Tuyển chọn, xác định điều kiện phù hợp và tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme laccase của chủng bvp 10 2

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ N«ng nghiÖp vµ ph¸t triÓn n«ng th«n KỲ 2 TH¸NG 10/2020 74 TUYỂN CHỌN, XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN PHÙ HỢP VÀ TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENZYME LACCASE CỦA CHỦNG BVP 10 2 Nguyễn Thị P[.]

KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TUYỂN CHỌN, XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN PHÙ HỢP VÀ TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENZYME LACCASE CỦA CHỦNG BVP 10.2 Nguyễn Thị Phương Mai1*, Nguyễn Tuấn Anh1, Bùi Nguyễn Minh Thu2 TÓM TẮT Enzyme laccase có khả xúc tác phản ứng chuyển hóa hợp chất phenol thành gốc quinin vào sau oxy hóa chúng thành quinon, phản ứng oxy hóa gắn liền với khử phân tử oxy tạo thành nước Chủng nấm mốc BVP 10.2 phân lập, tuyển chọn từ mẫu bùn thải số sở dệt nhuộm có tham gia xúc tác chất đặc hiệu Syringaldazine ABTS với hoạt độ enzyme laccase cao sau ngày nuôi cấy đạt 85,5 U/ml Enzyme laccase tổng hợp cao đạt 190 U/ml điều kiện môi trường với 2% tỷ lệ cấp giống ban đầu; 10 g/l glucose; 1,5 g pepton + 1,5 g (NH4)2SO4; 0,3 mM Veratryl alcohol, nồng độ CuSO4 250 µm, pH 6, máy lắc 350C với tốc độ lắc 200 vịng/phút Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme laccase nấm mốc BVP 10.2 nồng độ glucose 1,4%: Veratryl alcohol 0,04%, pH laccase tích lũy môi trường đạt 296 U/ml ngày nuôi cấy Từ khóa: Enzyme laccase, phân lập, tuyển chọn, điều kiện ni cấy sinh tổng hợp laccase, tối ưu hóa ĐẶT VẤN ĐỀ1 Laccase (EC 1.10.3.2, benzenediol: oxygen oxidoreductase) polyphenol oxidase có chứa nhiều nguyên tử đồng trung tâm hoạt động, tham gia vào liên kết chéo monomer, phân hủy polymer phân cắt vịng hợp chất thơm Enzyme laccase tham gia vào q trình oxy hóa chất kèm theo khử oxy thành nước [5] Tuy nhiên oxy hóa khử enzyme laccase nhỏ so với hợp chất không chứa phenol, enzyme laccase có khả oxy hóa cấu trúc khơng chứa nhóm phenol Nhờ đặc tính bật enzyme laccase mà ứng dụng nhiều lĩnh vực đời sống, kinh tế - xã hội công nghiệp thực phẩm, công nghiệp giấy, công nghiệp nhuộm, dệt may, xử lý môi trường,…[5] Gần đây, enzyme laccase sử dụng thiết kế cảm biến sinh học, nhiên liệu sinh học cơng cụ chẩn đốn y tế làm tác nhân xử lý sinh học để làm thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu số chất hóa học độc hại có đất Trong mơi trường, enzyme laccase có vai trị việc phân hủy lignin, axit humic tổng hợp hợp chất humic mới, Khoa Mơi trường, Trường Đại học Tài nguyên Môi trường Hà Nội * Email: ntpmai@hunre.edu.vn Trường Đại học Khoa học Công nghệ Hà Nội 74 có vai trị quan trọng chu trình tuần hồn cacbon, oxy hóa chất màu, thuốc nhuộm, chất thơm,…[6] Enzyme laccase phân bố rộng rãi tự nhiên loại thực vật, nấm mốc vi khuẩn Laccase từ thực vật nghiên cứu từ Rhus vernicifera (ở sơn mài Nhật Bản) vào năm 1883 [11] Sau đó, nghiên cứu nhiều loại thực vật khác Ficus racemosa L (cây sung), Weeping willow (cây thùy dương), Nicotiana tabacum (cây thuốc lá) Prunus persica (cây đào) Ngoài nguồn enzyme laccase từ thực vật, enzyme laccase nấm enzyme ngoại bào có chứa nhiều nguyên tử đồng xúc tác phản ứng oxy hoá, tham gia chủ yếu vào trình phân giải lignin Đây đặc điểm bật laccase nấm đảm thuộc họ Basidiomycetes Một số loại nấm đảm nghiên cứu kỹ đặc tính khả sinh tổng hợp laccase tự nhiên Pleurotus ostreatus, Phlebia radiate, Coriolus (Trametes, Polyporus) versicolor Bên cạnh đó, laccase thu nhận từ nấm thuộc họ Ascomycetes, Deuteromycetes nấm men [4], [6] Các laccase nấm mốc đóng vai trị quan trọng q trình sinh lý bao gồm trình khử độc cho tế bào, trình nhiễm nấm mốc thực vật Với mục đích phân lập tuyển chọn xác định điều kiện ni cấy tối ưu vi sinh vật có khả sinh Nông nghiệp phát triển nông thôn - K - TH¸NG 10/2020 KHOA HỌC CƠNG NGHỆ enzyme laccase từ bùn thải dệt nhuộm, báo trình bày kết tuyển chọn, xác định điều kiện phù hợp tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme laccase chủng vi sinh vật tuyển chọn PHƯƠNG PHÁP VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Các mẫu dùng cho phân lập, tuyển chọn nấm mốc mẫu bùn thải dệt nhuộm sở dệt nhuộm thuộc làng Vạn Phúc - Hà Đông, Chúc Sơn Chương Mỹ, Thanh Trì - Hà Nội Mẫu sau thu thập bảo quản 40C Chủng Trametes multicolour làm chủng chuẩn sinh enzyme laccase để kiểm chứng hoạt tính enzyme laccase từ chủng tuyển chọn 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Tuyển chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme laccase từ mẫu bùn thải dệt nhuộm Các chủng nấm mốc sau phân lập môi trường MEA (dịch chiết malt 20 g/l, chloramphenicol 100 mg/l, agar 20 g/l) (MT1), cấy chuyển môi trường chứa chất thị: môi trường MEA có bổ sung 0,5% axit tanic (MT2) [5], mơi trường khoáng rắn (Glucose 10 g, Asparagine g, MgSO4.7H2O 0,5 g, CaCl2 0,1 g, K2 HPO4 0,6 g, KH2PO4 0,5 g, NaMoO4 2H2O 0,02 mg, ZnCl2 2,5 mg, CuSO4 5H2O 0,4 mg, MnCl2.H2O 0,09 mg, H3BO3 0,07 mg, FeCl3 1mg, thiamine 0,1 mg, chloramphenicol 100 mg, tween 80 0,05%, Vetraryl alchohol 0,2 mM) bổ sung 0,04% RBBR (MT3) nuôi 30°C - 10 ngày [6], nuôi môi trường khoáng rắn nhỏ lên khuẩn lạc 0,01% Syringaldazine (MT4), 0,216 mM ABTS (MT5) [8] Những chủng cho khuẩn lạc có vịng oxy hóa: màu nâu đậm xung quanh MT2 nhạt/mất màu môi trường MT3 tuyển chọn MT4, MT5 Những chủng xuất màu hồng với syringaldazine MT4 màu xanh với ABTS MT5 nuôi lỏng để xác định hoạt độ enzyme laccase 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme laccase Các chủng nấm mốc nuôi kiểm tra khả tổng hợp enzyme laccase môi trường MT6 [8] (glucose: 10/l, malt extrac: 0,5 g/l, cao nấm men: g/l, (NH4)2SO4: 5,5 g/l, pepton: g/l, Mg.SO4.7H2O: 0,6 g/l, asparagine: g/l, CuSO4.5H2O: 0,4 mg/l, KH2PO4: 0,5 g/l, NaMoO4.2H2O: 0,02 mg/l, ZnCl2: 2,5 mg/l, MnCl2.H2O: 0,09 mg/l, H3BO3: 0,07 mg/l, FeCl3:1 mg/l, thiamine:0,1 mg/l, chloramphenicol: 100 mg/l, tween 80: 0,05%, vetraryl alchohol: 0,2 mM) nhiệt độ 37º0C, máy lắc 200 vòng/phút - 10 ngày Định kỳ lấy mẫu xác định hoạt tính enzyme 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme laccase [7] Dung dịch phản ứng enzyme gồm: 2,2 ml đệm phosphat 0,1M pH 6,5; 0,3 ml dung dịch syringaldazine 0,216 mM methanol, 0,5 ml dung dịch enzym Trộn hỗn hợp phản ứng đo độ tăng độ hấp thụ 530 nm hỗn hợp phản ứng so sánh với mẫu kiểm chứng sau phút phản ứng Phản ứng kiểm chứng sử dụng nước khử ion thay cho enzyme Một đơn vị hoạt độ laccase lượng enzyme phút pH 6,5, 300C chuyển hóa µmol syringaldazine (ε=65 mM−1 cm−1) 2.2.4 Nghiên cứu yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme laccase Nấm mốc BVP 10.2 ni bình tam giác mơi trường MT6 điều kiện khác nồng độ glucose từ - 10 g; pepton - g; (NH4)2SO4 - g; Veratryl alcohol từ 0,1 - 0,4 mM; CuSO4 150 - 300 µm; pH thay đổi từ - nhiệt độ khoảng 30 - 400C Lấy mẫu ngày để xác định khả tổng hợp enzyme laccase từ nấm mốc 2.2.5 Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp enzyme laccase quy hoạch thực nghiệm [1] * Thiết lập mơ hình tốn học Mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ hàm mục tiêu yếu tố ảnh hưởng: Y=b0+b1X1+b2X2+b3X3 Trong đó: Y hàm mục tiêu; Xi biến mã số (Chỉ nhận giá trị -1,0,+1); bi hệ số diễn tả mức độ ảnh hưởng biến Xi đến hàm mục tiêu Lập ma trận thực nghiệm yếu tố đầy đủ: Số thí nghiệm N=2n (n: số yếu tố ảnh hưởng, số mức thí nghiệm +, -) Với n = 2, với thơng số ảnh hưởng chính, ta lập bảng ma trận thực nghiệm N«ng nghiƯp phát triển nông thôn - K - THáNG 10/2020 75 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ TN Mã X2 + + + + - X1 + + + + - Tổng X3 + + + + - X1 Bảng Ma trận thực nghiệm Thực Y1 Y2 X2 X3 Là giá trị cụ thể xác định tiến hành thực nghiệm Kiểm tra độ đồng ma trận: Mục đích q trình để xem số liệu ma trận có đo với độ xác hay không Gtt= Max  ( Sj S 2j ) j: 1-N Kiểm tra có nghĩa theo tiêu chuẩn Cochran tính Gb(f1, f2) với f1=k-1=2-1=1 f2 = N = 8, với p = 0,05 S YTB Sj2 S 2j  Ytb=(Y1 +Y2)/2 b  S  (Yi  YTB ) k 1 Với k số lần lặp lại thí nghiệm b Giá trị bảng tiêu chuẩn Student mức ý nghĩa p = 0,05; bậc tự f1 = N(K-1) Từ tra bảng để xác định tb Tính: Nếu bi> tb.Sb tất hệ số có nghĩa Nếu G tt