(Luận văn tốt nghiệp) nghiên cứu thiết kế tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp osmc2 từ vi khuẩn cổ thermococcus kodakarensis kod1 để đánh giá khả năng bảo vệ tế bào khỏi gốc oxy hóa

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ NGỌC ÁNH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP OSMC2 TỪ VI KHUẨN CỔ Thermococcus kodakarensis KOD1 ĐỂ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ TẾ BÀO KHỎI GỐC OXY HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2017 - 2021 Thái Nguyên, năm 2021 Luan van ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM LÊ NGỌC ÁNH Tên đề tài: NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP OSMC2 TỪ VI KHUẨN CỔ Thermococcus kodakarensis KOD1 ĐỂ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ TẾ BÀO KHỎI GỐC OXY HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chun ngành : Cơng nghệ sinh học Lớp : K49 - CNSH Khoa : CNSH & CNTP Khóa học : 2017 - 2021 Họ tên người hướng dẫn : TS Phạm Bằng Phương Thái Nguyên, năm 2021 Luan van i LỜI CẢM ƠN Thực tập tốt nghiệp một khâu rất quan trọng quá trình học tập của mỗi sinh viên nhằm hệ thớng lại tồn bợ lượng kiến thức đã học, vận dụng lý thuyết vào thực tiễn.Qua đó sinh viên trường sẽ hoàn thiện về liến thức lý luận, phương pháp làm việc, lực công tác nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn của công việc sau Trước tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban giám hiệu nhà trường, ban Chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm cùng các thầy, cô Khoa đã giảng dạy hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho em quá trình học tập rèn luyện trường, thời gian vừa qua các thầy, cô đã tạo điều kiện cho em được thực đề tài: “Nghiên cứu thiết kế tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp OsmC2 từ vi khuẩn cổ Thermococcus kodakarensis KOD1 để đánh giá khả bảo vệ tế bào khỏi gốc oxy hóa” Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS.Phạm Bằng Phương giảng viên Khoa Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ em thời gian em thực đề tài Em cũng xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè đã động viên, tạo điều kiện cả về vật chất lẫn tinh thần cho em suốt thời gian thực tập Do trình độ có hạn mặc dù đã rất cố gắng song khóa luận tốt nghiệp của em không thể tránh khỏi những thiếu sót Em rất mong nhận được những ý kiến chỉ bảo của thầy cô, đóng góp của bạn bè để khóa luận tốt nghiệp của em được hồn thiện Lời ći em xin được gửi tới thầy ,cô giáo, cùng với gia đình, bạn bè lời cảm ơn lời chúc sức khỏe thành đạt hạnh phúc Em xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2021 Sinh viên Lê Ngọc Ánh Luan van ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT vii Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu của đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài .2 Phần TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1 Tổng quan về vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KOD1 2.1.1 Nguồn gốc phân loại 2.2 Đặc điểm của vi khuẩn Thermococcus 2.3 Đặc điểm di truyền Thermococcus kodakerensis KDO1 2.4 Đặc điểm protein OsmC2 2.4.1 Giới thiệu 2.4.2 Đặc điểm của protein OsmC2 10 2.5 Đặc điểm chủng vi khuẩn E coli sử dụng tạo dòng biểu 11 2.5.1 E coli DH5α JM109 .12 2.5.2 E coli BL21 12 2.5.3 E coli BL21 (DE3) pLysS 12 2.5.4 E coli M15 (pREP4) .14 2.6 Tình hình nghiên cứu nước thế giới 14 2.6.1 Tình hình nghiên cứu nước 14 Luan van iii 2.6.2 Tình hình nghiên cứu thế giới 14 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Đối tượng, hóa chất thiết bị nghiên cứu .17 3.1.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu: 17 3.1.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 17 3.1.3 Thiết bị , dụng cụ nghiên cứu 18 3.2 Phạm vi, địa điểm thời gian nghiên cứu .19 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu .19 3.2.2 Thời gian nghiên cứu 19 3.3 Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 19 3.3.2 Phương pháp khuếch đại gen PCR 21 3.3.3 Phương pháp chuẩn bị tế bào khả biến 22 3.3.4 Phương pháp gắn nối gen vào vecter 22 3.3.5 Phương pháp tách chiết plasmid .23 3.3.6 Phương pháp biến nạp .24 3.3.7 Phương pháp kiểm tra gắn nối gen 24 3.3.8 Phương pháp cảm ứng biểu protein bằng IPTG .24 3.3.9 Phương pháp tinh protein 25 3.3.10 Phương pháp điện di gel SDS-PAGE 25 3.3.11 Tinh protein tái tổ hợp bằng phương pháp Sắc ký ái lực .27 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 4.1 Nghiên cứu khuếch đại OsmC2 từ vi khuẩn T.kodakarensis KDO1 .28 4.1.1 Tách chiết DNA hệ gen của T.kodakarensis KOD1 28 4.1.2 Khuếch đại gen mã hóa OsmC2 bằng phương pháp PCR 29 4.2 Nghiên cứu tạo dịng gen mã hóa protein OsmC2 từ T kodakarensis KOD1 31 4.2.1 Gắn nối đoạn gen OsmC2 vào vector tạo dòng pGEM T-easy .31 4.2.2 Kiểm tra gắn nối bằng enzyme giới hạn 32 Luan van iv 4.3 Thiết kế tạo vector biểu protein OsmC2 từ Thermococcus kodakarensis KDO1 32 4.4 Nghiên cứu đánh giá khả biểu protein OsmC2 vi khuẩn E coli 35 4.5 Tinh protein chịu nhiệt OsmC2 36 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Phụ lục Luan van v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Hóa chất sử dụng đề tài 18 Bảng 3.2 Thiết bị nghiên cứu 19 Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen OsmC2 21 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng .22 Bảng 3.5 Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng NdeI XhoI 24 Bảng 4.1 Kết quả đo độ tinh nồng độ ADN 29 Luan van vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Nơi phân lập Hình 2.2 Vi khuẩn chịu nhiệt Thermococcus kodakarensis KOD1 Hình 2.3 Cây phân loại nhóm vi khuẩn Thermococcus .5 Hình 2.4 Sơ đồ giải trình tự gen của vi khuẩn Thermococus kodakarensis KDO1 Hình 2.5 Cơ chế kiểm soát sự phiên mã của T7 promoter [51] .13 Hình 3.1 Chu kì nhiệt nhân gen OsmC2 21 Hình 4.1 Ảnh điện di ADN hệ gen được tách chiết từ Thermococcus kodakarensis KDO1 .28 Hình 4.2 Hình ảnh điện di đoạn gen OsmC2 được khuếch đại từ AND hệ gen 30 Hình 4.3 Sản phẩm PCR sau tinh 30 Hình 4.4 Hình ảnh điện di vector tạo dòng tách chiết 31 Hình 4.5 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt các dòng plasmid có khả mang gen OsmC2 .32 Hình 4.6 Tách chiết plasmid vector tạo dòng OsmC2 Tvector vector biểu pET21b 33 Hình 4.7 Cắt vector tạo dòng chứa gen OsmC2 vector biểu pET21b 34 Hình 4.8 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid nghi mang gen OsmC2 34 Hình 4.9 OsmC2 biểu tế vào E.coli BL21 Giếng M: Marker protein M3913 Sigma 35 Hình ảnh 4.10 Tinh protein OsmC2 bằng cợt sắc kí Ni-NTA 36 Luan van vii DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT Tiếng việt Tiếng nước AMP : Ampicillin Ampicillin bp : Cặp bazơ nitơ Base pair CoA : Coenzyme Acetoacetyl Cs : Cộng sự kDa : Kilo dalton ADN : Deoxyribonucleic Acid E coli : Escherichia coli EDTA : Etilendiamin tetraaxetic axit IPTG : Isopropyl Thiogalactoside kb : Kilo bazơ nitơ LB : Laria Broth NCBI : Ngân hàng gen Etilendiamin tetraaxetic acid Kilo base Nation Centre for Biotechnology Information PCR : Khuếch đại gen Polymerase Chain Recation RE : Enzyme giới hạn Restriction enzyme TAE : Tris-acetate-EDTA TTH : Tái tổ hợp SDS –PAGE : Điện di SDS- polyacrylamide gel Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indoly-β-Dalactoside OsmC : Osmotically inducible protein C Luan van Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Sự thích nghi của tế bào sớng với các điều kiện khắc nghiệt của môi trường đã được nghiên cứu nhiều cả sinh vật nhân sơ lẫn sinh vật nhân chuẩn Khi điều kiện môi trường thay đổi, sinh vật thích nghi bằng cách nhận biết những thay đổi biểu gen để tổng hợp một số lượng lớn protein chất chuyển hóa để có khả chống lại môi trường Vi khuẩn cổ ưa nhiệt đã sống môi trường khắc nghiệt có các đặc điểm trao đổi chất sinh lý độc đáo, được ứng dụng nhiều ngành công nghệ sinh học.Tuy nhiên, nghiên cứu về những sinh vật về khả đới phó với ́u tớ stress hạn chế Thermococcus kodakarensis KDO1 vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ miệng núi lửa gần đảo Kodakara, Kagoshima, Nhật Bản Vi khuẩn được nghiên cứu tập trung vào enzyme ổn định nhiệt của nó, việc dễ dàng xử lý thao tác di trùn giúp trở thành mợt đới tượng hấp dẫn để nghiên cứu mợt sớ q trình sinh học cũng từng bước ứng dụng công nghiệp Để sống được điều kiện nhiệt độ từ 60 – 100oC, nhiệt độ tối ưu 85oC, vi khuẩn T Kodakarensis KDO1 có hệ enzyme, phức hợp protein proteasome có đặc tính đặc biệt Các nghiên cứu trước đã chỉ rằng, protein OsmC được biểu đã điều chỉnh đáng kể khả chống lại áp suất thẩm thấu Các peroxide có đợc tính cao có khả làm hỏng phân tử tế bào, vậy, việc giải độc peroxide rất quan trọng đối với sự tồn sinh sơi của vi kh̉n Vì vậy, việc nghiên cứu vai trò chức của protein OsmC2 tế bào sẽ giúp hiểu rõ chế hoạt đợng cũng khả thích nghi của vi khuẩn với với môi trường khắc nghiệt Trên sở đó, chúng thực đề tài: “Nghiên cứu thiết kế tạo dịng biểu hiện protein tái tở hợp OsmC2 từ vi khuẩn cổ Thermococcus kodakarensis KOD1 để đánh giá khả bảo vệ tế bào khỏi gốc oxy hóa để tạo dịng biểu hiện protein OsmC2”, từ đó sở để đánh giá chức của enzyme hiểu rõ khả chịu đựng của tế bào với áp suất thẩm thấu Luan van 28 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nghiên cứu khuếch đại OsmC2 từ vi khuẩn T.kodakarensis KDO1 4.1.1 Tách chiết DNA hệ gen T.kodakarensis KOD1 Kết quả DNA hệ gen của Thermococcus kodakarensis KDO1 được thể đại diện hình 4.1 Thermococcus kadakorensis KDO1 được nuôi môi trường NBRC 702 Ly tâm dịch nuôi 13000 vòng/phút phút để thu cặn tế bào Sau đó, tách chiết ADN hệ gen bằng bộ kit Promega cung cấp Sau tách chiết ADN hệ gen, sản phẩm được kiểm tra bằng cách điện di qua gel agarose 1% Kết quả điện di thể hình 4.1 cho thấy, sau tách chiết thu được ADN hệ gen tình trạng ổn định không xuất bị đứt gãy Hình 4.1 Ảnh điện di ADN hệ gen được tách chiết từ Thermococcus kodakarensis KDO1 (Giếng M: Điểm đánh dấu; giếng 1: Mẫu DNA T.kodakarensis KDO1; giếng 2: Plasmid pET21b chứa OsmC2) - Kết quả đánh giá độ tinh của ADN hệ gen của Thermococcus kodakarensis KDO1 được thể qua bảng 4.1 Luan van 29 Khi kiểm tra độ tinh của mẫu ADN hệ gen bằng máy đo quang phổ cho nồng đợ ADN lần lượt 37,4; 38,9 36,8 ng/µl, đó tỉ số OD260/ OD280 tương ứng 1,88; 1,96 1,82 Kết hợp dữ liệu với hình ảnh điện di gel agarose 1% (hình 4.1) cho thấy, ADN hệ gen được tách chiết từ Thermococcus kodakarensis KDO1 đủ điều kiện để sử dụng cho nghiên cứu về khuếch đại gen tiếp theo Bảng 4.1 Kết đo độ tinh nồng độ ADN OD Mẫu Mẫu Mẫu 260 nm 37,4 38,9 36,8 280 nm 19,9 19,8 20,2 260 nm/280 nm 1,88 1,96 1,82 (Mẫu 1: ADN hệ gen mẫu số 1; mẫu 2: ADN hệ gen mẫu số 2; mẫu 3: ADN hệ gen mẫu số 3) 4.1.2 Khuếch đại gen mã hóa OsmC2 phương pháp PCR Kết quả khuếch đại gen mã hóa OsmC2 từ Thermococcus kodakarensis KDO1 thể (hình 4.2) Phản ứng PCR được thực với cặp mồi FOS2 ROS2 để khuếch đại đoạn gen mã hóa amidase vi khuẩn Thermococcus kodakarensis KDO1 Sản phẩm PCR được thực điện di kiểm tra gel agarose 1% cho hình ảnh một bang vạch sáng (giếng 1- Hình 4.2) tương đương với kích thước lý thuyết của đoạn gen OsmC2 (420bp) Phụ lục 1: Trình tự gen TK 2017 Luan van 30 Hình 4.2 Hình ảnh điện di đoạn gen OsmC2 được khuếch đại từ AND hệ gen (Giếng M: Lambda HindIII marker; Giếng 1: Sản phẩm PCR khuếch đại OsmC2) - Kết quả tinh đoạn gen mã hóa OsmC2 từ Thermococcus kodakarensis KDO1 được khuếch đại Sau được khuếch đại thành công Đoạn gen được tiến hành tinh bằng bộ kit purification điện di kiểm tra độ tinh tra gel agarose 1% Kết quả hình 4.3 chỉ tồn bang vạch sáng nhất bản gel (giếng – Hình 4.3) điều cho thấy, sau quá trình tinh sạch, sản phẩm PCR đã loại bỏ được tồn bợ tạp chất còn sót sau quá trình khuếch đại gen Hình 4.3 Sản phẩm PCR sau tinh sạch (Giếng M: Lambda HindIII marker; giếng 1: Sản phẩm PCR khuếch đại OsmC2 đã tinh sạch.) Luan van 31 4.2 Nghiên cứu tạo dòng gen mã hóa protein OsmC2 từ T kodakarensis KOD1 4.2.1 Gắn nối đoạn gen OsmC2 vào vector tạo dòng pGEM T-easy Đoạn gen OsmC2 sau tinh được gắn vào vector tách dòng pGEM Teasy ủ 25ºC Sản phẩm gắn nối được biến nạp vào tế bào vi khuẩn E.coli JM109 Khuẩn lạc chứa plasmid mang gen OsmC2 được chọn lọc môi trường LB có chứa kháng sinh ampicilin, chất X-gal chất cảm ứng IPTG Sau nuôi điều kiện 37ºC, chọn các khuẩn lạc màu trắng khuẩn lạc màu xanh ( đối chứng) được nuôi tăng sinh môi trường LB lỏng để tách chiết plasmid kiểm tra kích thước vector.( hình 4.4) Những khuẩn lạc cho plasmid có kích thước lớn so với đới chứng ( kh̉n lạc 3,4,6) tiếp tục được cắt bằng enzyme giới hạn NdeI XhoI Các khuẩn lạc lại chứa vector pGEM- OsmC2 pET21b được nuôi cấy, tách chiết plasmid cắt bằng enzyme NdeI XhoI để phục vụ cho việc tạo vector biểu pET21b-OsmC2 Như vậy đã tách dòng thành công gen OsmC2 Hình 4.4 Hình ảnh điện di vector tạo dòng tách chiết (Giếng M: Điểm đánh dấu Lamda / Hindlll,Giếng 1: Plasmid pET21b ,Giếng 2-6: Plasmid tách chiết từ khuẩn lạc trắng.) Những khuẩn lạc cho plasmid có kích thước lớn so với đới chứng ( khuẩn lạc 3,4,6) tiếp tục được cắt bằng enzyme giới hạn NdeI XhoI Các khuẩn lạc lại chứa vector pGEM-OsmC2 pET21b được nuôi cấy, tách chiết plasmid cắt Luan van 32 bằng enzyme NdeI XhoI để phục vụ cho việc tạo vector biểu OsmC2pET21b Như vậy đã tách dòng thành công gen OsmC2 4.2.2 Kiểm tra gắn nối enzyme giới hạn - Kết quả kiểm tra gắn nối bằng enzyme giới hạn NdeI XhoI Sau chọn lọc được những dòng khuẩn lạc cho plasmid có kích thước lớn so với đối chứng ( KLT số 1,2 giếng 4,5 – Hình 4.5), các plasmid tiếp tục được chọn lọc bằng enzyme giới hạn NdeI XhoI Kết quả được thể hình 4.5 cho thấy, các dòng khuẩn lạc số (lần lượt giếng 3,4) đều cho hai băng sáng ứng với kích thước lý thuyết lần lượt xấp xỉ 3000 bp của PGEM T-easy Như vậy đã tách dòng thành công đoạn gen OsmC2 Hình 4.5 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt các dòng plasmid có khả mang gen OsmC2 (Giếng M: Lambda HindIII marker; Giếng 1: Plasmid tách chiết từ KLX; Giếng 2,3: Plasmid tách chiết bởi NdeI và XhoI; Giếng 4: Sản phẩm PCR khuếch đại OsmC2 đã tinh sạch.) 4.3 Thiết kế tạo vector biểu protein OsmC2 từ Thermococcus kodakarensis KDO1 - Kết quả tách chiết vector biểu Để sử dụng hiệu quả vector thương mại pET21b nhằm mục đích biểu gen OsmC2, kiểm tra bằng cách biến nạp vector biểu pET21b (5369bp) Luan van 33 vào tế bào khả biến E coli DH5α cấy trải môi trường LB có bổ sung ampicillin Sau ni qua đêm 37 oC, thu được 300 khuẩn lạc Chọn dịng kh̉n lạc nghi mang vector biểu pET21b, ni tăng sinh LB lỏng để tách chiết plasmid kiểm tra kích thước vector (giếng 1- Hình 4.6) Vector nghi tách thành cơng được tiến hành cắt mở vịng bằng XhoI tiếp tục được điện di kiểm tra (giếng - Hình 4.6) Kết quả cắt mở vịng cho thấy giếng – Hình 4.6 xuất mợt băng vạch nhất có kích thước xấp xỉ 5500 bp, kích thước phù hợp với kích thước lý thuyết của vector pET21b 5368 bp Vì vậy, plasmid đủ điều kiện để tiến hành các bước biểu gen tiếp theo Hình 4.6 Tách chiết plasmid vector tạo dòng OsmC2 Tvector và vector biểu hiện pET21b (Giếng M: Thang chuẩn ADN lamda hindIII ; Giếng 1,2,3: Tách chiết plasmid vector tạo dòng OsmC2 Tvector; Giếng 4,5: Vector biểu pET21b) Luan van 34 Hình 4.7 Cắt vector tạo dòng chứa gen OsmC2 và vector biểu hiện pET21b (Giếng M: Thang chuẩn ADN lamda hindIII, giếng 1, 2: OsmC2 Tvector cắt enzyme NdeI/XhoI; 3: pET21b cắt NdeI/XhoI.) - Kết quả tách chiết vector biểu đã gắn nối thành công gen OsmC2 Gắn nối đoạn gen OsmC2 vào vector biểu pET21b (5369 bp) 16ºC 16 (Hình 4.7) Sản phẩm gắn nối được kiểm tra bằng phương pháp điện di so sánh với các đoạn gen đã tách dòng thành công vector pET28 đã cắt mở vòng NdeI XhoI Kết quả hình 4.7 cho thấy, tất cả các sản phẩm gắn nới đều cho băng kích thước 6500 bp (kính thước dự kiến gắn nới thành công gen vào vector 6407 bp) Hình 4.8 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid nghi mang gen OsmC2 (Giếng M: Lambda HindIII marker; Giếng 2, 3, 4: Plasmid nghi ngờ mang gen cắt với NdeI và XhoI; Giếng 1, 2, 3, 4: pET21b cắt mở vòng với NdeI và XhoI Giếng 5: Sản phẩm PCR khuếch đại OsmC2 đã tinh sạch.) Luan van 35 Hình 4.8 cho thấy, sau cắt kiểm tra với enzyme giới hạn, plasmid nghi ngờ mang gen đều cho băng đúng với kích thước lý thuyết tương ứng với 5369 bp của pET21b 1038 bp của gen OsmC2 Như vậy, đã gắn nối thành công đoạn gen OsmC2 vào đúng vị trí vector pET21b 4.4 Nghiên cứu đánh giá khả biểu protein OsmC2 vi khuẩn E coli Sau chuyển vector biểu pET21b-OsmC2 vào tế bào khả biến E coli BL21(DE3) pLysS cấy trải đĩa thạch LB nuôi 37 oC qua đêm cảm ứng biểu gen bằng việc bổ sung IPTG nồng độ 1mM nuôi 4h Qua kết quả điện di SDS-PAGE (Hình 4.9) cho thấy, những phân đoạn protein tương ứng với mẫu đối chứng không cảm ứng bằng IPTG (giếng – Hình 4.9) các mẫu protein từ giếng đến xuất thêm băng đậm có kích thước ~20 kDa Kết quả cho thấy phân đoạn protein thu được điều kiện thích hợp từ mơi trường ni E.coli có kích thước ~20 kDa Hình 4.9 OsmC2 biểu tế vào E.coli BL21 Giếng M: Marker protein M3913 Sigma (Giếng M: Protein marker low range M3913 Sigma; Giếng 1: Đối chứng dương OsmC2 E.coli BL21 DE3 không bổ sung IPTG; Giếng 2-4: Cảm ứng biểu OsmC2 ở E.coli BL21 IPTG) Luan van 36 4.5 Tinh protein chịu nhiệt OsmC2 Tế bào OsmC2 E coli BL21 có chứa gen OsmC2 được ni cấy 37oC môi trường LB lỏng, tốc độ lắc 200v/p đến OD600 nm đạt 1,0 Bổ sung IPTG đạt nồng độ mM tiếp tục nuôi tiếng để cảm ứng biểu protein Thu dịch protein tổng số đun điều kiện 70oC 20 phút cho nạp vào cột Ni-NTA để tinh Các phân đoạn rửa với nồng độ imidazol khác được sử dụng để thu protein kiểm tra điện di SDS-PAGE Kết quả thu được thể (hình 4.10) cho thấy, protein thu được phân đoạn 30 mM imidazol có mợt băng nhất tương ứng với kích thước khoảng 32 kDa, tương đương kích thước protein OsmC2, các phân đoạn khác nhiều các băng protein khác Như vậy, sử dụng cột Ni-NTA để tinh protein OsmC2 sẽ cho protein có độ tinh cao phân đoạn 30 mM imidazol, đáp ứng cho yêu cầu nghiên cứu hoạt tính, tính chất về sau Hình ảnh 4.10 Tinh sạch protein OsmC2 cột sắc kí Ni-NTA (Giếng M: Marker protein tầm thấp M3913 Sigma; Giếng U: Protein thô từ dịch phá vỡ tế bào; 30, 50, 100, 250: Phân đoạn protein rửa dung dịch Imidazol nồng độ 30 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM.) Luan van 37 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Chúng đã thiết kế khuếch đại thành công đoạn gen OsmC2 từ chủng Thermococcus kodakarensis KOD1 Đã tạo dịng thành cơng vector tạo dòng pGEM-OsmC2 vetor biểu pET28-OsmC2 Nghiên cứu đã biểu thành công protein chịu nhiệt OsmC2 tế bào E.coli BL21 DE3 Trong nghiên cứu này, chúng tơi đã tinh OsmC2 bằng cợt sắc kí Ni-NTA 5.2 Kiến nghị - Tiến hành biểu với lượng lớn tinh protein nghiên cứu phân tích các hoạt tính Luan van 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nguyễn Văn Cách, (2005) Giáo trình tin sinh, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật Hà Nợi Ngũn Hồng Lợc, Triệu Thị Lệ, Hà Thị Minh,(2007) Giáo trình sinh học phân tử, nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hồ Thị Tuyết Mai, Bài giảng Công nghệ Enzyme, (2006) Trường CĐ Lương Thực Thực Phẩm Đà Nẵng Trần Xuân Ngạch, Công Nghệ Enzyme, (2007) Nhà xuất bản Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng Lương Đức Phẩm, Công nghệ vi sinh vật, (2004) Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội Tiếng Anh Pham, B.P, Jia, B, Lee, S, Ying, S, Kwak, J.M, Cheong, G.-W, Chaperone-like activity of a bacterioferritin comigratory protein from Thermococcus kodakaraensis KOD1 (2015), Protein and Peptide Letters 22 (5), Pages 443-448 Cui, Z., Wang, Y., Pham, B.P., Ping, F., Pan, H., Cheong, G.-W., Zhang, S., Jia, B High level lysophospholipase expression from and characterization Thermococcus of kodakarensis a thermostable KOD1 (2012) Extremophiles, 16 (4), pp 619-625 C Schiraldi, M Giuliano, M De Rosa, Perspectives on biotechnological applications of archaea, Archaea (2002), tr 75–86 C Gutierrez, J.C Devedjian, “Osmotic induction of gene osmC expression in Escherichia coli K12”, J Mol Biol 20 (1991) 959–973 10 U Völker, K.K Andersen, H Antelmann, K.M Devine, M Hecker, “One of two OsmC homologs in Bacillus subtilis is part of the σB-dependent general stress regulon”, J Bacteriol 180 (1998) 4212–4218 Luan van 39 11 Atomi, H., et al., “Description of Thermococcus kodakaraensis sp nov., a well studied hyperthermophilic archaeon previously reported as Pyrococcus sp KOD1” Archaea, 2004 1(4): p 263-7 12 Fukui, T., et al (2011), “Complete genome sequence of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1 and comparison with Pyrococcus genomes” Genome Res115(3): p 352-63 13 Jia, B., Lee, S., Pham, B.P., Kwack, J.M., Jin, H., Li, J., Wang, Y., Cheong, G.W “Biochemical characterization of deblocking aminopeptidases from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakarensis KOD1”, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 75 (6), pp 1160-1166 14 Ruan, J., “Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (second edition) Volume and the study of Actinomycetes systematic in China” Wei Sheng Wu Xue Bao, 53(6): p 521-30 15 Macalady, J.L., et al.(2004), “Tetraether-linked membrane monolayers in Ferroplasma spp: a key to survival in acid Extremophiles, 8(5): p 411-9 16 Fiala, J., “The Scientific Council of the Czech Ministry of Health and its function” Cesk Pediatr, 1986 41(7): p 418-9 17 Li, J.F., “ A fast neighbor joining method Genet Mol Res”, 2015 14(3): p 8733-43 18 Escriva, H., et al.(1995), “Rat mammary-gland transferrin: nucleotide sequence, phylogenetic analysis and glycan structure” Biochem J, 307 (Pt 1): p 47-55 19 Miroshnichenko, V.P., et al.(1989), “Characteristics of the diagnosis and treatment of severe forms of late pregnancy toxemia” Akush Ginekol (Mosk), (5): p 43-8 20 Zheng, X., et al.(2014), “Phylogeny and evolutionary histories of Pyrus L revealed by phylogenetic trees and networks based on data from multiple DNA sequences” Mol Phylogenet Evol, 80: p 54-65 21 Ishino, Y and I.K Cann(1998), “The euryarchaeotes, a subdomain of Archaea, survive on a single DNA polymerase: fact or farce”, Genes Genet Syst, 73(6): p 323-36 Luan van 40 22 Woese, C.R and R Gupta (1981), “Are archaebacteria merely derived 'prokaryotes” Nature, 289(5793): p 95-6 23 Gupta, R.S.(2002), “The natural evolutionary relationships among prokaryotes” Crit Rev Microbiol, 26(2): p 111-31 24 Gribaldo, S and C Brochier-Armanet(2006), “The origin and evolution of Archaea: a state of the ar”t Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 2006 361(1470): p 1007-22 25 Vannier, P., et al.(2015), “Genome expression of Thermococcus barophilus and Thermococcus kodakarensis in response to different hydrostatic pressure conditions” Res Microbiol, 166(9): p 717-25 26 Lamosa, P., et al.(1998), “Effects of temperature, salinity, and medium composition on compatible solute accumulation by thermococcus spp” Appl Environ Microbiol, 64(10): p 3591-8 27 Baneyx, F (1999) "Recombinant protein expression in Escherichia coli" Curr Opin Biotechnol, 10(5), 411-421 28 Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J (1989), “Molecular Cloning-A Laboratory Manual”, Cold Spring Habor Laboratory, USA 29 Mbuyi, J M., J Dequeker, F Bloemmen, E Stevens (1982) "Plasma proteins in human cortical bone: enrichment of alpha HS-glycoprotein, alpha acidglycoprotein, and IgE", Calcif Tissue Int, 34(3), pg 229-231 30 Novagen (2006) "pET System Manual" TB055 11th Edition, Rev.B, 0403, USA 31 Sugantha priya S, Gowri Shankar J, Thirumalaisamy R, K P (2010) "Over Expression of IPTG inducible GST protein in E coli BL21.", Journal of Biomedical Sciences and Research, 2(1), pg 54-59 32 The QIAexpressionistTM (2003), “A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged proteins”, Fifth edition, QIAGEN, Germany 33 Zhang, J., et al (2015), “Analysis of chromosome 22q11 copy number variations by multiplex ligation-dependent probe amplification for prenatal diagnosis of congenital heart defect” Mol Cytogenet, (8): p 100 Luan van 41 34 Fukui T, Atomi H, Kanai T, Matsumi R, Fujiwara S, Imanaka T Complete genome sequence of the hyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis KOD1 and comparison with Pyrococcus genomes Genome Res 2005 Mar;15(3):352-63 35 T de Miguel Bouzas, J Barros-Velazquez, T.G Villa, Industrial appli-cations of hyperthermophilic enzymes: a review, Protein Pept Lett 13 (2006) 645–651 36 D.A Cowan, Enzymes from thermophilic archaebacteria: current and future applications in biotechnology, Biochem Soc Symp 58 (1992) 149–169 37 C Schiraldi, M Giuliano, M De Rosa, Perspectives on biotechnological applications of archaea, Archaea (2002) 75–86 38 C Gutierrez, J.C Devedjian, Osmotic induction of gene osmC expression in Escherichia coli K12, J Mol Biol 20 (1991) 959–973 39 U Völker, K.K Andersen, H Antelmann, K.M Devine, M Hecker, One of two OsmC homologs in Bacillus subtilis is part of the σB-dependent general stress regulon, J Bacteriol 180 (1998) 4212–4218 40 M Davalos-Garcia, A Conter, I Toesca, C Gutierrez, K Cam, Regulation of osmC gene expression by the two-component system rcsB–rcsC in Escherichia coli, J.Bacteriol 183 (2001) 5870-5876 Luan van Phụ lục 1: Trình tự gen TK2017 Luan van ... đề tài: NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP OSMC2 TỪ VI KHUẨN CỔ Thermococcus kodakarensis KOD1 ĐỂ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẢO VỆ TẾ BÀO KHỎI GỐC OXY HÓA KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP... kế tạo dòng biểu protein tái tổ hợp OsmC2 từ vi khuẩn cổ Thermococcus kodakarensis KOD1 để đánh giá khả bảo vệ tế bào khỏi gớc oxy hóa Luan van Phần TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU... gen OsmC2 Như vậy, đã gắn nối thành công đoạn gen OsmC2 vào đúng vi? ? trí vector pET21b 4.4 Nghiên cứu đánh giá khả biểu protein OsmC2 vi khuẩn E coli Sau chuyển vector biểu pET21b -OsmC2 vào