Phân tích protein huyết thanh bền nhiệt bằng kỹ thuật điện di hai chiều

Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp kết năm miệt mài học tập ghế giảng đường Đại học, bước khởi đầu để làm quen với công việc nghiên cứu khoa học thực thụ Vì vậy, vơ có ý nghĩa sinh viên Tuy nhiên, hồn thành tốt Khóa luận cơng việc khơng đơn giản, khơng địi hỏi nỗ lực, cố gắng thân người thực mà cần đến động viên, cổ vũ gia đình, bạn bè đặc biệt giúp đỡ nhiệt thành thầy cô cán hướng dẫn Qua đây, xin gửi lời cảm ơn đến cá nhân nhiệt tình ủng hộ, giúp đỡ tơi q trình thực Khóa luận Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Phan Văn Chi – Phó viện trưởng Viện Cơng nghệ Sinh học, Trưởng phịng Hố Sinh Protein tạo điều kiện thuận lợi, hướng dẫn truyền thụ cho tơi kiến thức lịng say mê khoa học suốt q trình thực khố luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Bùi Phương Thuận, Chủ nhiệm môn Sinh lý thực vật Hoá Sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội tận tình truyền thụ trang bị cho tảng kiến thức vững thời gian học tập trường để tơi chủ động tiếp thu tốt kiến thức khoa học làm khóa luận Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới NCS Đỗ Quỳnh Hoa, người trực tiếp hướng dẫn nhiệt tình giúp đỡ tơi hồn thành khố luận Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Bích Nhi, ThS Trần Thế Thành đóng góp q báu q trình hồn thành khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn cán phịng Hố sinh Protein, Viện Công nghệ Sinh học thầy Bộ mơn Sinh lý thực vật Hố sinh nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, góp ý tạo điều kiện thuận lợi để thực tập hồn thành khố luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thân, người ln động viên, khích lệ chỗ dựa tinh thần vững cho tơi q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 25 tháng 05 năm 2008 Sinh viên Vũ Khắc Ngọc Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .2 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI 1.1.1 Khái niệm huyết người 1.1.2 Đặc điểm, thành phần hệ protein huyết người 1.1.3 Chức protein huyết 1.1.4 Phân loại protein huyết theo Putnam 1.1.5 Ý nghĩa việc nghiên cứu hệ protein huyết 1.1.6 Hệ protein bền nhiệt huyết .6 1.2 KỸ THUẬT ĐIỆN DI HAI CHIỀU (2-DE) .7 1.2.1 Giới thiệu chung 1.2.2 Tiến trình hoạt động 2-DE 1.2.3 Thế mạnh tồn kỹ thuật 2-DE 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến thành công điện di 2-DE .9 1.2.5 Nhận diện protein điện di hai chiều kết hợp khối phổ (2DE-MS) 10 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU .15 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 15 2.1.2 Hóa chất 15 2.1.3 Thiết bị 16 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.2.1 Thu nhận protein bền nhiệt từ hệ protein huyết 16 2.2.2 Kết tủa protein TCA điều kiện khác 16 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc 2.2.3 Xác định hàm lượng protein dung dịch phương pháp Bradford 17 2.2.4 Phân tích protein kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) 18 2.2.5 Phân tách protein bền nhiệt kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) .19 2.2.6 Thủy phân protein gel enzym trypsin 20 2.2.7 Phân tách protein huyết bền nhiệt hệ sắc ký nanoLC-MS 20 2.2.8 Phân tích phổ khối nanoLC-ESI-MS/MS phần mềm Mascot v1.8 21 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Thu nhận protein bền nhiệt phương pháp biến tính nhiệt 23 3.2 Điện di SDS–PAGE kiểm tra protein bền nhiệt thu 24 3.3 Xác định hàm lượng protein phương pháp so màu Bradford 25 3.4 Điện di 2-DE protein bền nhiệt 27 3.5 Điện di 2-DE protein bền nhiệt dải pH hẹp 30 3.6 Loại bỏ Tris phương pháp kết tủa protein 32 3.7 Kiểm tra hiệu loại Tris điện di 2-DE .34 3.8 Nhận dạng protein bền nhiệt gel hệ 1DnanoLC-ESI-MS/MS 36 3.9 Tìm hiểu chức số protein bền nhiệt nhận diện 37 3.9.1 Haptoglobin 37 3.9.2 Apolipoprotein A (Apo) .38 3.9.3 Transthyretin (TTR) 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Bảng Trang Bảng Sự thay đổi nồng độ protein huyết bệnh nhân bị ung thư Bảng Một số hóa chất sử dụng nghiên cứu 15 Bảng Thành phần dung dịch đệm SDS-PAGE 18 Bảng Các thông số hệ thống sắc ký lỏng NanoLC 20 Bảng Kết đo OD nồng độ BSA chuẩn .26 Bảng Kết tính toán nồng độ protein mẫu theo phương pháp Bradford 27 Bảng Sự biến đổi hiệu điện theo thời gian 28 Bảng Kết tính tốn nồng độ protein trước sau kết tủa phương pháp Bradford .33 Bảng Kết nhận dạng protein chịu nhiệt phương pháp 2DE-LC-MS/MS 36 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Hình Trang Hình Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) huyết Hình Sơ đồ phân tách protein điện di 2-DE sử dụng IPG Strip Hình Ảnh hưởng nồng độ Tris đến trình hội tụ đẳng điện protein 10 Hình Hiệu việc lựa chọn dải pH hẹp gối lên 11 Hình Sơ đồ cấu tạo hệ máy khối phổ với khả lắp đặt khác 13 Hình Sơ đồ kết hợp 2-DE khối phổ MS/MS xác định protein 14 Hình Hình minh họa thông số phần mềm Mascot v1.8 22 Hình Kết thu nhận protein bền nhiệt phương pháp biến tính nhiệt 23 Hình Ảnh điện di SDS – PAGE protein bền nhiệt 24 Hình 10 Đường chuẩn xác định nồng độ protein theo phương pháp Bradford .26 Hình 11 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ protein huyết bền nhiệt mẫu nghiên cứu so với protein tổng số 27 Hình 12 Ảnh điện di 2-DE phân đoạn protein bền nhiệt .29 Hình 13 Sự hội tụ Tris điện di 2-DE pH ứng với pKa .30 Hình 14 Ảnh điện di phân đoạn protein bền nhiệt dải pH 4-7 31 Hình 15 Ảnh điện di SDS – PAGE khảo sát điều kiện kết tủa với TCA 33 Hình 16 Ảnh điện di 2-DE so sánh hiệu việc loại Tris phương pháp kết tủa protein trình điện di 2-DE dải pH 3-10 35 Hình 17 Kết nhận dạng haptoglobin với số đăng ký gi|4826762 .37 Hình 18 Phổ MS/MS ion peptide (TSTQDWVQK) Haptoglobin gi|4826762 38 Hình 19 Trình tự amino acid protein haptoglobin gi|4826762 38 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc Hình 20 Kết nhận dạng ApoA-I với số đăng ký gi|37499465 39 Hình 21 Phổ MS/MS ion peptide (HLAPYSDELR) apoA-I gi|37499465 .40 Hình 22 Trình tự amino acid protein apoA-I gi|37499465 .40 Hình 23 Kết nhận dạng transthyretin với số đăng ký gi|1181953 41 Hình 24 Phổ MS/MS ion peptide (GSPAINVAVHVFR) transthyretin gi|1181953 41 Hình 25 Trình tự amino acid transthyretin với số đăng ký gi|1181953 42 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc MỞ ĐẦU Huyết hệ protein phức tạp, chứa nhiều protein có nguồn gốc chức khác nhau, tác động lên nhiều quan, nhiều trình sinh học khác thể Những thay đổi hàm lượng thành phần protein huyết thường có mối liên hệ chặt chẽ với trình bệnh lý Vì việc sử dụng huyết cho mục đích nghiên cứu cách tiếp cận đuợc quan tâm nghiên cứu proteomics Tuy nhiên, thách thức lớn nghiên cứu protein huyết không số lượng lớn protein có mặt (khoảng 10000 loại), mà cịn tỷ lệ khác chúng Trong số protein có nồng độ cao albumin (50%-70%), immunoglobulin (8%10%)…, ngược lại, có nhiều protein, peptid có nồng độ thấp (ng/ml) cytokin, hormon mà tổng nồng độ chúng chiếm 1% hàm lượng protein tổng số Những khác biệt lớn nồng độ với hạn chế mặt kỹ thuật phương pháp proteomics truyền thống (định lượng định tính protein) làm cho việc nghiên cứu số phân đoạn protein có hàm lượng thấp huyết trở nên khó khăn ý thời gian dài Song gần đây, phát triển mạnh mẽ phương pháp nghiên cứu proteomics đại với độ nhạy độ xác cao cho phép nhà nghiên cứu phân tách, nhận diện nhiều protein tồn với hàm lượng tới fg/mL Một số thành phần protein hàm lượng thấp huyết bắt đầu quan tâm nghiên cứu nhiều Một hướng nghiên cứu lĩnh vực nghiên cứu phân đoạn protein bền nhiệt huyết Mặc dù chưa có nhiều thành tựu lớn, kết công bố gần gợi ý phương pháp thu nhận, phân tích nhận dạng có hiệu protein huyết bền nhiệt, đồng thời chứng minh có mối liên hệ định biến đổi tính bền nhiệt protein với trình bệnh lý, đặc biệt đái tháo đường ung thư Các nghiên cứu hệ protein bền nhiệt mới, tiềm hứa hẹn thu nhiều thành tựu quan trọng có ý nghĩa nghiên cứu sinh - y học Trong khóa luận tốt nghiệp này, chúng tơi sử dụng phương pháp điện di hai chiều 2DE khảo sát số điều kiện thực nghiệm có liên quan để thực đề tài “Phân tích protein huyết bền nhiệt kỹ thuật điện di hai chiều” với mục tiêu thu nhận, phân tách bước đầu nhận dạng, tiến tới xây dựng sở liệu hệ protein bền nhiệt huyết người Việt Nam, tạo tiền đề cho nghiên cứu sâu hệ protein này, đặc biệt mẫu bệnh lý nhằm phân tích, so sánh tìm kiếm ứng viên thị bệnh đặc hiệu Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc 1.1 TỔNG QUAN VỀ HỆ PROTEIN HUYẾT THANH NGƯỜI 1.1.1 Khái niệm huyết người Huyết tương - plasma dịch trong, màu vàng nhạt vị mặn, thu máu chống đông loại bỏ toàn thành phần tế bào Huyết tương thành phần quan trọng máu, môi trường sống tế bào máu tất tế bào thể, chiếm 55-60% thể tích máu[44] Huyết - serum phần dịch lỏng, suốt lại máu sau loại bỏ thành phần tế bào yếu tố đơng máu phần cịn lại huyết tương sau loại bỏ yếu tố đông máu Nó bao gồm nước, muối, lipid, đường, enzyme, kháng thể protein hòa tan khác Như vậy, huyết giống huyết tương protein thực vai trị đa dạng đơng máu, đáp ứng miễn dịch, cung cấp chất dinh dưỡng nhiều hoạt động sinh lý quan trọng khác thể Huyết không mẫu xét nghiệm lâm sàng mà cịn thể nhiều đặc tính hữu ích cho nghiên cứu proteomics Theo phương diện này, mẫu phân tích tiềm cho việc phát thị sinh học [8] 1.1.2 Đặc điểm, thành phần hệ protein huyết người Một người trưởng thành chứa khoảng 3,5 - lít huyết với khoảng 200 - 250 gam protein Người ta ước lượng có khoảng từ 10.000 đến 20.000 protein khác xuất huyết thời điểm định, phần lớn số chúng có mặt nồng độ thấp, cỡ ng/ml Đây mẫu giàu protein với hàm lượng thay đổi từ 60 - 80 mg/ml [9] Các protein có hàm lượng cao huyết gồm 22 loại, chiếm đến 99% lượng protein tổng số (hình 1), có albumin, immunoglobin, transferrin, haptoglobin, lipoprotein, [30] Ngồi cịn có nhiều protein khác tồn với hàm lượng thấp thấp lại giữ chức quan trọng protein làm nhiệm vụ truyền tín hiệu mơ, quan hay protein giải phóng vào máu kết phá hủy mô, nhiễm vi sinh vật, Như vậy, protein xuất huyết nhiều nguyên nhân khác gợi ý cho việc áp dụng phương pháp nghiên cứu khác để phát chúng Khố luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc Hình Biểu đồ biểu diễn thành phần 22 protein (chiếm 99%) huyết [30] Protein huyết coi hệ protein phức tạp người Một số protein có hàm lượng cao (mg/ml) albumin thông thường thay đổi từ 35-50 mg/ml (chiếm từ 50- 70%), tổng hợp hàng ngày gan (khoảng 12g) có thời gian bán hủy 21 ngày nên coi thị bệnh xơ gan hay bệnh suy dinh dưỡng [9, 10] IgG khoảng 5-7 mg/ml chiếm 10% Các protein có hàm lượng thấp (ng/ml) chiếm khoảng 1% hàm lượng protein tổng số interleukin 6, hormone, carbonhydrate antigen 125 (CA125), 2-microglobulin thông thường thay đổi từ - pg/ml coi chất thị có độ nhạy cao chẩn đốn nhiều q trình bệnh lý [43] Các nghiên cứu chứng minh protein huyết thị sinh học đủ tin cậy chẩn đoán số bệnh như: ung thư buồng trứng (CA 15-3), ung thư tuyến tiền liệt (PSA), ung thư gan (-fetoprotein) bệnh tim mạch (C-reactive protein) [3] Tuy nhiên, trải qua nhiều thập kỷ nghiên cứu có lượng nhỏ thị sinh học phát sử dụng cho mục đích chẩn đốn 1.1.3 Chức protein huyết Huyết đóng vai trị quan trọng hoạt động sống thể, môi trường trao đổi chất mô quan, đồng thời môi trường phức tạp, chứa hàng nghìn loại protein với hàm lượng khác Dựa theo chức năng, phân chia protein huyết nhóm sau [4]: Chức miễn dịch: Bao gồm Ig (đó IgA, IgG, IgM, IgD, IgE) bổ thể tham gia vào trình bảo vệ thể như: tăng thực bào, phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên (peptide, vi khuẩn, virus,…) Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc Chức đông máu: gồm chất đông máu chất chống đông (AT III, protein C, protein S ) tham gia vào q trình đơng máu bảo vệ thể Duy trì áp suất keo, độ nhớt máu: huyết thanh, protein tạo thành dung dịch keo để trì áp suất thẩm thấu, sức căng bề mặt tính đệm Chức xúc tác: enzyme có chức xúc tác cho phản ứng trình sinh học từ đơn giản đến phức tạp Vận chuyển chất: vận chuyển chất dinh dưỡng, nước, muối đến tổ chức vận chuyển chất thải, chất bã qua thận, phổi, mồ hôi, hệ tiêu hoá như: transferrin vận chuyển sắt; haptoglobin vận chuyển HST tự do; vận chuyển lipid, cholesterol Vận chuyển protein cần thiết để tổng hợp tổ chức tế bào mơ Chức điều hồ: protein có hàm lượng nhỏ (ng/ml) có vai trị quan trọng hoạt động thể Chúng bao gồm hormone, cytokine, protein ức chế đặc hiệu enzyme 1.1.4 Phân loại protein huyết theo Putnam Dựa quan điểm chức năng, Putnam (1975-1987) phân loại protein huyết thành nhóm chính: Protein tiết từ mơ rắn, immunoglobulin miễn dịch, phối tử trung gian, phối tử địa phương, chất tạm thời, sản phẩm giải phóng từ mơ, chất tiết bất thường protein ngoại lai Hệ thống phân loại thừa nhận rộng rãi trích dẫn lại nghiên cứu Anderson (2002) [9] 1.1.5 Ý nghĩa việc nghiên cứu hệ protein huyết Huyết hệ protein toàn diện, phiên lớn mẫu nghiên cứu hấp dẫn [1, 9] Sự hấp dẫn huyết tương việc chuẩn đoán bệnh định hai đặc trưng: (i) mẫu lấy dễ dàng an tồn, (ii) mẫu khơng phản ánh tồn diện kiểu hình người mà cịn cho biết trạng thái thể thời điểm đặc biệt Trong đó, mẫu khác nước bọt, nước mắt, nước tiểu, da, tóc coi tập nhỏ huyết tương mang tính địa phương phản ánh hoạt động tế bào [2] Huyết thành phần quan trọng máu, chứa nhiều protein có nguồn gốc chức khác nhau, tác động lên nhiều quan, nhiều trình sinh học khác thể Chính thành phần protein phức tạp huyết bắt nguồn từ nhiều nguồn gốc 10 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc Hình 15: Ảnh điện di SDS – PAGE khảo sát điều kiện kết tủa với TCA Đường chạy 1: Protein huyết nguyên pha loãng 40 lần; Đường chạy đến 5( nhóm I): Protein bền nhiệt thu sau xử lý kết tủa TCA điều kiện không ủ nồng độ tương ứng tăng dần: 15% - 20% - 25% 30%; Đường chạy đến (nhóm II): Protein bền nhiệt thu sau xử lý kết tủa TCA điều kiện có ủ oC 10 phút nồng độ tương ứng giảm dần: 30% - 25% - 20% 15% Kết ảnh điện di khảo sát cho thấy, có điều kiện kết tủa tương đối tốt là: (i) TCA nồng độ 30% điều kiện không ủ (ii) TCA nồng độ 25% điều kiện có ủ Tuy nhiên, kết điện di cho thấy giếng sử dụng TCA điều kiện có ủ thu nhiều băng protein hơn, đặc biệt protein có hàm lượng thấp (băng nhỏ) proten có khối lượng phân tử thấp Điều có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu với điện di 2-DE sau Bảng 8: Kết tính tốn nồng độ protein trước sau kết tủa phương pháp Bradford STT Mẫu OD Hàm lượng Huyết bền nhiệt 0.644 0.77365 Kết tủa với TCA 25% 0.612 0.7199 38 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc Hiệu kết tủa với TCA nồng độ 25% có ủ 10 phút oC kiểm tra lại số liệu đo Bradford (bảng 8) Kết thu từ phương pháp so màu Bradford cho thấy, hàm lượng protein bị hao hụt không đáng kể (khoảng 7%) so với trước kết tủa có tới 93% protein mẫu thu hồi Do đó, qua kết khảo sát này, định lựa chọn phương pháp kết tủa với TCA nồng độ 25% điều kiện có ủ oC 10 phút để chuẩn bị mẫu cho thí nghiệm điện di 2-DE 3.7 Kiểm tra hiệu loại Tris điện di 2-DE Với kết khảo sát điều kiện kết tủa để loại bỏ Tris trên, tiến hành xử lý mẫu phương pháp biến tính nhiệt, sau kết tủa protein TCA nồng độ 25% điều kiện có ủ 10 phút oC Kết tủa protein hòa tan trở lại nước cất lần đệm mẫu dùng cho điện di 2-DE Thể tích mẫu sử dụng tính toán dựa theo kết đo Bradford để đảm bảo lượng protein đưa lên Strip đạt khoảng 80g Kích thước dải pH dùng để khảo sát Strip pH 3-10, 7cm Quy trình thí nghiệm thực mục 2.2.5 Kết điện di 2-DE kiểm tra sau nhuộm dung dịch Comassive Blue Brilliant R-250 tẩy màu, so sánh với điện di 2-DE tương ứng trước loại Tris hình 16 39 Khố luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc pH 10 Hình 16: Ảnh điện di 2-DE so sánh hiệu việc loại Tris phương pháp kết tủa protein trình điện di 2-DE dải pH 3-10 (A) Trước loại Tris; (B) sau loại Tris; (C) Ảnh 2DE phóng đại mẫu sau loại Tris với vùng tiềm cho phân tích khối phổ So sánh kết điện di 2-DE trước sau kết tủa protein TCA cho thấy chiến lược phân tích dải pH 3-10 đề hợp lý Ở gel sau kết tủa (B), protein 40 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc phân tách tốt hơn, xuất nhiều điểm protein so với trước kết tủa (A) đặc biệt vùng pH khơng cịn xuất hiện tượng protein tập hợp thành hàng dọc vùng hội tụ Tris Kết cho thấy Tris loại bỏ hoàn toàn khỏi mẫu khơng cịn gây ảnh hưởng đến kết nghiên cứu điện di 2-DE dải pH 3-10 Kết cho phép lựa chọn đánh dấu vùng protein phù hợp để cắt gel, thủy phân nhận dạng phương pháp khối phổ (C) 3.8 Nhận dạng protein bền nhiệt gel hệ 1DnanoLC-ESI-MS/MS Do thời gian tiến hành nghiên cứu có hạn, chúng tơi lựa chọn phân tích, nhận dạng số protein từ kết điện di 2-DE thu Sau tiến hành so sánh điện di chiều 2-DE loại bỏ ảnh hưởng Tris, gel có dải pH 4-7, kích thước 17cm chúng tơi lựa chọn vùng protein bền nhiệt phù hợp đánh dấu, lựa chọn, thủy phân trypsin nhận dạng hệ sắc ký lỏng nano chiều kết nối trực tiếp khối phổ liên tục (1DnanoLC-ESI-MS/MS) Phổ MS/MS mảnh peptide thu so sánh với phổ MS/MS lí thuyết sở liệu NCBInr hỗ trợ phần mền Mascot v1.8 Kết vùng lựa chọn, có protein nhận dạng Alpha-1 acid glycoprotein, Haptoglobin, Haptoglobin alpha2 chain, Apolipoprotein A-I, Alpha1 antitrypsin, Alpha 2- HS- Glycoprotein Transthyretin Kết nhận dạng protein chịu nhiệt đánh dấu điện di 2-DE thể bảng Bảng 9 : Kết nhận dạng protein chịu nhiệt phương pháp 2DE-LC-MS/MS STT Tên protein Transthyretin Haptoglobin alpha chain Apolipoprotein AI Haptoglobin Alpha1 antitrypsin Alpha 2- HS- Glycoprotein Alpha acid Glycoprotein GI Number gi|1181953 gi|229323 gi|37499465 gi|4826762 gi|1942629 gi|4502005 gi|1197209 Swissprot ID P02766 P00738 P02647 P00738 P01009 P02765 P02763 KLPT 13,8 kDa 16,8 kDa 23,1 kDa 45,9 kDa 55 kDa 55,4 kDa 45 kDa pI 5.0-5.23 5.13-5.4 5.56 6.13 4.8-5.0 4.5-4.7 4.0-4.2 Tất protein nhận dạng hệ 2DE-1DnanoLC-MS/MS sở liệu NCBI xác nhận tính hợp lệ sở liệu protein Swiss-Prot viện tin sinh học Thụy Sĩ với thông số tên protein, số đăng ký, khối lượng phân tử, pI, trình tự axit 41 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc amin vị trí điện di 2DE chuẩn Danh sách protein thu hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu protein bền nhiệt huyết công bố Goufman [22] 3.9 Tìm hiểu chức số protein bền nhiệt nhận diện 3.9.1 Haptoglobin Haptoglobin protein có cấu trúc tetramer gồm hai chuỗi alpha (haptoglobin 2 chain, haptoglobin 1 chain) hai chuỗi beta (haptoglobin 2 chain, haptoglobin 1 chain), biểu gan tiết vào máu Nó glycoprotein có mặt huyết thanh, tham gia vào q trình vận chuyển liên kết với ion sắt tự nhằm ngăn chặn ion qua thận, bảo vệ thận khỏi tác động hemoglobin Mức độ glycosyl hóa haptoglobin bất thường liên quan đến trạng thái bệnh lý thể như: trình phá hủy mô, phản ứng viêm nhiễm hoại tử (necrosis) ung thư [16, 40] Haptoglobin nhận dạng với 58 trình tự peptide xác định, tổng điểm 514 phù hợp với số đăng ký gi|4826762 sở liệu NCBInr (hình 17) [5, 26] Mascot Search Results Protein View Match to: gi|4826762; Score: 514 haptoglobin [Homo sapiens] Found in search of C:\WINNT\Profiles\ADMINI~1\LOCALS~1\Temp\mas107.tmp Nominal mass (Mr): 45861; Calculated pI value: 6.13 NCBI BLAST search of gi|4826762 against nr Unformatted sequence string for pasting into other applications Taxonomy: Homo sapiens Hình 17: Kết nhận dạng haptoglobin với số đăng ký gi|4826762 Haptoglobin có khối lượng khoảng 45,861 kDa, giá trị pI = 6,13 Trong phân tích chúng tơi xác định 58 mảnh peptide có điểm số lớn 31 cho thấy tương đồng cao với haptoglobin, kết xác định trình tự số mảnh peptide 42 Khố luận tốt nghiệp K Q Vũ Khắc Ngọc V W D Q T S T Hình 18 Phổ MS/MS ion peptide (TSTQDWVQK) có m/z 602.3 với z=+2 Haptoglobin gi|4826762 So sánh trình tự peptide xác định với trình tự amino acid Haptoglobin số đăng ký gi|4826762 sở liệu NCBInr thu kết tương đồng (hình 19) Trong trình tự amino acid in đậm peptide xác định 51 101 151 201 251 301 351 401 MSALGAVIAL QCKNYYKLRT GYVEHSVRYQ KPKNPANPVQ AKNLFLNHSE KLKQKVSVNE LPVADQDQCI CYGDAGSAFA KTIAEN LLWGQLFAVD EGDGVYTLND CKNYYKLRTE RILGGHLDAK NATAKDIAPT RVMPICLPSK RHYEGSTVPE VHDLEEDTWY SGNDVTDIAD KKQWINKAVG GDGVYTLNNE GSFPWQAKMV LTLYVGKKQL DYAEVGRVGY KKTPKSPVGV ATGILSFDKS DGCPKPPEIA DKLPECEADD KQWINKAVGD SHHNLTTGAT VEIEKVVLHP VSGWGRNANF QPILNEHTFC CAVAEYGVYV HGYVEHSVRY GCPKPPEIAH KLPECEAVCG LINEQWLLTT NYSQVDIGLI KFTDHLKYVM AGMSKYQEDT KVTSIQDWVQ Hình 19 Trình tự amino acid protein haptoglobin gi|4826762 3.9.2 Apolipoprotein A (Apo) Apolipoprotein nhóm apoprotein, phải phụ thuộc vào có mặt phân tử nhỏ khác hay cofactor để thực chức năng, protein cấu thành nên lipoprotein với phân tử phospholipid, triacylglycerol, cholesterol este cholesterol Có năm loại apolipoprotein: Apo A , Apo B, Apo C, Apo D Apo E Apolipoprotein AI (ApoAI) protein gắn với lipid, vận chuyển phân tử lipid từ ruột đến gan ApoAI thành phần lipoprotein có tỷ trọng lớn hệ tuần 43 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc hồn, đóng vai trị quan trọng việc chuyển hóa loại cholesterol khỏi tế bào Các nghiên cứu cho biến đổi ApoAI có liên quan đến bệnh tim mạch Đây họ protein có khả chịu nhiệt cao Người ta cho ApoAI điều chỉnh hoạt tính enzym quan trọng chế chuyển hóa lipoprotein Sự thay đổi nồng độ ApoAI coi thị nhiều loại ung thư khác ung thư vú [24], ung thư ruột kết [42], ung thư buồng trứng [34] Bằng phương pháp sắc ký lỏng Nano kết nối khối phổ hỗ trợ phần mềm Mascot v1.8, nhận dạng apoA-I phù hợp với số đăng ký gi|37499465 sở liệu NCBInr hình 20 Mascot Search Results Protein View false 351.31 351.31 Match to: gi| 37499465; Score: 351 apolipoprotein A-I [Homo sapiens] Found in search of C:\WINNT\Profiles\ADMINI~1\LOCALS~1\Temp\mas34E.tmp Nominal mass (Mr): 30759; Calculated pI value: 5.56 NCBI BLAST search of gi|37499465 against nr Unformatted sequence string for pasting into other applications Taxonomy: Homo sapiens Hình 20 Kết nhận dạng ApoA-I với số đăng ký gi|37499465 ApoA-I nhận dạng có tổng điểm 351 cho thấy kết thu qua thực nghiệm phù hợp với trình tự ApoA-I sở liệu với trình tự peptide xác định Hình 21 phổ MS/MS số peptide xác định 44 Khoá luận tốt nghiệp R Vũ Khắc Ngọc L E D S Y P A L H Hình 21 Phổ MS/MS ion peptide (HLAPYSDELR) có m/z 651.3 với z=+2 apoA-I gi|37499465 So sánh trình tự peptide xác định với trình tự amino acid ApoA-I số đăng ký gi|37499465 sở liệu NCBInr thu kết tương đồng (hình 22) Trong trình tự amino acid in đậm peptide xác định 51 101 151 201 251 MKAAVLTLAV RDYVSQFEGS KETEGLRQEM QEGARQKLHE RLEALKENGG VSFLSALEEY LFLTGSQARH ALGKQLNLKL SKDLEEVKAK LQEKLSPLGE ARLAEYHAKA TKKLNTQ FWQQDEPPQS LDNWDSVTST VQPYLDDFQK EMRDRARAHV TEHLSTLSEK PWDRVKDLAT FSKLREQLGP KWQEEMELYR DALRTHLAPY AKPALEDLRQ VYVDVLKDSG VTQEFWDNLE QKVEPLRAEL SDELRQRLAA GLLPVLESFK Hình 22: Trình tự amino acid protein apoA-I gi|37499465 3.9.3 Transthyretin (TTR) Transthyretin – TTR (hay prealbumin) glycoprotein (55 kDa) tiết gan vào hệ tuần hoàn Transthyretin gồm đơn phân (homotetramer), đơn phân polypeptid dài 127 axit amin có nhiều cấu trúc gấp nếp β Transthyretin protein đóng vai trị quan trọng việc vận chuyển hocmon thyroid đến mơ đích coi 45 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc biomarker đánh giá tình trạng dinh dưỡng nhiều bệnh khác bệnh tụy [28], bệnh thận giai đoạn cuối [41] ung thư phổi [33] Transthyretin huyết với số đăng ký gi|1181953 sở liệu NCBInr nhận dạng với tổng điểm cao 274 (hình 23) Mascot Search Results Protein View Match to: gi|1181953; Score: 274 Transthyretin [Homo sapiens] Found in search of c:\winnt\pROFILES\admini~1\locals~1\tEMP\ MAS19c.TMP Nominal mass (Mr): 13809; Calculated pI value: 5.55 NCBI BLAST search of gi|1181953 against nr Unformatted sequence string for pasting into other applications Taxonomy: Homo sapiens Hình 23 Kết nhận dạng transthyretin với số đăng ký gi|1181953 Mỗi đơn phân transthyretin polypeptide với 127 amino acid, kích thước phân tử 13,809 kDa pI=5.55 Kết xác định peptide có trình tự amino acid giống với trình tự amino acid transthyretin có số đăng ký sở liệu NCBInr Hình 24 kết xác định trình tự số peptide nhận R F R V R H R V R A R V R N R I R A R P R 46 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc Hình 24 Phổ MS/MS ion peptide (GSPAINVAVHVFR) transthyretin gi|1181953 So sánh trình tự peptide xác định với trình tự amino acid transthyretin sở liệu NCBInr cho thấy chúng có độ tương đồng cao 55% (hình 25) GPTGTGESKC PLMVKVLDAV RGSPAINVAV HVFRKAADDT WEPFASGKTS 51 ESGELHGLTT EEQFVEGIYK VEIDTKSYWK ALGISPFHEH AEVVFTANDS 101 GPRRYTIAAL LSPYSYSTTA VVTNPKE Hình 25 Trình tự amino acid transthyretin với số đăng ký gi|1181953 47 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu trình bày trên, chúng tơi xin đưa số kết luận kiến nghị sau: Kết luận Bằng phương pháp biến tính nhiệt Goufman, xử lý thu nhận thành công phân đoạn chứa protein bền nhiệt huyết người, phục vụ cho nghiên cứu proteomics Thông qua trình khảo sát, đánh giá tối ưu hóa đề chiến lược hợp lý hiệu nhằm phân tích hệ protein huyết bền nhiệt kỹ thuật điện di hai chiều 2-DE Strip có kích thước dải pH khác Kết điện di 2-DE thành công tạo điều kiện cho việc nhận dạng protein bền nhiệt khối phổ theo hướng kết hợp điện di hai chiều 2-DE với sắc ký lỏng nano chiều, ion hóa nguồn ESI nhận dạng khối phổ liên tục MS/MS (2DE-1DnanoLC-ESI-MS/MS) Danh sách protein bền nhiệt nhận dạng hoàn toàn phù hợp với cơng bố có hệ protein bền nhiệt huyết với sở liệu có protein huyết Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện phương pháp nghiên cứu hệ protein huyết bền nhiệt, mở rộng việc khảo sát protein dài pH hẹp kích thước lớn nhằm đánh giá đầy đủ xây dựng sở liệu hoàn chỉnh protein bền nhiệt người Việt Nam bình thường, đóng góp vào cơng bố danh sách protein người theo sáng kiên tổ chức HUPO giới Tiếp tục nghiên cứu hệ protein bền nhiệt đối tượng khác nhau, đặc biệt quan tâm đến nhóm bệnh lý ung thư, đái tháo đường, …., phân tích, so sánh nhằm tìm thay đổi biểu người thường với người bệnh, tạo sở cho việc tìm kiếm ứng viên thị protein phục vụ cho điều trị chẩn đoán 48 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc Tiếp tục nghiên cứu protein bền nhiệt theo hướng phân tích mặt cấu trúc nhằm lý giải nguyên nhân làm nên tính bền nhiệt, thay đổi cấu trúc liên quan đến tính bền nhiệt ứng dụng hiểu biết vào việc phát triển cơng nghệ protein TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phan Văn Chi (2003), Proteomics nghiên cứu ứng dụng, Tạp chí Công Nghệ Sinh học, 1(4), tr 397-414 Phan Văn Chi (2006), Proteomics: Khoa học hệ protein, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, tr 112-129 Đỗ Ngọc Liên (2004), Miễn dịch học sở, Nhà xuất Đại học Quốc gia, Hà nội Đỗ Trung Phấn (2004), Bài giảng huyết học-truyền máu, Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội Vũ Minh Thiết, Nguyễn Nam Long, Đặng Thành Nam, Phan Văn Chi (2004), Nghiên cứu hệ protein huyết người sắc ký lỏng đa chiều kết hợp với khối phổ MS/MS, BCKH Hội Nghị Toàn Quốc 2004, NCCB Đinh hương Y-Dược học, Học viện Quân Y, Hà Nội, 27-27/10/2004, tr 470-474 Tiếng Anh Adkins J., Susan N., Varnum M., Auberry K.J (2002), Toward a human bloodserum proteome analysis by multimensional seperation coupled with mass spectrometry, Molecular Cellular proteomics, 1, pp 947-955 Aebersold R., Mann M (2003), Mass spectrometry-based proteomics, Nature, 422(6928), pp 198–207 Anderson N L., Anderson N G (1998), Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words, Electrophoresis, 19(11), pp 1853-1861 Anderson N L., Anderson N G (2002), The human plasma proteome, history, character and diagnostic prospects, Molecular Cellular Proteomics, 1, pp 845-867 10 Anderson N L., Polanski M., Rembert P., Gatlin T., Tirumalai R S., Conrads T P., Veenstra T D., Adkins J N., Pounds J G., Fagan R., Anna L (2004), The Human Plasma Proteome-A Nonredundant List Developed by Combination of Four Separate Sources, Molecular & Cellular Proteomics, 3, pp 311-326 11 Anderson N L (2005), The Diagnostic Proteome: Multivariate Markers in Plasma, Founder & CEO, Plasma Proteome Institute Board Member, Dade Behring 12 Bradford M M (1976), A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 72, pp 49 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc 248–254 13 Chan K C., Lucas D A., Hise D., Schaefer C F., Xiao Z., Janini G M., Kenneth H B., Haleem J I., Veenstra T D., Conrads T P (2004), Analysis of the Human serum proteome, Clinical Proteomics I, 1(2), pp 101-225 14 Choe L H., Lee K H (2000), A comparison of three commercially available isoelectric focusing units for proteome analysis: The multiphor, the IPGphor and the protean IEF cell, Electrophoresis, 21, pp 993-1000 15 Ducret A., Bruun C F., Bures E J., Marhaug G., Husby G and Aebersold R (1996), Characterization of human serum amyloid A protein isoforms separated by twodimensional electrophoresis by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry, Electrophoresis, 17, pp 866–876 16 Fella K., Gluckmann M., Hellman J., Karas M., Kramer P J., Kroger M (2005 ), Use of two-dimensional gel electrophoresis in predictive toxicology: Identification of potential early protein biomarkers in chemically induced hepatocarcinogenesis, Proteomics, 5, pp 1914-1927 17 Gary B S., Myra H R (2007), Tris interference in IEF and 2-DE, Electrophoresis, 28, pp 1601–1606 18 Gomori G (1955), Preparation of Buffers for Use in Enzyme Studies, Methods Enzymology, 1, pp 138-146 19 Gorg A (1991), Two-dimensional electrophoresis, Nature, 349, pp 545-546 20 Gorg A., Obermaier C., Boguth G., Harder A., Scheibe B., Wildgruber R., Weiss W (2000), The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients, Electrophoresis, 21, pp 1037-1053 21 Gorg A., Weiss W., Dunn J M (2004 ), Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics, Proteomics, 4, pp.3665–3685 22 Goufman E I., Moshkovskii S A., Tikhonova O V., Lokhov P G., Zgoda V G., Serebryakova M V., Toropygin I Y., Vlasova M A., Safarova M R., Makarov O V., Archakov A I (2006), Two-dimensional electrophoretic proteome study of serum thermostable fraction from patients with various tumor conditions, Biochemistry (Mosc), 71(4), pp 354-360 23 Gromov P S., Ostergaard M., Gromova I., Celis J E, (2002 ), Human proteomic databases: a powerful resource for functional genomics in health and diesease, Prog Biophys Mol Biol., 80, pp 3-22 24 Huang H L., Stasyk T., Morandell S., Dieplinger H., Falkensammer G., Griesmacher A., Mogg M., Schreiber M., Feuerstein I., Huck C W., Stecher G., Bonn G K., Huber L A (2006 ), Biomarker discovery in breast cancer serum using 2-D differential gel electrophoresis/ MALDI-TOF/TOF and data validation by routine clinical assays, 50 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc Electrophoresis, 27(8), pp.1641-1650 25 Klose J., Kobalz U (1995), Two-dimensional electrophoresis of proteins: An updated protocol and implications for a functional analysis of the genome, Electrophoresis, 16(6), pp 1034-1059 26 Krajewska M., Krajewski S., Banares S., Huang X., Turner B., Bubendorf L., Kallioniemi O., Shabaik A., Vitiello A., Peehl D., Gao G J., Reed J C (2003 ), Elevated Expression of Inhibitor of Apoptosis Proteins in Prostate, Cancer Clinical & Cancer Research, 9, pp 4914-4925 27 Laemmli U K (1970 ), Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4, Nature, 227, pp 680-685 28 Lasztity N., Biro L., Nemeth E., Pap A., Antal M (2002), Transthyretin is a sensitive biomarker of malnutrition in acute and chronic pancreatitis, Clin Chem Lab Med., 40, pp 1320-1324 29 LeiJiang L H., Michael F (2004 ), Comparison of protein precipitation methods for sample preparation prior to proteomic analysis, Journal of Chromatography A, 1023, pp 317–320 30 Li J., Kelly J F., Chernushevich I., Harrison D J., Thibault P (2000), Separation and Identification of Peptides from Gel-Isolated Membrane Proteins Using a Microfabricated Device for Combined Capillary Electrophoresis/ Nanoelectrospray Mass Spectrometry, Anal Chem, 72, pp 599-609 31 Li X., Dina A., Fred R (2003), Comparative Proteomics of Glycoproteins Based on Lectin Selection and Isotope Coding, Journal of Proteome Research, 2, pp 618-625 32 Liebler D C (2002), Introduction to Proteomics:Tools for the New Biology, Humana Press Totowa, New Jersey, pp 31-49 33 Maciel C M., Junqueira M., Paschoal M E., Kawamura M T., Duarte R L., Carvalho Mda G., Domont G B (2005), Differential proteomic serum pattern of low molecular weight proteins expressed by adenocarcinoma lung cancer patients, J Exp Ther Oncol, 5(1), pp 31-38 34 Moore L E., Fung E T., McGuire M., Rabkin C C., Molinaro A., Wang Z., Zhang F., Wang J., Yip C., Meng X Y., Pfeiffer R M (2006), Evaluation of apolipoprotein A1 and posttranslationally modified forms of transthyretin as biomarkers for ovarian cancer detection in an independent study population, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 15(9), pp 1641-1646 35 Nagele E., Vollmer M., Horth P (2003), Two-dimensional nano-liquid chromatography– mass spectrometry system for applications in proteomics, Journal of Chromatography A, 1009, pp 197–205 36 O'Farrel P.H (1975), High resolution two-dimentional electrophoresis of proteins, J Biol 51 Khoá luận tốt nghiệp Vũ Khắc Ngọc Chem, 250, pp 4007-4021 37 Rabilloud T (1998), Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis, Electrophoresis, 19, pp 758–760 38 Rabilloud T (1999), Solubilization of proteins in 2-D electrophoresis, An outline, Methods Mol Biol , 112, pp 9–19 39 Righetti P G (1990), Recent developments in electrophoretic methods, J Chromatogr, 516, pp 3–22 40 Saraiva M J (1995 ), Transthyretin mutations in health and disease, Human Mutation, 5(3), pp 191-196 41 Sreedhara R., Avram M., Blanco M., Batish R., Mittman N (1996), Prealbumin is the best nutritional predictor of survival in hemodialysis and peritoneal dialysis, American Journal of Kidney Disease, 28, pp 937-942 42 Tachibana M., Ohkura Y., Kobayashi Y., Sakamoto H., Tanaka Y., Watanabe J., Amikura K., Nishimura Y., Akagi K (2003 ), Expression of apolipoprotein A1 in colonic adenocarcinoma, Anticancer Research, 23(5), pp 4161-4167 43 Tirumalai, R S., Chan, K C., Prieto, D A., Issaq, H J., Conrads, T P., Veenstra, T D (2004), Characterization of the Low Molecular Weight Human Serum Proteome, Molecular & Cellular Proteomics, 2, pp 1096-1103 44 Turner M W., Hulme B (1970), The Plasma Proteins: An Introduction, Pitman Medical & Scientific Publishing Co., Ltd., London 45 Wilkins M R., Williams K L., Appel R D., Hochstrasser D F (1997), Proteome Research: New Frontiers in Functional Genomics Springer, Berlin 46 YaJin G L., Tomoko O., Takashi M (2002), Estimation of isoelectric points of human plasma proteins employing capillary isoelectric focusing and peptide isoelectric point markers, Electrophoresis, 23, pp 3385–3391 52 ... 2.2.4 Phân tích protein kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) 18 2.2.5 Phân tách protein bền nhiệt kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) .19 2.2.6 Thủy phân protein gel enzym trypsin 20 2.2.7 Phân. .. băng protein 2.2.5 Phân tách protein bền nhiệt kỹ thuật điện di hai chiều (2-DE) 2-DE kỹ thuật phân tách protein dựa khác điểm đẳng điện khối lượng phân tử gel polyacrylamide Ở chiều điện di thứ... Ở chiều điện di thứ hai (điện di biến tính SDS-PAGE), protein giá trị pH định tiếp tục phân tách theo khối lượng phân tử Điện di chiều thứ (điện di đẳng điện) Protein huyết sau xử lí nhiệt loại