Nghiên cứu tách dòng gen sh2 từ dòng ngô h14 và thiết kế vector chuyển gen pcambia 1301 ubi sh2

BÁO CÁO THÍ NGHIỆM TIN SINH HỌC GVHD: GS.TS Nguyễn Văn Cách ĐỀ TÀI Nghiên cứu tách dòng gen Sh2 từ dòng ngô H14 thiết kế vector chuyển gen pCAMBIA 1301-Ubi-Sh2 TỔNG QUAN VỀ GEN SHRUNKEN (Sh2) • Gen Shrunken (Sh2) chứng minh gen mã hoá cho tiểu phần lớn enzyme ADP-glucosse pyrophosphorylase nội nhũ, enzyme tham gia vào trình tổng hợp tinh bột nội nhũ • Đoạn gen nghiên cứu chuyển thành công vào ngô làm tăng hàm lượng tinh bột lên đáng kể so với đối chứng khơng chuyển gen • Với mục tiêu tạo dịng ngơ có suất, chất lượng cao, tiến hành nghiên cứu, tách dòng gen Sh2 thiết kế vector phục vụ việc chuyển gen Sh2 vào số dịng ngơ trồng Việt Nam CÁC BƯỚC TÁCH DỊNG GEN • Truy cập trang NCBI, vào mục Nucleotide, tìm kiếm Shrunken • Hiện hàng loạt kết quả, ta chọn số kết đối tượng sinh vật chứa gen mà gần gũi với đối tượng ta tìm kiếm • Từ đó, ta chọn đối tượng ZEA MAYS (NGƠ) ARABIDOPSIS THALIANA (MỘT LỒI CÂY CĨ HOA NHỎ THUỘC HỌ CẢI) BRASSICA NAPUS (CẢI DẦU) • • Truy cập chương trình Clustal Omega, tìm vùng tương đồng đối tượng kể Chọn vùng bảo thủ để thiết kế mồi • • Truy cập Primer – Blast để thiết kế mồi Điền thông tin cần thiết để chạy chương trình • Chạy chương trình tìm cặp mồi • Chọn cặp mồi cho sản phẩm có chiều dài gần với chiều dài đoạn gen Sh2 • Sử dụng chương trình SMS PCR để chạy PCR ảo tạo sản phẩm PCR ảo • Chạy chương trình Blast nhằm tìm kiếm chuỗi tương đồng với chuỗi kiểm tra • Khai thác thơng tin đặc điểm, đặc tính biết chuỗi ngân hàng để dự đốn đặc tính chuỗi kiểm tra PHƯƠNG ÁN TÁCH DỊNG GEN • Thiết kế mồi chương trình Primer Blast dựa trình tự gen Sh2 • Đoạn gen sau gắn vào vector tách dịng pBT tạo plasmid tái tổ hợp sử dụng T4 DNA ligase Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E Coli DH5α bằng phương pháp α phương pháp sốc nhiệt • Các dịng khuẩn chọn lọc PCR clony sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhân Sh2 Các vi khuẩn sau chọn lọc có chứa đoạn gen mục tiêu nuôi môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 mg/ml tách plasmid tái tổ hợp • Plasmid cắt kiểm tra enzyme cắt giới hạn BamHI SacI • Gen Sh2 từ dịng ngơ H14 sau gắn với cấu trúc vector biểu pCambia1301 với promotor Ubiquitin (Ubi) tách dòng để tạo vector chuyển gen mang gen Sh2: pCambia1301-Ubi-Sh2 • Để làm việc này, enzyme BamHI SacI sử dụng để cắt đồng thời vector tách dòng pBT-Sh2 vector pCambia 1301 gắn gen Sh2 vào vector pCambia 1301 T4 DNA ligase để tạo plasmid pCambia 1301-Sh2 biến nạp vào vi khuẩn E Coli DH5α bằng phương pháp α ni mơi trường LB đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycin 5α bằng phương pháp mg/ ml • Các dịng vi khuẩn kiểm tra có mặt đoạn gen Sh2 PCR clony Cấu trúc pCambia 1301-Sh2 sau gắn thêm promoter Ubi cho việc tạo cấu trúc biểu pCambia 1301-Ubi-Sh2 việc sử dụng enzyme BamHI PstI cắt đồng thời hai cấu trúc vector pCambia1301-Sh2 cấu trúc pBT-Ubi gắn pCambia 1301-Sh2 vơi promoter Ubi enzyme T4 DNA ligase để tạo vector tái tổ hợp pCambia 1301- UbiSh2 phục vụ chuyển gen Cấu trúc biến nạp vào vi khuẩn E Coli DH5α bằng phương pháp α Sau kiểm tra có mặt PCR clony cắt kiểm tra enzyme giới hạn PstI BamHI, cấu trúc pCambia 1301- Ubi- Sh2 chuyển vào dòng vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens EHA105α bằng phương pháp C5α bằng phương pháp phương pháp xung điện để phục vụ cho mục đích chuyển gen • Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1%, gen Sh2 nhân thành cơng? • Sau gen Sh2 gắn vào vector tách dòng pBT biến nạp vào vi khuẩn E coli DH5α bằng phương pháp , điện di sản phẩm clony PCR cho thấy dịng khuẩn có kích thước tương ứng với đoạn gen mục tiêu • Kết luận dịng khuẩn mang plasmid chứa đoạn gen có kích thước phù hợp với đoạn gen mong muốn gen Sh2 tách dịng thành cơng  ...ĐỀ TÀI Nghiên cứu tách dòng gen Sh2 từ dòng ngô H14 thiết kế vector chuyển gen pCAMBIA 1301- Ubi -Sh2 TỔNG QUAN VỀ GEN SHRUNKEN (Sh2) • Gen Shrunken (Sh2) chứng minh gen mã hoá cho... BamHI SacI • Gen Sh2 từ dịng ngơ H14 sau gắn với cấu trúc vector biểu pCambia1 301 với promotor Ubiquitin (Ubi) tách dòng để tạo vector chuyển gen mang gen Sh2: pCambia1 301 -Ubi -Sh2 • Để làm... sử dụng để cắt đồng thời vector tách dòng pBT -Sh2 vector pCambia 1301 gắn gen Sh2 vào vector pCambia 1301 T4 DNA ligase để tạo plasmid pCambia 1301 -Sh2 biến nạp vào vi khuẩn E Coli DH5α bằng