ĐH Y Dược TP TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN INH HỌC PHÂN TỬ CƠ SỞ DƯỢC Tên chuyên đề Kỹ thuật ADN Array Học viên TH Phạm Đoàn Bảo Châu Trần Duy Cường Ph[.]
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN INH HỌC PHÂN TỬ CƠ SỞ DƯỢC Tên chuyên đề: Kỹ thuật ADN Array Học viên TH: Phạm Đoàn Bảo Châu Trần Duy Cường Phan Thị Diệp Lớp: 22MDS1A 2023 MỤC LỤC Danh mục từ viết tắt Tóm tắt CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG II TỔNG QUAN II.1 DNA II.2 ARN II.2.1 Protein II.2.2 Microarrays II.2.2.1 Chất II.2.2.2 Chế tạo CHƯƠNG III NỘI DUNG III.1 DNA microarray III.2 Cơ chế hoạt động III.3 Phát phân tích liệu III.4 Ứng dụng microarray III.5 DNA microoarray để chuẩn đoán rối loạn di truyền III.6 Phát bất thường nhiễm sắc thể III.7 Phát đột biến gây bệnh III.8 Phát thay đổi đa hình 10 10 11 12 12 12 13 14 15 15 16 17 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN 17 Tài liệu tham khảo 19 Danh mục từ viết tắt Chữ viết tắt Nghĩa tiếng anh Nghĩa tiếng việt CCD Charge-coupled device Thiết bị kết nối sạc TIFF Tagged Image File Format Định dạng tệp hình ảnh gắn thẻ PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi Polymerase BRCA1 Gen ức chế khối u BRCA2 Gen ức chế khối u SNP SSCP CE HNPP LASIK CAH Single nucleotide polymorphism Đa hình nucleotide đơn Single strand conformation polymorphis Đa hình cấu trúc sợi đơn Capillary Electrophoresis Điện di mao quản Hereditary neuropathy with liability to pressure palsies Bệnh bại liệt Laser-Assisted in situ Phẫu thuật điều chỉnh thị Keratomileusis giác laser Congenital Adrenal Hyperplasia Bệnh tình trạng rối loạn hormon vỏ thượng thận gây Tóm tắt Trong nghiên cứu sinh học y học kết hợp cuối phân tử bề mặt trình chuyển đổi quan trọng, thúc đẩy hai yếu tố chính: gia tăng lớn lượng thơng tin trình tự DNA phát triển công nghệ để khai thác việc sử dụng nó Do đó, thấy thời điểm mà loại thử nghiệm có thể thực Các quan sát, phân tích khám phá thực quy mô chưa từng có Trong vài năm qua, 30 sinh vật có gen hoàn chỉnh, với khoảng 100 sinh vật khác tiến hành Ít phần trình tự thu hàng chục nghìn gen chuột nhắt, chuột cống người, trình tự toàn hai nhiễm sắc thể người (nhiễm sắc thể 21 22) xác định Trong vòng năm, phần lớn gen người giải mã, cả nỗ lực công tư, trình tự hồn chỉnh chuột gen động vật thực vật khác chắc chắn theo sát phía sau Thật khơng may, hàng tỷ sở trình tự DNA khơng cho biết tất cả gen làm gì, tế bào hoạt động thế nào, tế bào hình thành sinh vật thế nào, bệnh tật diễn thế nào, già thế làm thế để phát triển loại thuốc Đây nơi gen chức phát huy tác dụng Mục đích gen để hiểu sinh học, không đơn giản xác định phận cấu thành, phương pháp thử nghiệm tính tốn tận dụng nhiều thơng tin trình tự tốt Theo nghĩa này, gen chức không phải dự án chương trình cụ thể mà tư cách tiếp cận chung vấn đề Mục tiêu không đơn giản cung cấp danh mục tất cả gen thơng tin chức chúng, mà cịn để hiểu cách thức thành phần hoạt động để tạo nên tế bào sinh vật hoạt động Để tận dụng tối đa khối thông tin trình tự lớn tăng nhanh, cần phải có công nghệ Trong số công cụ mạnh mẽ linh hoạt cho gen mảng oligonucleotide mật độ cao DNA bổ sung Mảng acid nucleic hoạt động cách lai RNA DNA đánh dấu dung dịch với phân tử DNA gắn vị trí cụ thể bề mặt Trên thực tế, lai tạo mẫu thành mảng tìm kiếm song song cao từng phân tử xác định quy tắc nhận biết phân tử Mảng acid nucleic sử dụng cho thử nghiệm sinh học nhiều năm Theo truyền thống, mảng bao gồm đoạn DNA, thường có trình tự khơng xác định, phát màng xốp (thường nylon) Các đoạn DNA sắp xếp theo mảng thường đến từ thư viện cDNA, DNA gen plasmid vật liệu lai thường đánh dấu nhóm phóng xạ Gần đây, việc sử dụng thủy tinh làm chất phát huỳnh quang để phát hiện, với phát triển công nghệ để tổng hợp lắng đọng acid nucleic phiến kính với mật độ cao, cho phép thu nhỏ mảng acid nucleic đồng thời tăng lên hiệu quả thử nghiệm nội dung thông tin Mặc dù việc tạo mảng với vài trăm phần tử cho đến gần thành tựu kỹ thuật quan trọng, mảng với 250.000 đầu dò oligonucleotide khác 10.000 cDNA khác centimet vuông có thể tạo với số lượng đáng kể Mặc dù có thể tổng hợp gửi đoạn DNA có trình tự chưa biết, cách triển khai phổ biến thiết kế mảng dựa thơng tin trình tự cụ thể, q trình đơi gọi tải gen vào chip Có số biến thể kỹ thuật bản này: phản ứng lai hóa có thể điều khiển (ví dụ, điện trường); phương pháp phát khác" huỳnh quang có thể sử dụng; bề mặt có thể làm vật liệu khác thủy tinh nhựa, silicon, vàng, gel màng, chí có thể bao gồm hạt đầu sợi quang Tuy nhiên, yếu tố phép lai song song với mẫu dò acid nucleic liên kết bề mặt, cục việc đếm phân tử liên kết, mảng acid nucleic mật độ cao kính (thường gọi microarray DNA, mảng oligonucleotide, mảng Gene Chip, đơn giản chip) công dụng sinh học chúng trọng tâm đề tài CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ Số lượng bệnh tật ngày tăng người, cả mắc phải di truyền, coi phần dựa thay đổi trình tự DNA Đối với hầu hết bệnh, di truyền mắc phải có thể phức tạp đa gen Những nỗ lực Dự án gen người nhằm làm sáng tỏ tảng di truyền cấu trúc cách xác định vị trí nhiễm sắc thể tổ chức gen khoảng 30.000 đến 35.000 gen người gần hoàn tất [33] Cho đến gần đây, nghiên cứu di truyền chức nhìn chung có phạm vi hạn chế, có thể làm sáng tỏ vai trò một vài gen thời điểm hệ thống Theo truyền thống, thông tin tính đặc hiệu phong phú tương đối sản phẩm biểu thu thập kỹ thuật thử nghiệm lai tạo RNA Northern blot thử nghiệm bảo vệ ribonuclease Các phương pháp tinh vi chút, chẳng hạn hiển thị vi phân [18] Phân tích nối tiếp biểu gen, [32] sử dụng để sàng lọc số lượng lớn dòng DNA bổ sung (cDNA) Tuy nhiên, hạn chế kỹ thuật khiến kỹ thuật không có lợi cho khảo sát di truyền quy mô lớn Để đạt mục tiêu này, công nghệ mạnh mẽ xuất hiện, sử dụng phép lai với mảng nucleotide, gọi chip gen [19, 27] Sự giao thoa công nghệ sinh học máy tính cho phép sàng lọc đồng thời số lượng lớn gen đáng tin cậy có thể tuân theo quy trình tự động hóa Sức mạnh chip nằm khả nghiên cứu biểu so sánh người bệnh người bình thường Các mẫu ghi lại thay đổi giai đoạn khác trình tự nhiên bệnh để đáp ứng với điều trị Nó cung cấp cho nhà nghiên cứu kho vũ khí để phân tích chế bệnh lý bản quy mô lớn để xem xét sở lý luận khái niệm trị liệu CHƯƠNG II TỔNG QUAN II.1 DNA DNA chứa đựng thông tin di truyền dạng acid deoxyribonucleic Kích thước thành phần trình tự gen xác định hình thức chức sinh vật Nói chung, độ phức tạp gen tỷ lệ thuận với độ phức tạp sinh vật Các sinh vật tương đối đơn giản vi khuẩn có gen phạm vi 1-5 triệu (megabase) gen động vật có vú bao gồm cả người khoảng 3000 megabase; gen từ sinh vật có độ phức tạp trung bình giun côn trùng thường 100-200 megabase Bộ gen thường chia thành phân đoạn riêng biệt gọi nhiễm sắc thể Vi khuẩn Escherichia coli (E coli) chứa nhiễm sắc thể hình trịn nhất, nấm men Saccharomyces cerevisiae chứa 16 nhiễm sắc thể tuyến tính Bộ gen người bao gồm 23 nhiễm sắc thể thường nhiễm sắc thể giới tính cho 24 nhiễm sắc thể người chứa tất cả 3000 megabase DNA gen tồn dạng polyme sợi kép chứa bốn base DNA (A, G, C T) buộc vào khung glucose-phosphate (Bảng 1) Thứ tự base dọc theo DNA gọi trình tự DNA Trình tự gen, gọi gen cấu trúc, cung cấp thơng tin trình tự cho ngành cơng nghiệp chip sinh học Hai chuỗi DNA giữ với liên kết hydro tương tác base bổ sung mạch Cấu trúc hóa học bazơ cho A tương tác với T (chứ không phải với base khác) G tương tác với C (chứ không phải với base khác) Cấu trúc sợi kép vốn có DNA độ xác tương tác bắt cặp sở có thể khai thác trình gọi lai tạo Lai tạo trình đó hai chuỗi acid nucleic đơn sợi bổ sung tạo thành chuỗi xoắn kép ổn định Phản ứng lai hóa có thể xảy hai phân tử bổ sung dung dịch phân tử dung dịch phân tử bổ sung cố định giá đỡ vững chắc Vì thử nghiệm chip DNA sử dụng phản ứng lai phân tử huỳnh quang sợi đơn trình tự sợi đơn bề mặt chip, nên lai tạo trình sinh hóa mà tồn ngành cơng nghiệp microarray DNA dựa vào đó Bộ gen sinh vật chứa cả vùng mã hóa mã hóa protein (Bảng 1) đó bao gồm exon intron, vùng khởi động điều hòa gen, nguồn gốc chép, telomere DNA liên gen khơng hoạt động Phân tích gen có thể cung cấp phép đo định lượng số lượng bản gen số lượng nhiễm sắc thể thể bội, diện khác biệt base đơn lẻ trình tự DNA Những thay đổi bản di truyền thường gọi đa hình, thay đổi có vòng đời sinh vật thường gọi đột biến Theo quan điểm đó, phân tích gen cung cấp tranh chi tiết tiềm di truyền sinh vật cách phác họa trình tự nucleotide xác tất cả gen vùng điều hịa gen Phân tích gen cấp độ DNA khơng, nhiên, khơng cung cấp thước đo biểu gen, trình tổng hợp bản RNA protein trình tự mã hóa Tuy nhiên, không cung cấp thước đo biểu gen, trình tổng hợp bản RNA protein trình tự mã hóa Bảng Nội dung thông tin gen Thông tin DNA RNA Protein Thiết kế di truyền Hồn chỉnh Khơng hồn chỉnh Khơng hồn chỉnh Đại diện gen a 100% 3% 3% Loại Mã hóa không Mã hóa Mã hóa mã hóa Dạng Sợi kép Đơn sợi Cuộn gập Thành phần Nucleic acid Nucleic acid Amino acid Lai tạo Có Có Không Base A,G,T,C A,G,C,U Không áp dụng Bội thể b Có Có Có Phiên mã b Không Có Có Tịnh tiến Không Không Có Biến đổi sinh hóa Methyl hóa Polyadenyl hóa Acyl hóa Phosphoryl hóa Thử nghiệm micoarray a Con người b Loại trừ hiệu ứng Có Có Không c phụ c Đã công bố II.2 ARN Bộ gen DNA bao gồm vùng chức rời rạc gọi gen Bộ gen sinh vật đơn giản vi khuẩn chứa 1000-3000 gen [7] Trong gen người ước tính chứa 50.000-100.000 gen [33] Các sinh vật đa bào bao gồm nấm men, ruồi giun chứa 5000-25000 gen [33] Biểu gen trình RNA thông tin (mRNA) cuối protein tổng hợp từ khuôn mẫu DNA gen mRNA phân tử sợi đơn bao gồm bốn sở DNA buộc vào xương sống glucose- phosphate (Bảng 1) Phần gen biểu diễn dạng mRNA gọi trình tự mã hóa cho gen đó Khoảng 3% gen người dạng trình tự mã hóa Bởi mRNA bản xác vùng mã hóa DNA, phân tích mRNA có thể sử dụng để xác định tính đa hình vùng mã hóa DNA; quan trọng hơn, phân tích gen cấp độ mRNA có thể sử dụng thước đo biểu gen Mức độ biểu gen quyết định mặt sinh lý kết hợp yếu tố di truyền môi trường Các yếu tố di truyền xác định hoạt động biểu gen bao gồm trình tự DNA xác vùng điều hòa gen vùng khởi động, vùng tăng cường vị trí nối Do đó, tính đa hình DNA cho đóng góp số khác biệt biểu gen cá thể loài Mức độ biểu bị ảnh hưởng số lượng lớn yếu tố môi trường, bao gồm nhiệt độ, căng thẳng, ánh sáng tín hiệu khác, dẫn đến thay đổi mức độ hormone chất báo hiệu khác Vì lý này, phân tích RNA cung cấp thơng tin khơng tiềm di truyền sinh vật, mà thay đổi động trạng thái chức Mỗi tế bào người có thể xem đơn vị chức chứa 50.00010.0000 biến gen, mà mức độ biểu chúng quyết định trạng thái chức tế bào [33] Đối với hầu hết gen, mức mRNA trạng thái ổn định xấp xỉ mức protein đó, việc theo dõi biểu định lượng cấp độ mRNA cung cấp manh mối quan trọng chức Giả thuyết nhiều tất cả bệnh người có thể kèm với thay đổi cụ thể biểu gen [24] tạo nhiều mối quan tâm việc theo dõi biểu gen cấp độ toàn bộ gen Việc dễ dàng thu mẫu dò huỳnh quang từ mRNA dễ dàng mà mẫu dò có thể phân tích xét nghiệm dựa lai tạo [24] đưa việc theo dõi mRNA trở thành hoạt động bật gen chức II.2.1 Protein Bước thứ hai biểu gen tổng hợp protein từ mRNA Một protein mã hóa mARN cho ba nucleotide mARN mã hóa acid amin chuỗi polypeptide Do đó, mARN 999 nucleotide tạo thành protein có 333 axit amin, với thứ tự tuyến tính nucleotide biểu diễn dạng chuỗi acid amin tuyến tính Sau tổng hợp, protein có cấu trúc ba chiều xác định chủ ́u trình tự acid amin Sau gấp lại, protein truyền đạt hướng dẫn chức gen cách thực loạt hoạt động sinh hóa bao gồm vai trò điều hòa gen, chuyển hóa, tế bào cấu trúc chép DNA Các cá thể quần thể dự kiến có khác biệt hoạt động protein tính đa hình làm thay đổi trình tự acid amin protein gây nhiễu mức protein trạng thái ổn định cách thay đổi biểu gen Tương tự mức độ mRNA, mức độ protein có thể thay đổi để đáp ứng với thay đổi môi trường Hơn nữa, mức protein chịu kiểm soát tịnh tiến sau dịch mã không ảnh hưởng trực tiếp đến mức độ mRNA (Bảng 1) Do đó, hiểu hoạt động protein địi hỏi thơng tin ngồi thu cách nghiên cứu DNA RNA (Bảng 1) Một mức độ kiểm soát sau dịch mã quan trọng liên quan đến biến đổi cộng hóa trị protein, theo đó nhóm thế có trọng lượng phân tử nhỏ phosphate, nhóm acyl nhóm tương tự gắn enzym vào chuỗi bên acid amin (Bảng 1) Biến đổi cộng hóa trị có thể làm thay đổi sinh hóa chịu kiểm soát tịnh tiến sau dịch mã không ảnh hưởng trực tiếp đến mức độ mRNA (Bảng 1) Biến đổi cộng hóa trị có thể làm thay đổi hoạt động sinh hóa protein đó làm thay đổi trạng thái chức tế bào Bởi protein cuối truyền đạt hướng dẫn gen, nên việc đánh giá hoạt động protein trọng tâm để hiểu chức gen Tuy nhiên, không giống DNA RNA, hoạt động protein đo phân tích lai (Bảng 1) Thơng lượng cao, phân tích protein song song với microarrays đặt thách thức kỹ thuật ghê gớm mà cho đến chứng minh khó nắm bắt 10 II.2.2 Microarrays II.2.2.1 Chất Các thử nghiệm lai tạo truyền thống phát triển vào năm 1970 sử dụng màng dẻo nitrocellulose nylon Ngược lại, thí nghiệm microarray biochip sử dụng bề mặt rắn thủy tinh có ghi nhãn phát huỳnh quang So với định dạng vĩ mô thí nghiệm dựa lọc, định dạng chip sinh học thu nhỏ thể cách mạng bản phân tích sinh học Một lợi thế định dạng chip bề mặt rắn không xốp cho phép lắng đọng lượng nhỏ vật liệu sinh hóa vị trí xác định xác Hình Thử nghiệm microarray Nguồn: Mark schena (2002).DNA Microarrays Oxford University Press 1999, United States [24] Chất xốp nylon nitrocellulose cho phép khuếch tán vật liệu ứng dụng không phù hợp với microarray Chất không xốp ngăn chặn hấp thụ thuốc thử mẫu vào chất nền, cho phép loại bỏ nhanh chóng hợp chất hữu huỳnh quang trình chế tạo sử dụng chip sinh học Bề mặt không xốp cho phép sử dụng thể tích mẫu nhỏ (Hình 2), cho phép nồng độ mẫu cao động học lai hóa nhanh Chất rắn cung cấp bề mặt đính kèm đồng làm tăng chất lượng phần tử mảng (Hình 2) Độ phẳng vốn có định dạng microarray cho phép tính song song (Hình 1), điều không có tất cả thử nghiệm dựa lọc (Hình 2) Phân tích song song giúp tăng đáng kể độ xác liệu thử nghiệm 11 Hình So sánh Thử nghiệm lọc Microarray Nguồn: Mark schena (2002).DNA Microarrays Oxford University Press 1999, United States [24] II.2.2.2 Chế tạo Microarrays Định dạng chip sinh học tương thích với nhiều cơng nghệ chế tạo tiên tiến đó có thể sản xuất tự động [24] Ba cơng nghệ sử dụng sản xuất microarray bao gồm quang khắc phun mực, vi điểm học dẫn xuất chúng Mỗi công nghệ có ưu điểm nhược điểm cụ thể chế tạo chip sinh học, không có công nghệ số tương thích với chất khơng xốp sử dụng thử nghiệm lai tạo truyền thống Phương pháp quang khắc dựa việc sử dụng công nghệ bán dẫn môi trường chip sinh học Mặt nạ quang định hướng trình tổng hợp DNA pha rắn, xác định theo không gian thông qua việc sử dụng ánh sáng để kích hoạt phiên bản phosphoramidite biến đổi bốn sở DNA để tổng hợp DNA [24] Mỗi bước kết nối dẫn đến việc bổ sung sở vào chuỗi phát triển 12 CHƯƠNG III NỘI DUNG III.1 DNA microarray DNA microarray công cụ sử dụng để xác định xem DNA cá nhân cụ thể có chứa đột biến gen hay không Các nhà khoa học biết đột biến thay đổi DNA gen cụ thể có thể góp phần gây bệnh đó Tuy nhiên, có thể khó phát triển thử nghiệm để phát đột biến này, hầu hết gen lớn có nhiều vùng có thể xảy đột biến Ví dụ, nhà nghiên cứu tin đột biến gen BRCA1 BRCA2 gây 60% trường hợp ung thư vú ung thư buồng trứng di truyền Nhưng không có đột biến cụ thể chịu trách nhiệm cho tất cả trường hợp Các nhà nghiên cứu phát 800 đột biến khác BRCA1 Microarray DNA công cụ sử dụng để xác định xem DNA cá nhân cụ thể có chứa đột biến gen BRCA1 BRCA2 hay không Con chip bao gồm thủy tinh nhỏ bọc nhựa Một số công ty sản xuất microarray phương pháp tương tự phương pháp sử dụng để tạo vi mạch máy tính Nhìn bề ngồi, chip chứa hàng nghìn trình tự DNA sợi đơn, tổng hợp, ngắn, tạo nên gen bình thường đề cập biến thể (đột biến) gen đó tìm thấy quần thể người III.2 Cơ chế hoạt động Để xác định xem cá nhân có đột biến bệnh cụ thể hay không, trước tiên, nhà khoa học lấy mẫu DNA từ máu bệnh nhân mẫu đối chứng - mẫu không chứa đột biến gen quan tâm Sau đó, nhà nghiên cứu làm biến tính DNA mẫu - trình tách hai chuỗi DNA bổ sung thành phân tử chuỗi đơn Bước tiếp theo cắt sợi DNA dài thành đoạn nhỏ hơn, dễ quản lý sau đó dán nhãn cho từng đoạn cách gắn thuốc nhuộm huỳnh quang (có nhiều cách khác để thực việc này, phương pháp phổ biến) DNA cá nhân dán nhãn thuốc nhuộm màu xanh DNA đối chứng bình thường dán nhãn thuốc nhuộm màu đỏ Cả hai DNA dán nhãn sau đó đưa vào chip cho phép lai - liên kết - với DNA tổng hợp chip 13 Nếu cá nhân không có đột biến gen, cả mẫu màu đỏ màu xanh liên kết với trình tự chip đại diện cho trình tự khơng có đột biến (trình tự "bình thường") Nếu cá nhân đó có đột biến, DNA cá nhân đó khơng liên kết xác với trình tự DNA chip đại diện cho trình tự "bình thường" mà thay vào đó liên kết với trình tự chip đại diện cho DNA bị đột biến Hình Hoạt động DNA Microarray Nguồn: genome.gov III.3 Phát phân tích liệu Sau mẫu huỳnh quang phản ứng với microarray, vật liệu không liên kết bị rửa mẫu liên kết với từng phần tử chip hiển thị phát huỳnh quang Các thiết bị quét đồng tiêu camera CCD [24] sử dụng thành công để phát microarray Cấu hình phổ biến máy quét đồng tiêu sử dụng kích thích laser vùng nhỏ chất thủy tinh (~ 100 µm), cho tồn hình ảnh thu thập cách di chuyển chất thấu kính đồng tiêu chất hai kích thước Ánh sáng phát từ mẫu huỳnh quang vị trí tách khỏi ánh sáng khơng mong muốn cách sử dụng loạt gương, lọc thấu kính, ánh sáng chuyển đổi thành tín hiệu điện ống nhân quang (PMT) máy dò tương đương Tốc độ thu thập 14 liệu máy quét đồng tiêu (1-5 phút) nhanh nhiều so với kỹ thuật chụp phóng xạ tự động với lọc phóng xạ sử dụng thí nghiệm thông thường (từ đến mười ngày) Công nghệ phát huỳnh quang nhanh khía cạnh mang tính cách mạng cơng nghệ microarray Hình ảnh huỳnh quang với máy ảnh CCD sử dụng nhiều nguyên tắc giống máy quét đồng tiêu, chi tiết khác cả kích thích công nghệ phát Một điểm khác biệt hình ảnh dựa CCD thường liên quan đến chiếu sáng phát phần lớn chất Khả chụp trường tương đối lớn có lợi thế giai đoạn loại bỏ yêu cầu giai đoạn di động quang học, làm giảm chi phí đơn giản hóa thiết kế thiết bị Một khác biệt quan trọng khác máy quét tiêu điểm hệ thống phát dựa CCD hệ thống phát sau thường sử dụng nguồn ánh sáng có bước sóng liên tục đèn hồ quang, đó không cần sử dụng nhiều tia laser Khả lọc quang phổ phát xạ khó khăn hệ thống dựa CCD giúp giảm thiểu nhiễu chéo quang học kênh khác Sau phát xạ huỳnh quang từ microarrays chuyển thành đầu hệ thống phát hiện, tệp liệu (thường TIFF 16 bit) định lượng giải thích Việc định lượng thường thực cách đặt chồng lưới lên hình ảnh microarray tính tốn giá trị cường độ trung bình cho từng phần tử microarray phần mềm tự động Sau đó, giá trị cường độ có thể chuyển đổi thành đầu có liên quan mặt sinh học, chẳng hạn số lượng mRNA tế bào, cách so sánh yếu tố thử nghiệm kiểm soát có microarray định Biểu gen định lượng, kiểu gen kết quả đầu khác sau đó tương quan với trình tự gen biểu thị microarray có thể xác định mối quan hệ bậc cao mạng lưới đồng điều hòa điều hòa gen III.4 Ứng dụng microarray Các phương pháp tiếp cận dựa DNA microarray để khám phá dấu ấn sinh học áp dụng để nghiên cứu số bệnh mãn tính bao gồm tiểu đường [5], viêm khớp [6] bệnh tim mạch [20] Ví dụ, dấu ấn sinh học để chẩn đoán bệnh lupus ban đỏ hệ thống (và viêm khớp dạng thấp, rối loạn viêm tự miễn dịch mãn tính, có thể sàng lọc cách định hình biểu bạch cầu biểu gen khác biệt bạch cầu rõ ràng có liên quan đến lupus ban đỏ hệ thống viêm khớp dạng thấp Viêm xương khớp, bệnh thoái hóa khớp có thể bị nhầm lẫn với viêm khớp dạng thấp, có thể chẩn đoán cách sử dụng biểu bạch cầu [13] 15 III.5 DNA microoarray để chuẩn đoán rối loạn di truyền Rối loạn di truyền rõ ràng bất thường di truyền gây Nhiễm sắc thể bất thường đột biến chuỗi DNA hai loại rối loạn Loại thứ hai có thể gây thay đổi trình tự acid amin protein, thiếu sản xuất protein nối khác nhau, gây kiểu hình bệnh Ngồi thứ này, SNPs hóa manh mối quan trọng để theo dõi gen bệnh, đặc biệt gen gây phát triển bệnh giai đoạn khác đời Các phương pháp thông thường để phát đột biến bao gồm giải trình tự vật liệu khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase (PCR) dựa gel, đa hình độ dài đoạn giới hạn (RFLP) đa hình cấu trúc sợi đơn (SSCP) Các quy trình giải trình tự này, có hiệu quả, lại tốn nhiều thời gian công sức Để đáp ứng nhu cầu sàng lọc đột biến hiệu quả hơn, điện di gel nhạy cảm với cấu trúc (CSGE) [1, 17] điện di mao quản (CE) [3] sử dụng rộng rãi để sàng lọc số lượng lớn gen nhằm nghiên cứu biến thể trình tự bệnh di truyền Hơn nữa, DNA microarray phát triển áp dụng cho lĩnh vực chẩn đoán khác bao gồm tư vấn di truyền, sàng lọc đánh máy SNP Trong thực tế, kỹ thuật microarray cải tiến mang lại nhiều thuận lợi cho việc phân tích đột biến di truyền, đó việc tích lũy lượng lớn liệu diễn để sử dụng chúng chẩn đoán bệnh III.6 Phát bất thường nhiễm sắc thể Rối loạn di truyền có thể bất thường nhiễm sắc thể gây xóa chép nhiễm sắc thể, xóa chép phần nhiễm sắc thể đứt gãy, chuyển vị đảo đoạn nhiễm sắc thể Các bệnh bất thường nhiễm sắc thể gây bao gồm số loại hội chứng Down (liên quan đến nhiễm sắc thể 21), hội chứng Edwards (nhiễm sắc thể 18), hội chứng Patau (nhiễm sắc thể 13), hội chứng Turner (XO), hội chứng Klinefelter (XXY)… bất thường thể chất tinh thần chết, chí thai lưu Kang đồng nghiệp phát triển microarray DNA để phát bất thường nhiễm sắc thể gây rối loạn di truyền khác bao gồm hội chứng Down, hội chứng Patau, hội chứng Edward, hội chứng Turner, hội chứng Klinefelter, chậm phát triển alphathalassemia-16, bệnh thần kinh Charcot-Marie-Tooth 1A, Cri-du hội chứng -chat, bệnh thần kinh di truyền có liên quan đến bệnh bại liệt áp lực (HNPP), hội chứng Prader-Willi, hội chứng Rubinstein-Taybi, hội chứng Williams Wolf-Hirschhoryndrome (J.-J Kang 16 cộng 2007) Họ sử dụng chip nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn (chip BAC) để chẩn đoán bất thường nhiễm sắc thể III.7 Phát đột biến gây bệnh Các bệnh đơn gen phần lớn chia thành hai loại theo phân loại nguyên nhân gồm rối loạn trội lặn Loạn dưỡng giác mạc đột biến gen mã hóa BIG-H3 bệnh di truyền trội nhiễm sắc thể thường Nó bắt đầu với triệu chứng mờ trung tâm giác mạc kết thúc thị lực bệnh nhân già Trong trường hợp loạn dưỡng Avellino, đột biến dị hợp tử gây thị lực nghiêm trọng người già đi, đột biến đồng hợp tử gây thị lực hoàn toàn sớm nhiều Trong năm gần đây, bệnh có tỷ lệ lưu hành 1/340-1/1.000 Hàn Quốc (trong trường hợp dị hợp tử) ý nhờ phẫu thuật LASIK [2, 10, 14, 16, 26] Nếu bệnh nhân mắc chứng loạn dưỡng thể lồi Avellino dị hợp tử phẫu thuật LASIK, độ mờ khối mờ bắt đầu phát triển mạnh cuối dẫn đến thị lực sau năm [15] Một nhóm nhà khoa học phát triển microarray DNA để chẩn đoán bệnh loạn dưỡng giác mạc cách phát đột biến exon 12 BIG-H3 (S Y Lee cộng 2007 [37] Con chip tối ưu hóa với nhiều yếu tố khác để mang lại hiệu quả cao độ đặc hiệu độ nhạy: nồng độ đầu dị bắt giữ (100, 50, 30 10 µM), độ dài đầu dò bắt giữ nằm khoảng từ 11 đến 17 mers thời gian lai (1, 2, 3, 4, 24 giờ) Microarray DNA xác thực hiệu suất nó cách sử dụng mẫu máu 98 bệnh nhân, cho kết quả xác 100% Nói chung, đột biến dị hợp tử không gây bệnh Tuy nhiên, người mang gen bệnh điều hòa giãn mạch (AT), rối loạn gen lặn, cho thấy tuổi thọ giảm, nguy ung thư cao (đặc biệt ung thư vú) tăng độ nhạy cảm với xạ ion hóa [4, 28, 29] Thật không may, gen liên quan đến AT có kích thước lớn (khoảng 150 kb) khơng có đột biến phổ biến nên khó chẩn đoán AT [8, 9, 12, 36] Do đó, để xác định người mang dị hợp tử mắc rối loạn lặn tự phát, Cheung et al phát minh microarray cDNA thể dấu hiệu di truyền khác từ người mang đột biến dị hợp tử người bình thường (V G Cheung et al 2005) Bệnh Wilson (WD) gặp vấn đề tương tự khó khăn việc tìm kiếm phát đột biến gen liên quan đến WD (ATP7B) kéo dài 80 kb Do đó, việc phát triển phương pháp hiệu quả để phát đột biến WD cần thiết [11, 22, 23, 30, 31, 34] Lee cộng (S Y Lee cộng 17 2004) phát triển microarray DNA chẩn đoán để phát đột biến gây bệnh WD cách sử dụng thuật toán quét codon (COSA), tạo điều kiện thuận lợi cho thiết kế đầu dò oligonucleotide COSA phương pháp thiết kế mẫu dò đó mẫu dò đặc hiệu với alen thiết kế cách thay đổi ba bazơ liên tiếp trình tự codon gen liên quan đến bệnh Sử dụng phương pháp này, microarray DNA chế tạo để bao gồm tất cả 16 đột biến thay thế báo cáo gây WD Nó sử dụng để chẩn đốn thành cơng chín bệnh nhân WD, đồng thời phân biệt ba người bình thường Trong báo cáo khác, dụng cụ chẩn đoán tăng sản thượng thận bẩm sinh (CAH) phát triển Jin (D K Jin 2003) Ở người, CAH khiếm khuyết bẩm sinh phổ biến trình chuyển hóa (sinh tổng hợp cortisol) quan sát thấy với tần suất cao 10.000 Khi trẻ sơ sinh bị CAH bị muối, nhiễm toan tăng kali máu nước xảy trẻ sơ sinh cuối có thể tử vong trừ điều trị hormone thay thế steroid Vì vậy, chẩn đốn sớm quan trọng [21, 25, 35] Jin sử dụng đoạn cDNA song song gen 21-hydroxylase bình thường bệnh nhân (exon 1, intron exon 4) để phát đột biến điểm gen (D K Jin 2003) III.8 Phát thay đổi đa hình Những thay đổi đa hình (được gọi SNP) biến thể di truyền xảy với tần suất khoảng 1.000 sở gen SNPs có thể thể tính nhạy cảm cá nhân bệnh cụ thể Gần đây, nhiều nỗ lực thực để tìm dấu hiệu liên quan đến bệnh cách sử dụng SNP Những thay đổi đa hình (được gọi SNP) biến thể di truyền xảy với tần suất khoảng 1.000 sở gen SNPs có thể thể tính nhạy cảm cá nhân bệnh cụ thể Gần đây, nhiều nỗ lực thực để tìm dấu hiệu liên quan đến bệnh cách sử dụng SNP 18 ... ứng lai hóa có thể xảy hai phân tử bổ sung dung dịch phân tử dung dịch phân tử bổ sung cố định giá đỡ vững chắc Vì thử nghiệm chip DNA sử dụng phản ứng lai phân tử huỳnh quang sợi đơn trình... alphathalassemia-16, bệnh thần kinh Charcot-Marie-Tooth 1A, Cri-du hội chứng -chat, bệnh thần kinh di truyền có liên quan đến bệnh bại liệt áp lực (HNPP), hội chứng Prader-Willi, hội chứng Rubinstein-Taybi,... dựa lọc, định dạng chip sinh học thu nhỏ thể cách mạng bản phân tích sinh học Một lợi thế định dạng chip bề mặt rắn khơng xốp cho phép lắng đọng lượng nhỏ vật liệu sinh hóa vị trí xác định