellan tạo màng bao bảo quản chuối 91 3.5.1.1 Xác định hàm lượng gellan thích hợp cơng thức dung dịch tạo màng 91 3.5.1.2 Xác định thông số kỹ thuật màng bao gellan lựa chọn 93 3.5.1.3 Đánh giá hiệu bảo quản chuối màng bao gellan 93 3.5.2 Ứng dụng chế phẩm gellan khử acyl sản xuất thạch dứa 97 3.5.2.1 Xác định hàm lượng gellan khử acyl thích hợp cho công thức thạch 97 3.5.2.2 Đánh giá tiêu cảm quan sản phẩm thạch 98 3.5.2.3 Đánh giá tiêu an toàn thực phẩm sản phẩm thạch 100 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102 4.1 KẾT LUẬN 102 4.2 KIẾN NGHỊ 103 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 104 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký tự Chú thích ADN Axit deoxyribonucleic ADP Adenosine diphosphate AL/PE Màng nhôm PE Al-Foil Lá nhôm mỏng BOPP/PE Màng Biaxial Oriented Polypropylene PE Cp Centipoazo đơn vị tính độ nhớt CT Cơng thức ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm ĐĐA Mức độ deacyl ĐVTN Động vật thí nghiệm GFC Sắc ký lọc gel HDPE Polyethylene tỷ trọng cao MDPE Polyethylene tỷ trọng trung bình NMR Cộng hưởng từ hạt nhân Ny/PE Màng nylon PE PE Polyethylene PET Polyethylene terephthalate PVDC Polyvinylidende chloride TSS Chất rắn hòa tan tổng số vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Đặc điểm khác gellan gellan khử acyl Bảng 1.2 Ảnh hưởng chủng giống, nguồn dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp gellan 17 Bảng 1.3 Đặc điểm hiệu gellan 24 Bảng 2.1 Đặc tính gellan gellan khử acyl dùng làm mẫu chuẩn 30 Bảng 2.2 Thời gian liều lượng H2O2 khảo sát 38 Bảng 2.3 Các yếu tố mức yếu tố thí nghiệm tối ưu khả sinh tổng hợp gellan từ chủng S pausimobilis GL12 38 Bảng 2.4 Ma trận thực nghiệm tối ưu khả sinh tổng hợp gellan từ chủng S pausimobilis GL12 39 Bảng 2.5 Chỉ số màu chuẩn cho chuối 44 Bảng 2.6 Tỷ lệ thành phần công thức tạo dung dịch màng gellan 44 Bảng 2.7 Các tiêu đánh giá cảm quan chuối 46 Bảng 2.8 Phiếu cho điểm phép thử cảm quan 47 Bảng 2.9 Bảng điểm cảm quan sản phẩm thạch dứa 48 Bảng 2.10 Bảng mức chất lượng sản phẩm theo tổng số điểm trung bình thành viên hội đồng cảm quan 49 Bảng 3.1 So sánh khả sinh tổng hợp gellan hai chủng S paucimobilis GL4 S paucimobilis GL12 53 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nguồn nit đến khả sinh tổng hợp gellan S paucimobilis GL12 54 Bảng 3.3 Ảnh hưởng củ xit đến khả sinh tổng hợp gellan 56 Bảng 3.4 Ảnh hưởng việc bổ sung H2O2 tới khả tích lũy sinh khối gellan 57 Bảng 3.5 Kết ma trận thực nghiệm tối ưu khả sinh tổng hợp gellan từ chủng S pausimobilis GL12 59 Bảng 3.6 Kết phân tích phư ng s i Anov mơ hình 60 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nhiệt độ xử lý dịch lên men đến hiệu tách gellan khỏi tế bào vi khuẩn 64 Bảng 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ xử lý dịch tới khả loại protein khỏi dịch lên men 65 Bảng 3.9 Ảnh hưởng số lần kết tủa lặp lại đến hiệu suất thu hồi gellan khả loại màu 67 Bảng 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến hiệu suất chất lượng gellan thành phẩm 68 Bảng 3.11 Ảnh hưởng thời gian sấy đến hiệu suất thu hồi gellan 69 Bảng 3.12 Ảnh hưởng củ độ dày lớp vật liệu sấy đến hiệu suất thu hồi gellan 70 Bảng 3.13 Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan từ dịch lên men chủng S paucimobilis GL12 70 viii Bảng 3.14 Sự th y đổi độ ẩm độ nhớt gellan sau 06 tháng bảo quản 72 Bảng 3.15 Ảnh hưởng nhiệt độ bảo quản đến chất lượng sản phẩm gellan 73 Bảng 3.16 Các tiêu cảm quan, hóa lý vi sinh chế phẩm gell n trước sau bảo quản 06 tháng 73 Bảng 3.17 Ảnh hưởng pH xử lý tới mức độ deacyl gellan 78 Bảng 3.18 Xác định hiệu xuất sấy thu hồi gellan khử acyl 81 Bảng 3.19 Đánh giá hiệu suất thu hồi gellan khử acyl từ dịch lên men chủng S paucimobilis GL12 82 Bảng 3.20 Các tiêu cảm quan, hóa lý vi sinh chế phẩm gellan khử cyl trước sau bảo quản 06 tháng 82 Bảng 3.21 Kết phân tích chất lượng ATTP chế phẩm gellan 89 Bảng 3.22 Kết phân tích chất lượng sản phẩm gellan khử acyl 91 Bảng 3.23 Ảnh hưởng củ hàm lượng gellan công thức tạo màng đến hiệu bảo quản chuối 92 Bảng 3.24 Một số tiêu đặc tính hóa lý dung dịch tạo màng gellan 93 Bảng 3.25 Ảnh hưởng củ màng b o đến tiêu sinh lý chuối trình bảo quản 94 Bảng 3.26 Kết đánh giá chất lượng cảm quan chuối sau 18 ngày bảo quản 96 Bảng 3.27 Xác định tỉ lệ gellan khử acyl bổ sung thích hợp thành phần thạch 98 Bảng 3.28 Đánh giá tiêu cảm quan thạch dứa có bổ sung gellan 99 Bảng 3.29 Chỉ tiêu ATTP tính chất cảm quan thạch 101 ix DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc hóa học gellan (A) gellan khử acyl (B) Hình 1.2 C chế tạo gel gellan Hình 1.3 C chế tạo gel gellan có mặt cation Hình 1.4 C chế sinh tổng hợp gellan Hình 1.5 Động học trình STH gellan từ chủng S paucimobilis ATCC 31.461 10 Hình 1.6 S đồ chung thu nhận gellan từ dịch lên men 19 Hình 1.7 S đồ chung thu nhận gellan khử acyl từ gellan 20 Hình 2.1 Khuẩn lạc S paucimobilis GL12 (A) S paucimobilis GL4 (B) 29 Hình 2.2 Đường chuẩn gellan 32 Hình 2.3 Đường chuẩn gellan khử acyl 32 Hình 2.4 Phư ng pháp xác định độ nhớt thực 34 Hình 3.1 Ảnh hưởng nguồn nit tới khả sinh tổng hợp gellan S paucimobilis GL4 50 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ trypton tới khả sinh tổng hợp gellan S paucimobilis GL4 51 Hình 3.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon tới khả sinh tổng hợp gellan từ S paucimobilis GL4 52 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ glucose tới khả sinh tổng hợp gellan từ S paucimobilis GL4 52 Hình 3.5 Động học trình sinh tổng hợp gellan chủng S paucimobilis GL4 53 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ bột đậu tư ng đến khả sinh tổng hợp gellan S paucimobilis GL12 55 Hình 3.7 Ảnh hưởng tỷ lệ -threonine đến khả sinh tổng hợp gellan 56 Hình 3.8 Động học q trình sinh trưởng tích lũy gell n chủng S paucimobilis GL12 58 Hình 3.9 Bề mặt đáp ứng thể ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng gellan 60 Hình 3.10 Ảnh hưởng tốc độ khuấy tới khả tạo gellan 62 Hình 3.11 Động học trình sinh tổng hợp gellan chủng S paucimobilis GL12 hệ thống bình lên men sục khí 63 Hình 3.12 Ảnh hưởng loại dung môi tới hiệu suất thu hồi gellan 65 Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ dịch lên men/eth nol đến hiệu suất thu hồi gellan 66 Hình 3.14 Sự cải thiện màu sắc kết tủa gellan qua lần kết tủa lặp lại 67 x ... nghiên cứu ứng dụng chúng Do vậy, đề tài ? ?Nghiên cứu thu nhận gellan từ Sphingomonas paucimobilis định hướng ứng dụng công nghiệp thực phẩm? ?? lựa chọn khuôn khổ luận án Mục tiêu nghiên cứu - Xây... trình thu nhận gellan từ chủng S paucimobilis lựa chọn - Xây dựng qui trình thu nhận gellan khử acyl từ dịch lên men gellan chủng S paucimobilis lựa chọn - Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm gellan. .. Xác định điều kiện bảo quản chế phẩm gellan khử acyl - Đề xuất quy trình thu nhận gellan khử acyl Đánh giá chất lƣợng chế phẩm gellan - Đánh giá chất lượng chế phẩm gellan từ S paucimobilis - Đánh