Untitled TAÏP CHÍ PHAÙT TRIEÅN KH&CN, TAÄP 19, SOÁ T4 2016 Trang 57 Phân lập và sàng lọc các chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính chống oxy hóa từ một số cây họ Zingiberaceae và Rutaceae Võ Thị N[.]
TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 Phân lập sàng lọc chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính chống oxy hóa từ số họ Zingiberaceae Rutaceae Võ Thị Ngọc Mỹ Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Nguyễn Văn Thanh Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Nguyễn Đinh Nga Trường Đại học Y – Dược Tp Hồ Chí Minh (Bài nhận ngày 30 tháng 07 năm 2015, nhận đăng ngày 30 tháng 08 năm 2016) TÓM TẮT Họ Zingiberaceae Rutaceae có nhiều ứng gừng, nguyệt quế xác định có khả dụng việc điều trị bệnh Lá, thân, thân rễ sản sinh hoạt chất chống oxy hóa Hoạt tính vỏ họ chứa nhiều tinh đánh bắt gốc tự DPPH chủng dầu, hứa hẹn nơi cung cấp môi trường định lượng sau: chủng R-TN3 sống hữu ích cho nhóm vi sinh vật nội sinh (62,32 %) cho hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, khác Trong nghiên cứu này, chủng vi chủng G1-TL3 NQ-TN3 cho hoạt tính sinh vật nội sinh Streptomyces sp., Aspergillus chống oxy hóa trung bình thấp chủng T-TG3 (30,95 %) terreus, Cladosporium sp., Penicillium sp phân lập từ phận tắc, riềng, Từ khóa: Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, Streptomyces, vi sinh vật nội sinh MỞ ĐẦU Gần nhà khoa học chứng minh có mối liên hệ gia tăng gốc tự thể với việc tăng nguy ung thư, bệnh tim mạch người Gốc tự thúc đẩy q trình oxy hóa, gây tổn hại cấu trúc DNA, tổn thương làm DNA mã khơng xác dẫn đến hình thành tế bào ung thư Bên cạnh gốc tự gây tổn thương tế bào, gây bệnh thối hóa, suy yếu hệ thống miễn dịch, sớm xuất hiện tượng lão hóa Do vậy, nghiên cứu chất chống oxy hóa ngày quan tâm để tìm cách hạn chế gốc tự tạo nhằm phòng ngừa bệnh cách hiệu [1, 3] Chất chống oxy hóa ngoại sinh cung cấp cho thể sản xuất từ nhiều đường chiết xuất từ thực vật, sinh vật, hóa tổng hợp… So với chất chống oxy hóa tổng hợp, việc sử dụng chất chống oxy hóa tự nhiên vitamin C, carotenoid, flavonoid, hợp chất phenol… an tồn, tác dụng phụ Trước đây, chất chống oxy hóa tự nhiên thường chiết xuất từ thực vật, nhiên nguồn chịu ảnh hưởng đất yếu tố mơi trường, quy trình chiết sử dụng dung mơi phần làm tính tự nhiên hoạt chất Việc sử dụng nguồn cung cấp hoạt chất chống oxy hóa từ vi sinh vật có ưu so với từ thực vật phân bố rộng rãi tự nhiên, dễ nuôi cấy với quy mô lớn, mơi trường tốn kém, tăng trưởng nhanh, nhiên lại chưa quan tâm nhiều Do đó, việc nghiên cứu tìm kiếm nguồn cung cấp hoạt chất chống oxy hóa từ vi sinh vật Trang 57 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 nội sinh mở hướng nghiên cứu việc phòng bệnh tăng cường sức khỏe [1, 2] phát triển ứng dụng tiềm công nghệ sinh học vi sinh vật nội sinh để phát triển giống trồng có khả khử độc đồng thời khả sản xuất sinh khối nhiên liệu sinh học Vi sinh vật nội sinh tác nhân cân hệ vi sinh vật chủ nhằm ngăn chặn tác nhân gây bệnh Nhiều tài liệu cho thấy sống cộng sinh mô thực vật, chúng sản xuất nhiều chất có tác dụng sinh học kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư Do đó, chúng nguồn nghiên cứu dồi để chiết tách hoạt chất từ vi sinh vật nội sinh dùng chữa trị nhiều bệnh ứng dụng dụng y học [2, 4] Vi sinh vật nội sinh tìm thấy hầu hết lồi thực vật, chúng cư trú nội mô chủ chúng hình thành loạt mối quan hệ khác cộng sinh tương hỗ, cộng sinh dinh dưỡng, hội sinh Hầu hết dạng nội sinh bắt đầu xuất từ vùng rễ hay bề mặt lá, nhiên, số lồi nội sinh hạt Vi sinh vật nội sinh thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng suất đóng vai trị tác nhân điều hịa sinh học Bên cạnh đó, chúng cịn sản xuất hàng loạt sản phẩm tự nhiên có lợi cho chủ mà người VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP khai thác tác nhân để ứng dụng y học, nơng nghiệp hay cơng nghiệp Ngồi Nguồn mẫu phân lập chúng cịn có tiềm loại bỏ chất gây ô Nguồn mẫu thu thập từ vườn nhà nhiễm đất cách tăng cường khả vườn dược liệu Các mẫu sau cắt khỏi khử độc thực vật làm cho đất trở nên màu cho vào túi nylon xử lý vịng 24 mỡ thơng qua chu trình phosphate cố định đạm Ngày có nhiều quan tâm việc Bảng Danh sách sử dụng nghiên cứu STT Tên địa phương Tắc Riềng Gừng Nguyệt quế Tên khoa học Fortunella japonica Thunb Alpinia officinarum Hance Zingiber officinale Rose Murraya paniculata L Jack Xử lý phân lập mẫu Chọn sống môi trường tự nhiên, khỏe mạnh, khơng cịi cọc, khơng bị sâu hại hay biểu bệnh đốm lá, vàng cây… Mẫu thu thập rửa với nước, để nơi khô mát sau xử lý phịng thí nghiệm điều kiện vô trùng Mẫu đặt môi trường thạch nước, không chứa chất dinh dưỡng khác Theo dõi phát triển vi sinh vật nội sinh từ mẫu thời gian khoảng - 14 ngày Tiếp tục cấy chuyển vi sinh vật nội sinh sang môi trường chứa chất dinh dưỡng (PDA) ủ nhiệt độ phòng theo dõi phát triển, xác định đặc điểm vi sinh vật khảo sát hoạt tính chống oxy hóa Trang 58 Thời gian thu mẫu 22/11/2013 22/11/2013 29/11/2013 29/11/2013 Định tính hoạt tính chống oxy hóa chủng vi sinh vật nội sinh Đối với chủng nấm thu tiến hành sau: lấy nấm rìa khuẩn lạc thạch PDA cấy sang môi trường Czapek - Dox, ủ nhiệt độ phịng/7 ngày Sau ngày ni cấy, đổ dung dịch NaCl 0,85 % ngập mặt thạch Czapek dox, sử dụng que trải nhẹ để thu hỗn dịch bào tử nấm Sử dụng dung dịch NaCl 0,85 % để điều chỉnh T % hỗn dịch khoảng 80–85 % (tương ứng 1,2 - 1,4 x 106 bào tử/mL) Cấy hỗn dịch điều chỉnh với tỉ lệ % (1,5 mL) vào 30 mL môi trường PDB, ủ nhiệt độ phịng/7 ngày Tiến hành thu tồn dịch ni cấy, đặt hỗn hợp TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 thu bể siêu âm 30 phút Sau ly tâm hỗn hợp sau siêu âm 10.000 g oC 10 phút, thu dịch nổi, lọc dịch với giấy lọc Whatman No1 Dịch lọc thu mẫu thử cho thử nghiệm [6] Xác định hoạt chất chống oxy hóa phương pháp nhuộm DPPH nhanh Phương pháp đưa Gao cộng năm 2008, dựa chế chống oxy hóa cách đánh bắt gốc tự hay chất cho hydrogen nhằm làm giảm gốc tự hữu DPPH Sản phẩm thu sau phản ứng có màu vàng đến vàng trắng Bằng cách đặc cố định mẫu thử silica gel sau cho mẫu tiếp xúc với lượng xác định dung dịch DPPH phát hoạt tính chống oxy hóa nồng độ chất chống oxy hóa thấp [6] Mẫu có hoạt tính chống oxy hóa (dương tính) xuất vịng trắng tím Mẫu khơng có hoạt tính chống oxy hóa (âm tính) khơng xuất vịng trắng, giống với mẫu nước cất mơi trường khơng có vi sinh vật Khả chống oxy hóa đánh giá độ chênh lệch màu chứng dương vitamin C với nước cất, đánh giá mức độ +, ++, +++ Các chủng vi sinh vật có hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp nhuộm DPPH nhanh tiếp tục thử nghiệm định lượng hoạt chất chống oxy hóa Định lượng hoạt chất chống oxy hóa Định lượng dựa khả đánh bắt gốc tự DPPH, thử nghiệm lặp lại lần, ghi nhận kết trung bình Phương pháp dựa chế chống oxy hóa cách dập tắt gốc tự nhằm làm giảm gốc tự hữu DPPH Hoạt tính chống oxy hóa xác định dựa giảm độ hấp thu DPPH bước sóng 517 nm Khả đánh bắt gốc tự xác định cách đo giảm hấp thu bước sóng 517 nm, tính dựa cơng thức sau: S (%) = (1- (A1-A2)/A0)*100 A1: giá trị OD dịch nuôi cấy sau phản ứng với DPPH; A2: giá trị OD phản ứng khơng có DPPH; A0: giá trị OD phản ứng khơng có dịch ni cấy [6] Định danh chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính chống oxy hóa cao Tên khoa học vi sinh vật nội sinh cho chất biến dưỡng mơi trường có hoạt tính chống oxy hóa xác định phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc đặc điểm vi học (đặc điểm khuẩn lạc, mặt phải, mặt trái, tốc độ phát triển, đặc điểm vi học,…) Sử dụng chuyên luận nhóm phân loại để định danh theo Guy St Germain (1995) [5] KẾT QUẢ - THẢO LUẬN Phân lập sàng lọc vi sinh vật nội sinh có hoạt tính chống oxy hóa từ số thuộc họ Rutaceae Zingiberaceae Phân lập số chủng vi sinh vật nội sinh từ tắc, riềng, gừng, nguyệt quế thuộc họ Rutaceae Zingiberaceae (Bảng 2) Bảng Số lượng chủng chống oxy hóa STT Thực vật Tắc Riềng Gừng Nguyệt quế Tổng cộng Số lượng chủng 17 11 25 61 Chủng chống oxy hóa 2 Trang 59 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Định lượng chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính chống oxy hóa cho hoạt tính chống oxy hóa cao nhất; chủng TTG3 (30,95 %) cho hoạt tính chống oxy hóa thấp so với chủng lại Sau trải qua q trình định lượng, chúng tơi thu kết sau với chủng cụ thể dựa phương pháp đánh bắt gốc tự DPPH Mức độ chống oxy hóa chủng tương đối cao, trung bình khoảng 44,69 % Các chủng đa số có mức chống oxy hóa 30 %, có chủng 60 % Qua trình định lượng phương pháp đánh bắt gốc tự DPPH, thu nhận kết sau: Chủng R-TN3 (62,32 %) Bảng Kết chống oxy hóa phương pháp DPPH STT Các chủng chống oxy hóa T-TG3 R-TN3 R3-GQ G1-TL3 GL1-N NQ-TN3 Kết định tính Định lượng % đánh bắt gốc tự DPPH + +++ + ++ +++ + 30,95 62,32 35,20 47,70 60,10 37,80 Chú thích: (+): hoạt tính chống oxy hóa yếu; (++): hoạt tính chống oxy hóa trung bình; (+++): hoạt tính chống oxy hóa mạnh; (-): khơng có tác động chống oxy hóa Tỷ lệ phần trăm (%) 80 62,32 60,1 60 40 47,7 37,8 35,2 30,95 20 T-TG3 R-TN3 R3-GQ G1-TL3 GL1-N NQ-TN3 Hình Tỷ lệ % khả đánh bắt gốc tự chủng vi sinh vật nội sinh Định danh chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính chống oxy hóa Chủng T-TG3 Đặc điểm khuẩn ty môi trường PDA: tốc độ phát triển nhanh Φ = cm/7 ngày Khóm nấm hình trịn, cấu tạo sợi bề mặt có dạng hình tia giống dạng phóng xạ, khuẩn lạc có màu trắng rắn Trang 60 chắc, xù xì, tiết sắc tố màu vàng nhạt mơi trường Mặt trái có hình vàng nhạt Đặc điểm quan sát kính hiển vi: cuống sinh bào tử lượn sóng, xoắn Bào tử có hình bầu dục, màng bào tử nhẵn Chủng T-TG3 thể đầy đủ tính chất xạ khuẩn Streptomyces sp TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 T-TG3/PDA (MP) T-TG3/PDA (MT) Bào tử Sợi nấm Hình Chủng T-TG3 Chủng R-TN3 Đặc điểm khóm nấm mơi trường PDA: nấm phát triển tương đối nhanh Φ = cm/7 ngày Khóm nấm trịn, dạng bột, mịn nhung, có màu nâu vàng đến màu nâu, vịng ngồi có màu trắng dần chuyển sang nâu Mặt trái có màu vàng sẫm R-TN3/PDA (MP) Đặc điểm quan sát kính hiển vi: bào tử có nguồn gốc xuất phát từ tế bào chân đáy trụ đỡ kết thúc túi nấm đầu, bào tử đính ngắn, trơn Thể bình có dãy, túi nấm tròn Chủng R-TN3 thể đầy đủ tính chất Aspergillus terreus Thể bình R-TN3/PDA (MT) Bào tử đính Hình Chủng R-TN3 Chủng R3-GQ Chủng R3-GQ quan sát hình thái, chưa định danh tiết màu nâu, sinh sắc tố màu nâu đỏ ngồi mơi trường Mặt trái có màu vàng Đặc điểm môi trường PDA: Tốc độ phát triển chậm ∅ = 1 cm/7 ngày Khóm có hình trịn, bề mặt mịn, có màu nâu, bề mặt có giọt Đặc điểm quan sát kính hiển vi: Có thể phát quang, sợi nấm mảnh R3-GQ/ PDA (MP) R3-GQ/ PDA (MT) Sợi nấm Thể Hình Chủng R3-GQ Trang 61 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Chủng G1-TL3 Đặc điểm khóm nấm mơi trường PDA: nấm phát triển nhanh Khóm nấm trịn, dạng bơng, xồm nhơ lên, màu đen xám Mặt trái có màu tối Đặc điểm quan sát kính hiển vi: sợi nấm có vách ngăn, bào tử tạo thành chuỗi có G1-TL3/PDA (MP) phân nhánh, bào tử gốc nhánh hình khiên tế bào, tế bào tế bào đơn, hình bầu dục đến trịn có sẹo lồi Chủng G1-TL3 thể đầy đủ tính chất Cladosporium sp G1-TL3/PDA (MT) Thể Bào tử G1-TL3 Hình Chủng G1-TL3 Chủng GL1-N Đặc điểm khóm nấm mơi trường PDA: nấm phát triển nhanh, Φ = cm/7 ngày Khóm nấm ban đầu có màu trắng sau chuyển sang vàng nâu thành nâu Sợi nấm dạng bột mịn, mặt phải có màu màu vàng nâu sau chuyển sang nâu đậm theo thời gian, mặt trái có màu vàng nâu, khuếch tán sắc tố vàng nâu mặt thạch GL1-N/PDA (MP) Đặc điểm quan sát kính hiển vi: bào tử xuất phát từ tế bào chân đáy trụ đỡ kết thúc túi nấm đầu, bào tử đính ngắn, trơn Thể bình có lớp, túi nấm tròn Chủng GL1-N mang đặc điểm chủng Aspergillus terreus GL1-N/PDA (MT) Hình Chủng G1-N Trang 62 Thể bình Bào tử đính TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 19, SỐ T4 - 2016 Chủng NQ-TN3 Đặc điểm khóm nấm mơi trường PDA: khóm nấm phát triển nhanh, Φ = cm/7 ngày Khóm nấm trịn, dạng bơng mượt, có màu trắng, già chuyển dần sang màu xanh đậm, sinh sắc tố màu đỏ khuếch tán mơi trường Mặt trái có màu hồng đỏ đậm dần NQ-TN3/PDA (MP) NQ-TN3/PDA (MT) Đặc điểm quan sát kính hiển vi: đính bào đài phân nhánh hay nhiều Tiểu bào đài hình thể bình tận chuỗi bào từ đính, bào tử đính có hình cầu Chủng NQ-TN3 thể đầy đủ tính chất Penicillium sp Bào tử NQ-TN3 Hình Chủng NQ-TN3 KẾT LUẬN Chúng phân lập sàng lọc chủng vi sinh vật nội sinh có hoạt tính chống oxy hóa tắc, riềng, gừng, nguyệt quế Cụ thể, tắc thu chủng, riềng chủng, gừng chủng, nguyệt quế chủng Định danh chủng vi sinh vật, chủng Asergillus terreus cho hoạt chất chống oxy hóa mạnh Hầu hết phân lập có diện vi sinh vật nội sinh, chiếm tỷ Thể bình lệ 6/61 chủng phân lập cho hoạt tính chống oxy hóa, vi sinh vật nội sinh sản sinh chất biến dưỡng có hoạt tính đa dạng hình thức lẫn cách sinh sản Lời cảm ơn: Chúng xin chân thành cám ơn Bộ mơn Vi sinh – Kí sinh, Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Tp.HCM; Khoa Dược, Trường Đại học Nguyễn Tất Thành hỗ trợ tạo điều kiện tốt đa để thực nghiên cứu Trang 63 Science & Technology Development, Vol 19, No.T4- 2016 Isolation and screening of the endophytes possessing antioxidant activity from Rutaceae and Zingiberaceae plants Vo Thi Ngoc My University of Science, VNU-HCM Nguyen Tat Thanh University Nguyen Van Thanh Nguyen Tat Thanh University Nguyen Dinh Nga University of Medicine and Pharmacy, Ho Chi Minh City ABSTRACT Zingiberaceae and Rutaceae have been many applications in the treatment of diseases Their leaves, stems, rhizomes and fruits… containing essential oils which could offer useful habitats for different endophyte groups In this research, the strains of endophyte Streptomyces sp., Aspergillus terreus, Cladosporium sp., Penicillium sp were isolated from different plant parts of galangal, ginger, laurel and their antioxidant activities were determined The antioxidant activity by using DPPH methos applied on these strain was with the following results: R-TN3 strain showed the highest antioxidant activity (62.32 %), followed by G1TL3 and NQ-TN3 and the T-TG3 was the lowest (30.95 %) Keywords: Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, Streptomyces, endophyte TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] T Hùng, Chuyên đề: Các chất chống oxy hóa tự nhiên, Đại học Y Dược TP HCM (2006) [2] G.R Buettner, The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid peroxidation, alpha-tocopherol, and ascorbate, Arch Biochem Biophys, 300, 2, 534–43 (1993) [3] T.P Devasagayam, J.C Tilak, K.K Boloor, et al., Free radicals and antioxidants in human health: current status and future prospects, J Assoc Physicians India, 52, 794–804 (2004) Trang 64 [4] Y.Z Fang, S Yang, G Wu, Free radicals, antioxidants, and nutrition, Nutrition, 18, 10, 872-9 (2002) [5] G.S Germain, Identifying Filamentous Fungi, Star Publish Company (1995) [6] L.P Zheng at al, Antioxidant activity of aqueous extract of a Tolypocladium sp fungus isolated from wild Cordyceps sinensis, African Journal of Biotechnology, 7, 17, 3004–3010 (2008) ... Development, Vol 19, No.T4- 2016 Isolation and screening of the endophytes possessing antioxidant activity from Rutaceae and Zingiberaceae plants Vo Thi Ngoc My University of Science, VNU-HCM Nguyen... Nga University of Medicine and Pharmacy, Ho Chi Minh City ABSTRACT Zingiberaceae and Rutaceae have been many applications in the treatment of diseases Their leaves, stems, rhizomes and fruits… containing... different plant parts of galangal, ginger, laurel and their antioxidant activities were determined The antioxidant activity by using DPPH methos applied on these strain was with the following results: