Sinh học phân tử - Southern blot doc

LOGO www.themegallery.com Southern blot Sinh học phân tử Thực hiện: Đỗ Đức Anh - Ng.Thị Điểm - Ng.Phan Thị Hoàng Kim - Hồng Vĩnh Thành - Mai Hoàng Yến www.themegall ery.com LOGO N i dung seminarộ I II 3 Giới thiệu về phương pháp Southern Blot Lai phân tử III Southern blot 2 1 3 2 1 Khái niệm Các kiểu lai phân tử Các yếu tố ảnh hưởng Nguyên lí và điều kiện Mẫu dò Qui trình Ứng dụng IV www.themegall ery.com LOGO I. Gi i thi u chung v ph ng pháp Southern blot.ớ ệ ề ươ - Đây là ph ng pháp cho phép xác đ nh đ c s có m t c a ươ ị ượ ự ặ ủ Đây là ph ng pháp cho phép xác đ nh đ c s có m t c a ươ ị ượ ự ặ ủ nh ng trình t nucleotide trên m t đo n ADN nào đó, trong ữ ự ộ ạ nh ng trình t nucleotide trên m t đo n ADN nào đó, trong ữ ự ộ ạ h n h p các đo n ADN khác nhau ỗ ợ ạ h n h p các đo n ADN khác nhau ỗ ợ ạ - Do E.M.Southern đ xu t vào năm 1975, t i đ i h c ề ấ ạ ạ ọ Edingburd. - Đ c tri n khai nh 1 s kĩ thu t n n t ng c a công ngh ượ ể ờ ố ậ ề ả ủ ệ sinh h c phân t nh :ọ ử ư • Tách chi t gen.ế • PCR • Th m tích các phân t acid nucleotide lên màng lai ẩ ử (blot). • Lai phân t ( lai v i m u dò đ c hi u)ử ớ ẫ ặ ệ • … Southern blot www.themegall ery.com LOGO II. Lai phân tử 1. Khái ni mệ  Là hi n t ng 2 m ch DNA sau khi đã tách r i, s ệ ượ ạ ờ ẽ k t h p l i v i nhau đi u ki n nhi t đ đ c làm ế ợ ạ ớ ở ề ệ ệ ộ ượ gi m t t , k t h p v i đi u ki n thí nghi m thích ả ừ ừ ế ợ ớ ề ệ ệ h p.ợ  Đ c đi m:ặ ể – Đ c hi u tuy t đ i: s b t c p ch x y ra ặ ệ ệ ố ự ắ ặ ỉ ả gi a 2 trình t hoàn toàn b sung cho nhau.ữ ự ổ – Các trình t b sung có th là DNA hay RNA ự ổ ể  pt DNA-DNA, RNA-RNA, các phân t lai ử ử DNA-RNA www.themegall ery.com LOGO Các kiểu lai phân tử Lai trên pha rắn Lai trong pha lỏng Lai tại chỗ Southern blot www.themegall ery.com LOGO Sự lai phân tử xảy ra do: - Chuyển động nhiệt. - Nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ - 1 trình tự bổ sung. - 1 trình tự cần biết được gắn trên gía thể Nguyên tắc LAI TRÊN PHA RẮN www.themegall ery.com LOGO Màng Nitrocellulose: được sử dụng đầu tiên, nay ít dùng, do: - Độ bền cơ học kémkhó thao tác. - Không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lai với một mẫu dò khác. Màng Nitrocellulose: được sử dụng đầu tiên, nay ít dùng, do: - Độ bền cơ học kémkhó thao tác. - Không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lai với một mẫu dò khác. Màng nylon được sử dụng phổ biến: - Có thể tiếp nhận 500µg/cm 2 . - giữ DNA chắc hơn. - Ít đứt gãy - Cho phép lai nhiều lần với mẫu dò khác nhau CÁC YẾU TỐ KĨ THUẬT TRONG LAI TRÊN PHA RẮN www.themegall ery.com LOGO Diagram Khó khăn: - Định lượng phân tử kém chính xác - Hiệu quả lai thấp (vận tốc lai chậm đi 10 lần so với vận tốc lai trên pha lỏng). Thuận lợi: - Dễ dàng trong thao tác. - Dễ dàng tách trình tự không lai ra khỏi phân tử lai. - Ngăn cản sự tái bắt cặp giữa 2 mạch đơn của cùng một phân tử. Lai trên màng rắn Southern blot www.themegall ery.com LOGO Diagram - dựa trên nguyên tắc biến tính và hồi tính của phân tử DNA - Dựa vào nguyên tắc bổ sung giữa các cặp mucleotide: A-T, G-C (các đoạn polynucleotide mạch đơn có trình tự bổ sung) Nguyên lí Nguyên lí III. PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT www.themegall ery.com LOGO Nguyên tắc Nguyên tắc - Phản ứng lai cần nhiệt độ cao hoặc hóa chất gây biến tính DNA (NaOH, Formaldehyt). Đòi hỏi một đoạn DNA (RNA) đã biết được sử dụng làm mồi “Probe” được đánh dấu - Các vật liệu, trang thiết bị máy móc chính xác: màng lai, máy Blotting, buồng lai, máy PCR Southern blot [...]... LOGO LOGO LOGO DNA FINGERPRINTING LOGO SO SÁNH 2 MẪU  TÌM RA THỦ PHẠM LOGO Tài liệu tham khảo - Trịnh Đình Đạt Công nghệ sinh học Tập 4 NXB Giáo dục - Hồ Huỳnh Thuỳ Dương Sinh học phân tử NXB Giáo dục - Phạm Thành Hổ 2005 Nhập môn CNSH NXB Giáo dục - Diễn dàn nhà sinh học trẻ : nhasinhhoctre.com - youtube.com - báck khoa toàn thư mở: vi.wikipedia.org LOGO Click to edit subtitle style www.themegallery.com... gel agarpose dd NAOH 0,4M  thành các sợi  đơn LOGO LOGO GIAI ĐOẠN II - Màng được sử dụng là màng nitocellulose hoặc màng nylon - Nguyên tắc: dựa vào nguyên tắc mao dẫn • Đệm từ phía dưới được thấm một cách tự nhiên lên trên chuyển các mảnh DNA từ gel lên màng và bám chặt vào màng ( thời gian chuyển dựa vào các phương pháp chuyển khác nhau) - Cách tiến hành: • Đặt gel lên giá chuyển máy Blotting để chuyển... ­ DNA này sau đó được bằng nhiệt độ  làm biến tính sợi kép thành hai sợi đơn LOGO ĐÁNH DẤU BẰNG PHÁT QUANG SINH HỌC - Mẫu dò được đánh dấu bằng enzyme peroxidase - Sau khi cho màng lai tiếp xúc với mẫu dò (được đánh dấu phát quang sinh học), cơ chất của perpxidase bị biến đổi, ánh sáng phát ra sẽ được in trên phim  thu nhận được kết quả LOGO QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT Giai đoạn 1 Tách chiết và  làm biến tính  DNA thành  các sợi đơn Giai... Phát hiện vị trí lai nhờ phóng xạ tự ghi Đặt phim lên tấm lọc Tráng phim để thu các vạch đen tại nơi phát xạ LOGO LAI VỚI MẪU DÒ  KẾT QUẢ LOGO LOGO LAI TRÊN MÀNG ĐẶT PHIM LÊN TẤM LỌC TRÁNG PHIM LOGO ứng dụng southern blot ứng dụng southern blot KĨ THUẬT RFLP ­ Nghiên cứu mối quan hệ họ hàng của nhiều nhóm loài thực vật,  động vật.  ­ Phát hiện sự có mặt của gen cần tìm trong hệ genome sinh vật  nghiên cứu ­ Phát hiện sự đa dạng DNA qua các cá thể khác nhau của 1 loài... ­Biến tính mẫu ADN thành các  sợi đơn ­Gắn mồi vào các sợi đơn ­Tổng hợp các sợi ADN mới ­Biến tính để tách chuỗi mới vừa  tổng hợp thành các sợi đơn ­Tiếp tục quay về gắn mồi vào  các sợi đơn.  LOGO Southern blot đồng vị phóng xạ (P32) Phát quang sinh  học Enzyme polynucleotide  kinase … Đánh dấu  probe  Kéo dài mồi Phương pháp hóa học LOGO ĐÁNH DẤU ĐỒNG VỊ PHÓNG  XẠ ­ DNA dùng để tạo mẫu dò ­ Tạo ra các vết khía sau đó bổ xung các  . tác. - Không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lai với một mẫu dò khác. Màng nylon được sử dụng phổ biến: - Có thể tiếp nhận 500µg/cm 2 . - giữ DNA chắc hơn. - Ít đứt gãy - Cho. khuẩn và chọn lọc. -Tách plasmid từ các tế bào chọn lọc. -Tách mẫu dò (đoạn ADN). - ánh dấu mẫu dò Tạo Probe nhờ ứng dụng PCR -Thiết lập mồi và đánh dấu phóng xạ vào các mồi. -Biến tính mẫu ADN. xạ. - DNA polymerase I được cho vào ống và - DNA polymerase I được cho vào ống và bám vào các vết cắt. bám vào các vết cắt. - Polymerase bắt đầu sửa chữa DNA theo chiều 5' - 3'. -