Untitled TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 20, SOÁ T3–2017 Trang 5 Phân lập và tuyển chọn Lactobacillus spp kháng Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng chết sớm trên tôm tại Sóc Trăng Đỗ Thị Thanh D[.]
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T3–2017 Phân lập tuyển chọn Lactobacillus spp kháng Vibrio parahaemolyticus gây hội chứng chết sớm tơm Sóc Trăng Đỗ Thị Thanh Dung Võ Đình Quang Chi nhánh Viện Ứng dụng Công nghệ TP.HCM Phan Thị Phƣợng Trang TT Khoa học & CN Sinh học–Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Qu c gia thành ph H Ch Minh TÓM TẮT (Bài nhận ngày 12 tháng 10 năm 2016, nhận đăng ngày 26 tháng 07 năm 2017) thấy chủng có khả đối kháng với Bệnh chết sớm tôm chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh EMS yếu tố ảnh hưởng đến phát triển tơm Trong đó, chủng TA7L1 có khả ngành ni trồng thủy sản Việc sử dụng chế đối kháng mạnh xác định thuộc phẩm sinh học đối kháng với tác nhân gây bệnh loài Lactobacillus plantarum phương pháp chiến lược thay thuốc kháng sinh giải trình tự 16S rDNA MALDI –TOF Chủng có tiềm ứng dụng để kiểm sốt vi khuẩn vi khuẩn TA7L1 đánh giá an toàn có gây bệnh Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiềm ứng dụng sản xuất chế phẩm vi phân lập sàng lọc chủng sinh phịng bệnh EMS tơm LactobacillIus từ 30 mẫu bùn, nước tơm ni Sóc Trăng Qua khảo sát, chúng tơi nhận Từ khóa: Hội chứng chết sớm - EMS, Hoại tử gan tụy cấp–AHPNS, Lactobacillus, V parahaemolyticus MỞ ĐẦU Trong năm gần đây, tượng tôm nuôi bị chết hàng loạt biết đến với tên gọi hội chứng chết sớm (Early mortality syndrome–EMS) hay gọi hội chứng hoại tử gan tụy cấp (Acute hepatopancreatic necrosis syndrome–AHPNS), nguyên nhân tượng dòng vi khuẩn Vibrio parahaemolyticus đặc biệt gây ra, gây thiệt hại nặng cho ngành ni tơm Việt Nam [4] Trong Sóc Trăng tỉnh bị thiệt hại nặng nề [3] Cho đến nay, chưa có thu c điều trị đặc hiệu cho dịch bệnh này, hầu hết dòng vi khuẩn V parahaemolyticus kháng hoàn toàn với oxytetracylin, kháng sinh chủ yếu trộn vào thức ăn ni tơm định kỳ Do sử dụng kháng sinh để trị bệnh khơng có hiệu quả, ngồi việc sử dụng kháng sinh cịn gây ảnh hưởng đến môi trường nuôi tôm, đến tăng trưởng tôm gây ảnh hưởng đến chất lượng tơm Nhiều nghiên cứu ngồi nước cho thấy, việc sử dụng vi khuẩn Lactobacillus để ức chế s lồi Vibrio spp gây bệnh Vibriosis tơm cho thấy t nh hiệu [1, 8] Ở nước ta nay, chế phẩm vi sinh dùng nuôi tr ng thủy hải sản nhập ngoại với giá thành cao chưa thật phù hợp với điều kiện kh hậu Việt Nam Đặc biệt chưa có nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh kháng bệnh EMS tôm Việc nghiên cứu chọn lựa dịng vi khuẩn có khả đ i kháng vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh EMS tôm giúp sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trị bệnh EMS vấn đề cần thiết giai đoạn Trang Science & Technology Development, Vol 3, No.T20–2017 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Vật liệu Đối tượng nghiên cứu Chủng Lactobacillus phân lập từ mẫu bùn đáy ao, mẫu nước hệ tiêu hóa tơm khỏe lấy khu vực ao nuôi tôm tỉnh Sóc Trăng Chủng vi khuẩn V parahaemolyticus gây hội chứng EMS nghiên cứu phân lập từ tôm bệnh ao tơm nhiễm bệnh tỉnh Sóc Trăng Môi trường sử dụng nghiên cứu Môi trường phân lập nuôi cấy V parahaemolyticus: TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose) Merck, TSB (Tryptic Soy Broth): casein peptone 15 g, soya peptone g, NaCl 15 g, nước cất vừa đủ l t Môi trường chọn lọc V parahaemolyticus: CAV (Chrom Agar Vibrio) nhà cung cấp CHROMEAGAR, môi trường KIA (kligler Iron agar): pepton 10 g, lactose 20 g, glucose g, NaCl g, feric ammonium citrate 0,5 g, Na2S2O3 0,5 g, phenol red 0,025 g, Agar %, nước cất vừa đủ l t Môi trường phân lập nuôi cấy Lactobacillus: MRS (Man Rogosa Sharpe): peptone 10 g, cao thịt g, cao nấm men g, glucose 10 g, tween 80 mL, diammonium hydrogen citrate g, CH3COONa g, MgSO4.7H2O 0,2 g, MnSO4 H2O 38 mg, K2HPO4 g, nước cất vửa đủ l t Môi trường thạch MRSA: thành phần có bổ sung thêm % agar Các môi trường hấp khử trùng 121 oC, 15 phút trước sử dụng Phƣơng pháp Phân lập, làm V parahaemolyticus, Chọn tơm có triệu chứng bệnh tương tự EMS/AHPNS mô tả Lightner cs (2012), tiến hành phân lập làm môi trường chọn lọc TCBS Tôm khử trùng bề mặt c n 70o lau Dùng kẹp tách bỏ phần giáp đầu ngực, khử trùng bề mặt gan tụy tôm, dùng que cấy tiệt trùng lấy t mẫu gan tụy tôm cấy lên đĩa thạch có mơi trường TCBS Đĩa cấy ủ Trang 28 oC 24 Chọn khuẩn lạc đặc trưng cho V parahaemolyticus (to, màu xanh) để làm cách cấy ria môi trường TCBS– agar Chủng sau làm bảo quản glycerol -80 oC Phân lập, làm Lactobacillus Pha lỗng mẫu tơm, mẫu nước, mẫu bùn đáy ao ni tôm đến n ng độ th ch hợp nước mu i sinh lý 0,85–0,9 ‰, cấy trãi đĩa petri có chứa mơi trường MRSA có bổ sung CaCO3, nuôi cấy 37 oC 24 Chọn khuẩn lạc riêng lẽ có vịng phân giải CaCO3 để tiếp tục làm môi trường thạch đĩa, chủng sau làm bảo quản glycerol -80 oC [2] Định danh V parahaemolyticus, Lactobacillus Đ i với dịng vi khuẩn V parahaemolyticus: Hình dạng, k ch thước vi khuẩn xác định phương pháp nhuộm Gram Các đặc điểm sinh lý sinh hóa xác định dựa khóa phân loại Bergey, 1957 Dựa vào đặc t nh V parahaemolyticus oxidase catalase dương t nh, hình que, Gram âm, không sinh bào tử, di động, không lên men đường sucrose, không sinh hơi, không sinh H2S để xác định chủng V parahaemolyticus, sử dụng chủng V parahaemolyticus cung cấp Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học Trường Đại học Khoa học Tự nhiên làm đ i chứng Đ i với chủng vi khuẩn Lactobacillus xác nhận thông qua đặc t nh sinh trưởng t t chiếm ưu môi trường MRS, tế bào hình que, Gram dương, catalase (-) oxydase (-), có khả sinh lactic acid, khơng có khả hình thành bào tử, khơng di động Các chủng sau định danh sinh hóa lựa chọn tiến hành định danh đến lồi phương pháp giải trình tự 16S rDNA: Tách chiết gen vi khuẩn kit QIAgen, khuếch đại trình tự 16S rRNA phản ứng PCR với cặp m i có trình tự sau: 27F (5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) 1492R (5’- TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 20, SỐ T3–2017 TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’) Sản phẩm PCR tinh chế gửi giải trình tự Các trình tự nucleotide hoàn chỉnh so sánh với ngân hàng liệu gen NCBI cách sử dụng công cụ BLAST Sau chủng vi khuẩn lựa chọn định danh phân t ch trình tự 16S rDNA kiểm tra lại phương pháp sử dụng công nghệ kh i phổ protein (MALDI–TOF) So sánh tương đ ng phổ protein từ mẫu vi sinh vật mục tiêu với sở liệu gần 6000 chủng vi sinh vật khác Nuôi cấy thử độc lực V parahaemolyticus tôm nuôi Tiến hành nuôi cấy chủng phân lập môi trường bổ sung % NaCl) nuôi 24 28 0C tái lây nhiễm tôm khỏe theo mô tả Trần Hữu Lộc (2013)[9] Th nghiệm lặp lại lần với chủng V parahaemolyticus phân lập Lượng tôm th nghiệm 10 cho bể 10 l t chuẩn bị với n ng độ mu i 10 ±1 ‰ Bổ sung V parahaemoliticus gây bệnh để đạt n ng độ nước nuôi tôm 106 CFU/mL Tôm cho ăn lần ngày quan sát lần ngày Tiến hành chẩn đốn tơm bị nhiễm EMS/AHPNS biểu bên ngồi phân t ch mơ học [9] Đánh giá lựa chọn dịng có độc lực mạnh gây hội chứng chết sớm tôm với biểu bên ngồi phân t ch mơ học tương tự mô tả Lighter cộng 2013 [9] Khảo sát khả parahaemolyticus đối kháng với Sử dụng phương pháp đĩa thạch lớp Dopazo cộng (1988) với s thay đổi nhỏ [1] phương pháp khuếch tán qua lỗ thạch [6, 7] để khảo sát đặc t nh đ i kháng với vi khuẩn V paraheamolyticus Th nghiệm lặp lại lần đ i với chủng vi khuẩn cần chọn lọc, kết giá trị trung bình cộng lần lặp lại Mức độ đ i kháng đánh giá dựa vào k ch thước vòng đ i kháng (x): Không đ i kháng (-): x = mm; Đ i kháng yếu (+): < x