BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MINH NGỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP BERBERIN CLORID LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TR[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MINH NGỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP BERBERIN CLORID LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI - 2020 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MINH NGỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP BERBERIN CLORID CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ DƯỢC PHẨM & BÀO CHẾ MÃ SỐ: 62720402 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Đình Luyện HÀ NỘI – 2020 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan phần cơng trình nghiên cứu tập thể mà tơi thành viên Tơi tồn thành viên đồng ý cho phép sử dụng số liệu luận án Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác NCS Nguyễn Minh Ngọc LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Đình Luyện người Thầy nhiệt tình hướng dẫn, hết lịng giúp đỡ, dìu dắt, bảo, động viên, khích lệ tơi để tơi có động lực hồn thành luận án Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Văn Hải, TS Nguyễn Văn Giang, TS Nguyễn Thị Hường, TS Đào Nguyệt Sương Huyền quan tâm đặc biệt, hỗ trợ tơi đa cho tơi q trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn PGS.TS Nguyễn Đăng Hịa, GS.TS Nguyễn Hải Nam, PGS.TS Từ Minh Kng, PGS.TS Đàm Thanh Xuân, PGS.TS Đinh Thị Thanh Hải cho tơi gợi ý q báu q trình thực luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn tồn thể Thầy, Cơ giáo Bộ Mơn cơng nghiệp Dược, trường Đại Học Dược Hà Nội, Ban giám hiệu trường Cao Đẳng Dược TW Hải Dương, Bộ môn Bào chế, Phịng nghiên cứu khoa học, phịng tài kế toán trường Cao Đẳng Dược TW Hải Dương, ủng hộ động viên tơi suốt q trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn đến giúp đỡ, cộng tác Thầy cô, anh chị Quý quan: Cục khoa học công nghệ đào tạo – Bộ Y Tế, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, Viện Hóa Học - Viện Hàn lâm khoa học Cơng Nghệ Việt Nam, Khoa hóa học – Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội, Bộ môn Dược lý – Đại học Dược Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, Phòng tổ chức Cán bộ, Phịng chức năng, Bộ mơn chun ngành công nghệ Dược phẩm Bào chế thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận án Tơi xin gửi lời cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Song Hà, PGS.TS.Nguyễn Thị Thanh Duyên, TS Đỗ Hồng Quảng, TS Nguyễn Trần Linh, TS Đỗ Huy Hồng tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn học viên cao học, hệ sinh viên dược tơi làm việc để hồn thành kết luận án Cuối cùng, xin cảm ơn bố mẹ, anh chị người thân bạn bè động viên, giúp đỡ suốt năm qua NCS Nguyễn Minh Ngọc MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chung berberin clorid 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc hóa học 1.1.2 Tính chất hóa lý 1.1.3 Ứng dụng lâm sàng 1.1.4 Tác dụng dược lý 1.2 Phương pháp sản xuất berberin 1.2.1 Phương pháp chiết xuất từ dược liệu 1.2.2 Phương pháp tổng hợp hóa học 10 1.3 Phân tích lựa chọn phương pháp tổng hợp berebrin 20 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên liệu, thiết bị 23 2.1.1 Nguyên liệu 23 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 24 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Tổng hợp hóa học tinh chế sản phẩm, khảo sát thông số tối ưu 26 2.3.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết 28 2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 28 2.3.4 Phương pháp đánh giá chất lượng nguyên liệu berberin clorid 28 2.3.5 Phương pháp nghiên cứu độ ổn định nguyên liệu tổng hợp 29 2.3.6 Phương pháp thử độc tính cấp nguyên liệu tổng hợp 30 Chương THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 32 3.1 Xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid quy mơ phịng thí nghiệm 32 3.1.1 Phương pháp tổng hợp berberin clorid thông qua trung gian homopiperonylamin hydroclorid 32 3.1.2 Phương pháp tổng hợp berberin clorid từ 2,3dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim 52 3.1.3 So sánh phương pháp tổng hợp berberin clorid quy mơ phịng thí nghiệm 56 3.2 Kiểm tra độ tinh khiết khẳng định cấu trúc hóa học chất tổng hợp 56 3.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết 56 3.2.2 Khẳng định cấu trúc sản phẩm tổng hợp 58 3.3 Xây dựng quy trình tinh chế berberin clorid quy mơ phịng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V 65 3.3.1 Quy trình tiến hành 65 3.3.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng 65 3.3.3 Đánh giá chất lượng sản phẩm tinh chế theo tiêu chuẩn DĐVN V 66 3.4 Xây dựng quy trình tổng hợp tinh chế berberin clorid quy mô 100 g/mẻ 68 3.4.1 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal 68 3.4.2 Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4-methylendioxyβ-nitrostyren (61) 68 3.4.3 Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) 75 3.4.4 Tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) 76 3.4.5 Tinh chế sản phẩm berberin thô đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V quy mô 100 g/mẻ 77 3.5 Xây dựng quy trình tổng hợp tinh chế berberin clorid quy mô 500 g/mẻ 80 3.5.1 Giai đoạn - tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal 80 3.5.2 Giai đoạn - tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4methylendioxy-β-nitrostyren (61) với tác nhân khử Fe 83 3.5.3 Giai đoạn - tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) 86 3.5.5 Giai đoạn - tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) 89 3.5.6 Tinh chế sản phẩm berberin quy mô 500g/mẻ 92 3.6 Đề xuất tiêu chuẩn sở nguyên liệu berberin clorid tổng hợp 94 3.7 Kết nghiên cứu độ ổn định thử độc tính cấp nguyên liệu berberin tổng hợp 97 3.7.1 Kết nghiên cứu độ ổn định 97 3.7.2 Kết thử độc tính cấp sản phẩm berberin clorid tổng hợp 101 Chương BÀN LUẬN 111 4.1 Một số bàn luận quy trình tổng hợp 111 4.1.1 Về quy trình tổng hợp quy mơ thí nghiệm 111 4.1.2 Về phương pháp tổng hợp berberin 116 4.1.3 Về quy trình tổng hợp quy mơ 500g/mẻ 121 4.2 Bàn luận trình tổng hợp hóa học, tinh chế độ ổn định nguyên liệu berberin clorid tổng hợp 127 4.2.1 Về trình tổng hợp chất trung gian sản phẩm cuối 127 4.2.2 Cấu trúc hóa học hợp chất tổng hợp 139 4.3 Về độ ổn định sản phẩm berberin clorid tổng hợp 144 4.5 Về tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm berberin clorid tổng hợp 148 4.6 Về độc tính cấp sản phẩm berberin clorid tổng hợp 148 Kết luận Và kiến nghị 151 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ac ACC Acetyl Acetyl coenzym-A carboxylase AChE Acetylcholinesterase ADN AR Acid deoxyribonucleic Tiêu chuẩn phân tích (Analytical Reagent) AMPK BBR Protein kinase hoạt hóa adenosin monophosphat (Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase) Berberin clorid BChE Butyrylcholinesterase Bu n-Butyl COX Cyclooxygenase db Tỷ trọng biểu kiến DCM DĐVN DMSO đvC Dicloromethan Dược điển Việt Nam Dimethyl sulfoxid đơn vị Carbon Et FBG Ethyl Đường huyết lúc đói (Fasting Blood Glucose) HbA1c Hemoglobin A1c HPMC Hydroxypropyl methyl cellulose LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) LDLR Thụ thể lipoprotein tỉ trọng thấp LPS m/z MAO mARN MD Phân tử gồm lipid polysaccharid (Lipopolysaccharide) Tỉ lệ khối lượng điện tích Monoamin-oxidase Acid ribonucleic thơng tin (Messenger Ribonucleic Acid) Kháng nguyên biệt hóa myeloid (Myeloid Differentiation) Me MHz MMP Methyl Megahertz Proteinkinase kim loại chất ngoại bào (Matrix Metalloproteinkinase) Phổ khối (Mass Spectrometry) MS NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân PBG (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) Đường huyết sau bữa ăn (Postprandial blood glucose) Ph Phenyl Rf SKLM Hệ số lưu giữ (Retention factor) Sắc ký lớp mỏng T2MD TC TFA Đái tháo đường typ Tổng nồng độ cholesterol toàn phần (Total Cholesterol) Acid trifluoroacetic TG Triglycerid THF Tetrahydrofuran Tlag Thời gian tiềm tàng TLR Ts OECD ICH Thụ thể giống Toll (Toll - like receptor) p-Toluensulfonyl (tosyl) Tổ chức Hợp tác Phát triển Kinh tế (Organization for Economic Cooperation and Development;) Hội đồng quốc tế hài hòa yêu cầu kỹ thuật dược phẩm LD50 cho người (International Conference on Harmonization) Liều lượng gây chết 50% (Lethal Dose 50%) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục dung mơi, hóa chất 23 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị, dụng cụ .24 Bảng 3.1 Kết tổng hợp chất 61 theo phương pháp 35 Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol nitromethan/piperonal tới hiệu suất phản ứng 35 Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian tới hiệu suất phản ứng 36 Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi tới hiệu suất phản ứng 37 Bảng 3.5 Kết tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) theo phương pháp 42 Bảng 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol NaBH4 3,4methylendioxy-β-nitrostyren (61) đến hiệu suất phản ứng .43 Bảng 3.7 Kết khảo sát ảnh hưởng xúc tác cho phản ứng khử hóa .44 Bảng 3.8 Kết tổng hợp chất 31 theo phương pháp 46 Bảng 3.9 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol aldehyd chất 6a 47 Bảng 3.10 Kết khảo sát ảnh hưởng bazơ khác đến hiệu suất phản ứng ngưng tụ .47 Bảng 3.11 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi tới hiệu suất phản ứng 48 Bảng 3.12 Kết tổng hợp berberin clorid (1) theo phương pháp 50 Bảng 3.13 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol đến hiệu suất phản ứng .50 Bảng 3.14 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất phản ứng .51 Bảng 3.15 Kết khảo sát ảnh hưởng tác nhân khử hóa đến hiệu suất phản ứng tổng hợp 63 54 Bảng 3.16 So sánh phương pháp tổng hợp berberin clorid từ nguyên liệu khác 56 Bảng 3.17 Đặc điểm sắc ký lớp mỏng hợp chất tổng hợp 56 Bảng 3.18 Nhiệt độ nóng chảy hợp chất tổng hợp 57 Bảng 3.19 Kết phân tích cấu trúc 61 58 Bảng 3.20 Kết phân tích cấu trúc 62 59 Bảng 3.21 Kết phân tích cấu trúc 63 60 Bảng 3.22 Kết phân tích cấu trúc 25a 61 Bảng 3.23 Kết phân tích cấu trúc 6a 62 Bảng 3.24 Kết phân tích cấu trúc 31 63 Bảng 3.25 Kết phân tích cấu trúc 64 Bảng 3.26 Ảnh hưởng dung môi tới hiệu suất kết tinh Berberin clorid .66 Bảng 3.27 Ảnh hưởng nhiệt độ tới quy trình tinh chế 66 Bảng 3.28 Kết kiểm nghiệm berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V 67 Bảng 3.29 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp chất 61 với tác nhân NaOH quy mô 100 g/mẻ 68 Bảng 3.30 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp chất 6a 69 Bảng 3.31 Kết khảo sát nhiệt độ phản ứng 71 Bảng 3.32 Kết khảo sát tỷ lệ mol chất 61 : sắt 72 Bảng 3.33 Kết khảo sát thời gian phản ứng .72 Bảng 3.34 Kết khảo sát dung môi 73 Bảng 3.35 Kết khảo sát tỷ lệ alcol : nước 73 Bảng 3.36 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình cải tiến tổng hợp chất 6a quy mô 100g/mẻ 74 Bảng 3.37 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp chất 31 76 Bảng 3.38 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 100 g/mẻ 77 Bảng 3.39 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tinh chế chất .77 Bảng 3.40 Kết kiểm nghiệm berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V 79 Bảng 3.41 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp chất 61 với tác nhân NaOH quy mô 500 g/mẻ 81 Bảng 3.42 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp chất 6a quy trình cải tiến sử dụng bột sắt quy mô 500 g/mẻ .84 Bảng 3.43 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp chất 31 quy mô 500 g/mẻ 86 Bảng 3.44 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp chất quy mơ 500 g/mẻ 89 Bảng 3.45 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tinh chế chất .92 Bảng 3.46 Tiêu chuẩn sở nguyên liệu berberin clorid tổng hợp 95 Bảng 3.47 Kết kiểm nghiệm nguyên liệu berberin clorid tổng hợp quy mô 500g/mẻ 96 Bảng 3.48 Kết nghiên cứu độ ổn định berberin clorid, số lô 1A điều kiện lão hóa cấp tốc 98 Bảng 3.49 Kết nghiên cứu độ ổn định berberin clorid, số lơ 1B điều kiện lão hóa cấp tốc 98 Bảng 3.50 Kết nghiên cứu độ ổn định berberin clorid, số lô 1C điều kiện lão hóa cấp tốc 99 Bảng 3.51 Kết nghiên cứu độ ổn định berberin clorid, số lô 1A điều kiện dài hạn .100 Bảng 3.52 Kết nghiên cứu độ ổn định berberin clorid, số lô 1B điều kiện dài hạn .100 Bảng 3.53 Kết nghiên cứu độ ổn định berberin clorid, số lô 1C điều kiện dài hạn .100 Bảng 3.54 Mơ tả tình trạng chuột lơ sau dùng mẫu thử nguyên liệu berberin clorid - mẫu 102 Bảng 3.55 Số chuột chết lơ vịng 72 sau uống ngun liệu berberin chlorid .108 Bảng 3.56 Tỉ lệ chết chuột nhắt trắng giá trị LD50 mẫu thử nguyên liệu berberin chlorid .109 Bảng 4.1 Những cải tiến nâng cấp quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 500g .121 Bảng 4.2 Các phương pháp tổng hợp berberin clorid thông qua hợp chất trung gian 126 Bảng 4.3 Kết so sánh phổ 1H-NMR berberin tổng hợp phổ chuẩn berberin clorid 143 Bảng 4.4 Kết so sánh phổ 13C-NMR berberin tổng hợp phổ chuẩn berberin clorid 143 Bảng 4.5 Tổng hợp giá trị LD50 nguyên liệu berberin 150 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp berberin .2 Hình 1.2 Phản ứng khử berberin Hình 1.3 Phản ứng thủy phân berberin mơi trường kiềm Hình 1.4 Sơ đồ tổng hợp berberin Amé Pictet Alfons Gams .10 Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp berberin T Kametani cộng 11 Hình 1.6 Sơ đồ tổng hợp berberin Viện Y học cổ truyền Trung Quốc .12 Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp berberin W Liu 13 Hình 1.8 Sơ đồ tổng hợp berberin Z X Chen 14 Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp berberin Xiaolin Bian (2006) Peng Yang (2008) 15 Hình 1.10 Sơ đồ tổng hợp berberin Alice Gatland 16 Hình 1.11 Sơ đồ tổng hợp berberin Virshinha Reddy .17 Hình 1.12 Sơ đồ tổng hợp berberin Chen Cheng 18 Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp berberin Chen Cheng 19 Hình 1.14 Sơ đồ tổng hợp berberin qua hợp chất trung gian 6a (dạng muối hydroclorid amin 6) 20 Hình 1.15 Sơ đồ phân tích tổng hợp ngược berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd 22 Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp berberin clorid từ vanilin 27 Hình 2.2 Sơ đồ tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) .27 Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp berberin từ piperonal quy mơ phịng thí nghiệm 52 Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp berberin từ 2,3-dimethoxybenzaldehyd qua chất trung gian 2,3-dimethoxybenzaldoxim 52 Hình 3.3 Sơ đồ quy trình tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal 82 Hình 3.4 Sơ đồ quy trình tổng hợp 6a từ 61 85 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình tổng hợp amin 31 từ amin 6a 88 Hình 3.6 Sơ đồ quy trình tổng hợp berberin clorid (1) từ amin 31 91 Hình 3.7 Sơ đồ quy trình tinh chế berberin clorid 93 Hình 3.8 Sơ đồ quy trình tinh chế berberin clorid 94 Hình 3.9 Đồ thị dự đoán tuổi thọ nguyên liệu berberin clorid điều kiện dài hạn 101 Hình 4.1 Sơ đồ tóm tắt phương pháp tổng hợp berberin qua chất trung gian amin (6) 112 Hình 4.2 Các phương pháp tổng hợp homopiperonylamin 114 Hình 4.3 Cơ chế phản ứng hình thành 2,3-dimethoxybenzaldoxim (62) từ 2,3dimethoxybenzaldehyd 118 Hình 4.4 Cơ chế phản ứng demethyl vanilin AlCl3/pyridin 128 Hình 4.5 Cơ chế phản ứng đóng vịng methylenoxyd 25a 129 Hình 4.6 Cơ chế phản ứng ngưng tụ piperonal nitromethan .130 Hình 4.7 Q trình khử hóa nitrostyren 61 thành muối amin 6a sử dụng hệ khử NaBH4/CuCl2 131 Hình 4.8 Cơ chế phản ứng khử nối đôi phân tử 61 NaBH4 132 Hình 4.9 Cơ chế phản ứng hình thành 31 từ (6a) 136 Hình 4.10 Cơ chế phản ứng hình thành berberin clorid (1) từ 31 138 Hình 4.11 Sắc ký đồ HPLC sản phẩm berberin clorid 145 Hình 4.12 DSC mẫu berberin clorid bán thị trường .146 Hình 4.13 DSC mẫu berberin clorid tổng hợp 147 ĐẶT VẤN ĐỀ Berberin hóa dược phổ biến dùng để sản xuất thuốc cho điều trị bệnh liên quan đến nhiễm khuẩn đường ruột ức chế tình trạng kích thích co thắt nhu động ruột Berberin sử dụng rộng rãi Việt Nam từ năm 1960 làm thuốc chữa lỵ nhiễm khuẩn đường ruột Ngồi ra, berberin cịn có thành phần số loại thuốc khác thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ tác nhân kích thích bên ngồi thuốc điều trị bệnh đau mắt hột Hiện nay, nhiều tác dụng khác berberin nghiên cứu ứng dụng lâm sàng giúp ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm chống lại tác hại vi khuẩn tả, hạ đường huyết, làm giảm mạnh lượng cholesterol, triglycerid xơ vữa, khơng gây tác dụng phụ điển statin Berberin ngăn chặn phát triển nhiều loại tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến phát triển tế bào bình thường [89] Ngồi ra, berberin cịn có tác dụng bảo vệ tim mạch, đồng thời có tác dụng chống trầm cảm [82] Nhu cầu berberin ngày tăng Tại Việt Nam, nhu cầu sử dụng berberin lớn Trên giới ngành công nghiệp dược phải đối mặt với việc khai thác tràn lan mức loại dược liệu mà chưa có chiến lược bảo tồn hợp lý, nguồn nguyên liệu chiết xuất berberin đứng trước nguy cạn kiệt [1] Việc canh tác truyền thống vùng trồng dược liệu chứa berberin không đáp ứng nhu cầu thị trường thuốc [6], [8] Trên giới, quốc gia Nhật Bản, Trung Quốc tổng hợp thương mại hóa chế phẩm berberin tổng hợp từ lâu Các nghiên cứu tổng hợp berberin nhà khoa học giới phát triển nhiều thập kỉ Chúng thấy sản xuất berberin đường tổng hợp hóa học nhằm đảm bảo ổn định, bền vững nguồn nguyên liệu triển vọng thiết thực Vì vậy, chúng tơi thực luận án “Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid” với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid quy mơ 500g/mẻ đạt tiêu chuẩn dược dụng Đánh giá độc tính cấp độ ổn định sản phẩm berberin clorid tổng hợp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chung berberin clorid 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc hóa học - Cơng thức phân tử: [C20H18NO4]+Cl- (M = 371,86 đvC) - Công thức cấu tạo [92]: - Tên khoa học: 9,10-dimethoxy-5,6-dihydro[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquino[3,2-a] isoquinolin-7-ium clorid - Dạng dược dụng berberin quy định Dược điển Việt Nam V [4], Dược điển Nhật XVII [92] muối berberin clorid dihydrat Ngồi ra, cịn có dạng dược dụng muối berberin tannat, berberin sulfat [92] Trong thực vật, berberin sinh tổng hợp từ L-tyrosin, 20 acid amin sở trình sinh tổng hợp protein tế bào Hình 1.1 Con đường sinh tổng hợp berberin Trong trình sinh tổng hợp berberin [32] hai phân tử tyrosin tham gia vào hai trình phản ứng khác để tạo hai sản phẩm trung gian L-3,4dihydroxyphenylalanine (L -DOPA) acid 4-hydroxypyruvic Các sản phẩm trung gian tham gia vào decarboxyl hóa để tạo thành dopamin hydroxyphenylacetaldehyd tương ứng Hợp chất dopamin 4-hydroxy-phenylacetaldehyd tham gia phản ứng ankyl hóa amino để tạo thành (S) -norcolaurin tương tự phản ứng Mannich Sản phẩm metyl hóa nhóm amin ether hóa đồng thời S-Adenosylmethionin (SAM) tạo thành (S) - reticulin Sản phẩm trình sinh tổng hợp tham gia vào q trình oxi hóa amin bậc tạo thành ion iminium, sau nhóm iminium tham gia phản ứng đóng vịng nội phân tử (phản ứng Mannich) vị trí ortho tạo thành X Sau đó, hợp chất X tham gia phản ứng chuyển vị xeto – enol để tạo thành (S)-scoulerin, tiếp tục bị metyl hóa SAM để tạo thành (S)–tetrahydrocolumbamin Hợp chất bị oxy hóa để tạo thành hợp chất metylenedioxy vòng Từ ortho -methoxyphenol, O2, enzym NADPH cytochrom P-450, tạo thành (S)-canadin Cuối cùng, (S)-canadin bị oxy hóa thành berberin 1.1.2 Tính chất hóa lý a Tính chất vật lý - Berberin clorid tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi, vị đắng [4] - Berberin clorid tan nước theo tỷ lệ 1/400, tan tốt nước nóng, ethanol, khơng tan cloroform ether Berberin khơng có carbon bất đối nên khơng có đồng phân quang học [11], [52] - Dạng bazơ [C20H18O4N]+OH- có nhiệt độ nóng chảy 145℃ [52] - Berberin clorid dạng dihydrat có nhiệt độ nóng chảy 191-192℃ [54], dạng khan nước 204-206℃ (phân hủy) b Tính chất hóa học - Dạng bazơ có khả tạo muối với acid khác nhau, việc tạo muối berberin không giống alcaloid khác mà muối tạo thành giống muối hydroxyd kim loại, nghĩa có loại phân tử nước [6] [C20H18O4N]+OH- + HCl [C20H18O4N]+Cl- + H2O - Berberin clorid tham gia phản ứng trao đổi [55]: [C20H18O4N]+Cl- + NaOH [C20H18O4N]+OH- + NaCl - Phản ứng cộng nucleophil vào liên kết đôi C = N+ [3], [55]: [C20H18O4N]+Cl- + NaCN [C20H18O4N]+CN- + NaCl - Nhân thơm có chứa N berberin clorid bị khử tác nhân khác tạo thành hydro alcaloid khơng màu theo hình 1.2 Hình 1.2 Phản ứng khử berberin - Berberin ổn định mơi trường kiềm mạnh, vịng chứa ngun tử N không vững bền, môi trường kiềm mạnh dễ hỗ biến mở vòng, cho chức aldehyd gọi berberinal theo hình 1.3 Hình 1.3 Phản ứng thủy phân berberin môi trường kiềm 1.1.3 Ứng dụng lâm sàng - Berberin có hoạt tính kháng khuẩn, chống viêm định lâm sàng để điều trị nhiễm trùng đường ruột, tiêu chảy, lỵ, viêm ống mật [19], [29], [107], giúp ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm [33], [39] - Berberin có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng ức chế phát triển chủng vi khuẩn Gram (-) Gram (+) bao gồm Staphylococcus aureus, Shigella antidysenteria, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Escherichia coli [52], [102], [115] - Tác dụng điều trị nhiễm khuẩn berberin khả liên kết với protein amyloid màng sinh học, làm gián đoạn ổn định tăng cường hoạt tính kháng khuẩn kháng sinh, đồng thời cạnh tranh với LPS để gắn với TLR4 / MD-2, qua ức chế trình viêm nhiễm trùng [18] 1.1.4 Tác dụng dược lý Berberin lần phân lập từ Xanthoxylon cava vào năm 1926 Dịch chiết từ loài thực vật có chứa hoạt chất mơ tả có khả điều trị bệnh lý liên quan đến đường tiêu hóa bệnh tả bệnh tiêu chảy vi khuẩn y học dân gian truyền thống người Mỹ, Trung Quốc Nhật Bản nhiều kỉ Các nghiên cứu berberin có khả ức chế nhiều chủng vi khuẩn gram dương Staphylococcus aureus, Staphylococcus cholermidis, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis chủng vi khuẩn gram âm Aspergdlus fumigatus, Plasmodium falciparum Berberin có khả làm giảm kích thích co thắt nhu động ruột vi khuẩn có hoạt tính ức chế tế bào ung thư Một số nghiên cứu trước đưa kết luận hoạt tính sinh học hợp chất dựa tương tác ion iminium cấu trúc dị vịng liên hợp berberin phản ứng với acid amin enzym thụ thể vi sinh vật 1.1.4.1 Tác dụng hạ đường huyết Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng 36 người mắc bệnh đái tháo đường loại phân ngẫu nhiên điều trị berberin metformin thử nghiệm tháng Tác dụng hạ đường huyết berberin tương tự metformin Nhóm điều trị berberin giúp giảm đáng kể hemoglobin A1c (HbA1c từ 9,5% xuống 7,5%), đường huyết lúc đói (FBG từ 10,6 ± 0,9 mmol/L xuống 6,9 ± 0,5 mmol/L), đường huyết sau bữa ăn (PBG từ 19,8 ± 1,7 mmol/L xuống 11,1 ± 0,9 mmol/L) [111] Tác dụng hạ đường huyết berberin dựa nhiều chế khác bảo vệ phục hồi chức tế bào đảo tụy, tăng cường biểu mARN insulin receptor, giảm tình trạng kháng insulin [34], [56], [109], [118] Trong tế bào gan, tế bào mỡ, berberin làm tăng tiêu thụ hấp thu glucose khơng có insulin kích thích glycolysis, có liên quan đến ức chế q trình oxy hóa ty thể [50], [108], [110] Berberin hoạt động chất ức chế α- glucosidase Nó ức chế hoạt động disacaridase giảm vận chuyển glucose qua biểu mô ruột [76], [77] 1.1.4.2 Tác dụng cải thiện trí nhớ Alzheimer chứng trí nhớ phổ biến nhất, đặc biệt người cao tuổi, trở thành vấn đề sức khỏe quan tâm toàn cầu Đây bệnh gây tử vong người cao tuổi đứng hàng thứ bệnh tốn cho xã hội nước phát triển Berberin xem tác nhân đầy hứa hẹn để ứng dụng điều trị bệnh Alzheimer hợp chất sở hữu tác dụng sinh học chống oxy hóa, ức chế AChE BChE, ức chế monoamin-oxidase (MAO), giảm kết tập mảng β-amyloid hạ cholesterol Thử nghiệm cho thấy sử dụng berberin đường uống với liều 50 mg/kg thể trọng, lần ngày, 14 ngày, cải thiện đáng kể tình trạng suy giảm trí nhớ mơ hình gây bệnh Alzheimer chuột [42], [43], [45], [46] Trong mơ hình chuột bị suy giảm trí nhớ gây việc bơm acid ibotenic, tồn tế bào hình chóp hạt tăng lên nhiều vùng hippocampus (vùng liên quan tới khả lưu trữ, xử lý thông tin não) dùng berberin Trong mơ hình chấn thương dây thần kinh chuột, bốn tuần sau sử dụng berberin (20 mg/kg, lần ngày tuần), độ dày sợi trục cải thiện khoảng 1,4 lần gốc xa vết thương [38] 1.1.4.3 Tác dụng hạ lipid máu Trong nghiên cứu 32 bệnh nhân điều trị hạ lipid máu cách sử dụng berberin 500 mg, hai lần ngày tháng Ở bệnh nhân này, giảm đáng kể LDL, triglycerid, tổng số cholesterol (giảm 25% LDL, 35% chất béo trung tính giảm 29% cholesterol tồn phần) Trong nghiên cứu khác kéo dài tháng với 63 bệnh nhân, sử dụng berberin 500 mg hai lần ngày, giảm LDL trung bình 23,8% Kết hợp simvastatin 20 mg ngày berberin, LDL hạ xuống trung bình 31,8% [17], [78] Nghiên cứu phân tích meta thực Hui Dong cộng 14 thử nghiệm lâm sàng 1068 người tình nguyện, nồng độ lipoprotein cholesterol giảm rõ rệt điều trị berberin [31] So sánh với simvastatin, berberin cho hiệu điều trị tương tự: TC, LDL, TG ... Vì vậy, thực luận án ? ?Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid? ?? với mục tiêu sau: Xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 500g/mẻ đạt tiêu chuẩn dược dụng Đánh giá độc... 4.1.1 Về quy trình tổng hợp quy mơ thí nghiệm 111 4.1.2 Về phương pháp tổng hợp berberin 116 4.1.3 Về quy trình tổng hợp quy mơ 500g/mẻ 121 4.2 Bàn luận q trình tổng hợp hóa học, tinh... đánh giá độ lặp lại quy trình cải tiến tổng hợp chất 6a quy mô 100g/mẻ 74 Bảng 3.37 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp chất 31 76 Bảng 3.38 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình