(Luận văn tốt nghiệp) nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật elisa chẩn đoán bệnh tristeza trên cây cam, quýt

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ YẾN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA CHẨN ĐOÁN BỆNH TRISTEZA TRÊN CÂY CAM, QUÝT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2017 - 2021 THÁI NGUYÊN, NĂM 2021 Luan van ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ YẾN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA CHẨN ĐOÁN BỆNH TRISTEZA TRÊN CÂY CAM, QUÝT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chun ngành: Cơng nghệ sinh học Lớp: 49 - CNSH Khoa: CNSH - CNTP Khóa học: 2017 – 2021 Họ tên người hướng dẫn: TS Nguyễn Văn Duy THÁI NGUYÊN, NĂM 2021 Luan van i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình thực tập tốt nghiệp Khoa CNSH-CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, nhận nhiều giúp đỡ từ tất thầy, cơ, người thân, gia đình bạn bè Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Văn Duy, người tận tình hướng dẫn, bảo kinh nghiệm làm việc giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa thầy, cô giáo Khoa CNSH CNTP, đặc biệt thầy Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian thực tập Cuối xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè chia sẻ, động viên giúp đỡ mặt vật chất tinh thần suốt thời gian học tập trường Với điều kiện thời gian kinh nghiệm cịn hạn chế sinh viên việc hồn thành khóa luận khơng thể tránh thiếu sót Tơi mong nhận bảo, đóng góp ý kiến q thầy để hồn thành khóa luận cách tốt Tơi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày … tháng … năm 2021 Sinh viên Nguyễn Thị Yến Luan van ii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Giá trị dinh dưỡng có trái họ cam quýt Bảng 2.2 Tổng sản lượng cam nước Thế giới từ năm 2019 đến tháng 1/2021 Bảng 2.3 Sản lượng cam quýt 2015 – 2019 .9 Bảng 3.1 Các dụng cụ, thiết bị sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 4.1 Các mẫu cam, quýt thu thập 23 Bảng 4.2 Kết thử nghiệm quy trình ELISA phát bệnh tristeza mẫu thu thập 33 Luan van iii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1 Hình ảnh bị cam bị nhiễm bệnh tristeza mức độ khác 24 Hình 4.2 Kết phát bệnh tristeza kỹ thuật ELISA điều kiện tách chiết mẫu khác 25 Hình 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng hàm lương BSA pha loãng đệm Conjugate buffer 26 Hình 4.4 Kết phát bệnh tristeza kỹ thuật ELISA điều kiện rửa khác 27 Hình 4.5 Kết nghiên cứu thời gian ủ chất màu 28 Hình 4.6 Kết phân tích ảnh hưởng thời gian ủ mẫu phân tích .29 Hình 4.7 Kết nồng độ mẫu tối thiểu cần cho phản ứng ELISA 30 Hình 4.8 Kết thử nghiệm quy trình ELISA phát bệnh tristeza mẫu thu thập 32 Luan van iv DANH MỤC CÁC TỪ, THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Từ, thuật Nghĩa đầy đủ từ, thuật ngữ ngữ viết tắt Ac CTV DASI-ELISA DNA ELISA Acidovorax citrulli: Vi khuẩn gây bệnh cháy bệnh đốm Citrus tristeza virus: Virus gây bệnh tristeza ELISA Double Antibody Sandwich Indirect: Kỹ thuật Sandwich ELISA trực tiếp Deoxyribonucleic acid Enzyme-linked immunosorbent assay: Kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch liên kết enzyme GUS Glucuronidase Reporter Gene: Gen mã hóa tín hiệu Glucuronidase KN Kháng nguyên KT Kháng thể mAb Monoclonal antibody: Kháng thể đơn dòng MYSV Melon yellow spot virus: Virus đốm vàng dưa PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng tổng hợp chuỗi trùng hợp RIA Radio Immuno Assay: Kỹ thuật miễn dịch phóng xạ RNA Ribonucleic acid WSMoV Watermelon silver mottle virus: Virus đốm bạc dưa hấu SY Seedling yellows: triệu chứng vàng Luan van v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii DANH MỤC CÁC TỪ, THUẬT NGỮ VIẾT TẮT iv MỤC LỤC v Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn đề tài Phần TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu có múi 2.1.1 Nguồn gốc có múi 2.1.2 Phân loại có múi 2.1.3 Giá trị dinh dưỡng lợi ích sức khỏe trái họ cam quýt 2.1.4 Tình hình sản xuất có múi Thế giới Việt Nam 2.2 Tổng quan bệnh Tristeza 2.2.1 Tác nhân gây bệnh: Virus Tristeza 10 2.2.2 Tác hại bệnh Tristeza 11 2.2.3 Biện pháp phòng tránh lây lan 12 2.3 Tổng quan kỹ thuật ELISA 14 2.3.1 Khái niệm ELISA 14 2.3.2 Phân loại ELISA 15 2.3.3 Các ứng dụng bật kỹ thuật ELISA 16 Phần ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 Luan van vi 3.1 Đối tượng nghiên cứu phạm vi nghiên cứu 18 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 18 3.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất nghiên cứu 18 3.2.1 Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 18 3.2.2 Hóa chất nghiên cứu 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 20 3.4 Phương pháp nghiên cứu 20 3.4.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu phân tích từ mơ thực vật 20 3.4.2 Phương pháp ELISA 21 3.4.3 Phương pháp tính độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật ELISA 22 Phần KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Kết thu thập mẫu bệnh Tristeza cam, quýt 23 4.2 Kết nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật ELISA phát bệnh Tristeza có múi 24 4.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp chuẩn bị mẫu phân tích 25 4.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng BSA pha loãng đệm Conjugate buffer 26 4.2.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện rửa 27 4.2.4 Kết nghiên cứu thời gian ủ chất màu 28 4.2.5 Kết nghiên cứu thời gian ủ mẫu phân tích 29 4.2.6 Kết nghiên cứu xác định nồng độ mẫu tối thiểu cần cho phản ứng ELISA 30 4.3 Kết thử nghiệm quy trình kỹ thuật ELISA phát bệnh Tristeza mẫu thu thập 32 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Kiến nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 Luan van Phần MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Cây có múi (cam, chanh, quýt, bưởi), thuộc họ Rutaceae, loại ăn có giá trị kinh tế giá trị dinh dưỡng cao [3], đem lại nguồn thu nhập lớn cho nhà vườn Với diện tích gieo trồng rộng lớn có mặt hầu hết tỉnh nước, có múi lĩnh vực nông nghiệp trọng điểm cho suất lớn Các loại có múi mặt hàng hấp dẫn với thị trường nước ngồi đóng góp lớn vào kim ngạch xuất khẩu nước Mặt khác, có múi cịn thuộc nhóm đa dạng phong phú chủng loại như: cam đường, quýt, chanh vàng, chanh xanh, bưởi, bưởi chùm Ở Việt Nam tiếng với loại: cam Bố Hạ Bắc Giang, cam sành Tam Bình, quýt tiều Lai Vung, bưởi năm roi Bình Minh, cam Cao Phong, cam Vinh,… Một phần ba tổng số trái có múi sử dụng làm nước ép tốt cho sức khỏe: cung cấp loạt vitamin, khoáng chất hợp chất thực vật; cung cấp chất xơ hòa tan tốt, giúp giảm cholesterol hỗ trợ tiêu hóa; có hàm lượng calo thấp – lựa chọn thông minh cho người muốn giảm cân trì cân nặng; tham gia vào trình làm giảm nguy sỏi thận số người cách tăng nồng độ citrate nước tiểu; có tác dụng bảo vệ, chống lại nhiều loại ung thư, giúp tăng cường chức não bảo vệ não khỏi rối loạn thối hóa thần kinh Tuy nhiên, phát triển số bệnh làm cho suất chất lượng cam, quýt giảm sút nghiêm trọng Đó là: bệnh loét vi khuẩn, bệnh greening, bệnh tristeza, bệnh ghẻ nhám, thối gốc chảy mủ,… Trong số đó, bệnh virus Tristeza mối lo ngại lớn đối với giới Vào năm 1957, cộng đồng Valencian (Tây Ban Nha): tổng cộng 40 triệu có múi, chủ yếu cam quýt ghép gốc ghép cam chua bị suy giảm bị chết virus tristeza Từ năm 1935 đến năm 1989, ước tính khoảng 20 triệu bị chặt bỏ virus tristeza (CTV) [13] Luan van Các vụ dịch tristeza có sức hủy diệt lớn xảy Argentina (1930), Brazil (1937), California (1939), Florida (1951), Tây Ban Nha (1957), Israel (1970), Venezuela (1980), Cyprus (1989), Cuba (1992), Mexico (1995), Cộng hòa Dominica (1996) Ý (2002) Trực tiếp thiệt hại đến suất, chất lượng làm gốc ghép cam chua có phẩm chất nơng học tốt Gián tiếp đề cập vấn đề mới liên quan đến việc sử dụng gốc ghép kháng tristeza Bệnh tristeza xuất Việt Nam từ thập niên 60 Năm 1970 - 1993, Vũ Khắc Nhượng cộng phát bệnh tristeza thị Năm 1982, Nguyễn Văn Mẫn chụp ảnh virus tristeza kính hiển vi điện tử Bệnh tristeza gây nhiều trở ngại với việc mở rộng diện tích, nâng cao chất lượng có múi Đây thách thức lớn đối với nơng nghiệp có múi địi hỏi phải tìm kiếm giải pháp khắc phục đem lại hiệu tốt [4] Hiện nay, việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử cho phép chẩn đốn bệnh có múi với ưu điểm bật như: độ nhạy độ xác cao, thời gian Có thể kể đến số kỹ thuật: ELISA, PCR, Realtime PCR, kỹ thuật lai phân tử,… Các kết thu từ nghiên cứu chẩn đoán bệnh sinh học phân tử sở khoa học cho việc đưa biện pháp phòng tránh điều trị bệnh Xuất phát từ vấn đề thực tiễn, tiến hành thực đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật ELISA chẩn đoán bệnh Tristeza cam, quýt” 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xây dựng phương pháp chẩn đoán bệnh Tristeza cam, quýt 1.2.2 Mục tiêu cụ thể - Thu thập mẫu bệnh Tristeza cam, quýt - Xây dựng quy trình kỹ thuật ELISA phát bệnh Tristeza - Thử nghiệm quy trình kỹ thuật ELISA phát bệnh Tristeza cam, quýt 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn 1.3.1 Ý nghĩa khoa học đề tài Xây dựng quy trình kỹ thuật ELISA với điều kiện tối ưu cho phản ứng phát bệnh tristeza có múi Luan van 24 Mười số 20 mẫu thu thập mang kiểu hình bị bệnh tristeza như: vàng, kích thước nhỏ, cong, biến dạng, gân trong, mờ đưa lên ánh sáng gân lõm, gân phụ sưng lên, tác nhân gây bệnh lây lan đến đâu gây khô chết cành, Cây bị bệnh nặng thân bị lõm bóc vỏ Mười mẫu cịn lại có kiểu hình bình thường, khơng biểu bệnh Hình 4.1 Hình ảnh bị cam bị nhiễm bệnh tristeza mức độ khác (A); Lá cam bị bệnh tristeza bình thường (B) vườn sản xuất, trường Đại học Nông Lâm 4.2 Kết nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật ELISA phát bệnh Tristeza có múi Để xây dựng quy trình kỹ thuật ELISA phát bệnh tristeza cam, quýt cần phải tìm hiểu điều kiện phù hợp bước quy trình bao gồm: phương pháp chuẩn bị mẫu, hàm lượng BSA sử dụng, điều kiện rửa, thời gian ủ chất, thời gian ủ mẫu phân tích nồng độ mẫu tối thiểu cho phản ứng ELISA Dưới kết nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng yếu tố đến khả phát bệnh tristeza Luan van 25 4.2.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp chuẩn bị mẫu phân tích Mẫu nghiền điều kiện thông thường điều kiện lạnh sau sử dụng làm mẫu phân tích cho quy trình ELISA, đánh giá hiệu kỹ thuật thơng qua cường độ màu hình thành giếng chứa mẫu bị bệnh, mẫu kiểm chứng dương tính mẫu kiểm chứng âm tính bị bệnh Kết thí nghiệm thể hình 4.2 dưới đây: Hình 4.2 Kết phát bệnh tristeza kỹ thuật ELISA điều kiện tách chiết mẫu khác nhau: TN1 Mẫu chuẩn bị điều kiện thường, TN2 Mẫu chuẩn bị điều kiện lạnh Kết thể hình 4.2 cho thấy: Khi mẫu tách chiết nhiệt độ thường (nhiệt độ phịng thí nghiệm), mẫu kiểm chứng dương tính (hàng A, cột 1, TN1) cho cường độ màu vàng cao so với mẫu kiểm chứng âm tính (hàng B, cột 1, TN1) Kết hoàn toàn phù hợp Tuy nhiên, mẫu bị bệnh (hàng C đến hàng G, cột cột 2, TN1) cho tín hiệu màu khơng Ở giếng C, cột 1, giếng D, cột giếng F, cột có cường độ màu cao so với mẫu kiểm chứng âm tính phù hợp với kết kiểu hình bị bệnh giếng cịn lại có cường độ tín hiệu màu tương đương với mẫu kiểm chứng âm tính Đây kết âm tính giả, khơng với kết kiểu hình bị bệnh Điều chứng tỏ rằng: chuẩn bị mẫu nhiệt độ phịng thí nghiệm cho kết phân tích khơng ổn định Lý giải thích cho điều đồng hóa điều kiện thơng thường, hàm lượng lớn protein kháng nguyên virus gây bệnh tristeza bị biến tính, khơng có khả bắt cặp đặc hiệu với kháng thể Luan van 26 Khi mẫu đồng hóa điều kiện lạnh (đệm tách chiết xử lý -20oC trước sử dụng trình ly tâm mẫu thực 10oC), giếng ELISA cho cường độ màu cao so với mẫu kiểm chứng âm tính (TN2) Các kết chứng tỏ mẫu phân tích mang mầm bệnh tristeza với kết kiểu hình Từ kết thí nghiệm cho thấy, mẫu nên tách chiết điều kiện lạnh để tránh làm biến tính protein kháng nguyên virus gây bệnh tristeza 4.2.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng BSA pha loãng đệm Conjugate buffer Albumin huyết bò (Bovine serum albumin – BSA) protein sử dụng nhiều kỹ thuật lai phân tử với vai trò chất blocking BSA có khả liên kết vào giếng ELISA vị trí khơng có kháng thể bắt giữ Do đó, ngăn chặn liên kết khơng đặc hiệu kháng thể cộng hợp enzyme với bề mặt giếng ELISA Ngồi ra, BSA có tác dụng giảm bớt tín hiệu nền, tăng cường tín hiệu lai đặc hiệu [22], [29] Vì vậy, để tăng cường tính đặc hiệu kỹ thuật ELISA phát bệnh tristeza tiến hành thử nghiệm nồng độ BSA bổ sung vào đệm cộng hợp (conjugate buffer) Kết thể hình 4.3 Hình 4.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng hàm lương BSA pha loãng đệm Conjugate buffer TN3: hàm lượng BSA 2,0 g/l; TN4: Hàm lượng BSA 4,0 g/l Kết nghiên cứu so sánh nồng độ BSA khác (2,0 g/l TN3 4,0 g/l TN4) cho thấy: đệm cộng hợp bổ sung BSA với hàm lượng 2,0 g/l (TN3 hình 4.3), khơng có khác biệt cường độ tín hiệu màu giếng phân tích mẫu bị bệnh mẫu khơng bị bệnh Điều chứng tỏ Luan van 27 hàm lượng BSA khơng đủ để liên kết vào vị trí trống giếng ELISA dẫn đến kháng thể cộng hợp enzyme liên kết không đặc hiệu vào vị trí làm cho tín hiệu màu phản ứng tăng lên Khi thử nghiệm với hàm lượng BSA 4,0 g/l (TN4 hình 4.3) giếng phân tích mẫu bị bệnh (cột 1) có cường độ tín hiệu màu cao rõ ràng so với cường độ tín hiệu màu mẫu kiểm chứng âm tính Các giếng phân tích mẫu khơng bị bệnh (cột 2), cường độ tín hiệu màu thu thấp mẫu kiểm chứng âm tính phù hợp với kết kiểu hình Kết cho thấy, sử dụng nồng độ BSA 4,0 g/l đệm cộng hợp giúp tăng độ đặc hiệu kỹ thuật ELISA phát tristeza cam, qt Do đó, thí nghiệm sử dụng BSA với nồng độ 4,0 g/l 4.2.3 Kết nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện rửa Trong kỹ thuật ELISA, bước rửa có vai trò đặc biệt quan trọng giúp loại bỏ phân tử lai không đặc hiệu phải giữ phân tử liên kết đặc hiệu giếng Trong thí nghiệm này, chúng tơi thử nghiệm phương pháp rửa lần, lần ngâm phút dung dịch đệm rửa (washing buffer) phương pháp rửa lần, lần ngâm phút dung dịch đệm rửa Kết phân tích ELISA phát bệnh tristeza điều kiện rửa thể hình 4.4 Hình 4.4 Kết phát bệnh tristeza kỹ thuật ELISA điều kiện rửa khác C1: Rửa lần; C2: Rửa lần Luan van 28 Kết thu thể hình 4.4 cho thấy khơng khác biệt cường độ tín hiệu màu giếng tương ứng cách rửa Kết phân tích kỹ thuật ELISA phù hợp với kết kiểu hình Như vậy, để giảm thời gian phân tích, chúng tơi sử dụng phương pháp rửa lần, lần ngâm phút dung dịch đệm rửa 4.2.4 Kết nghiên cứu thời gian ủ chất màu Trong kỹ thuật ELISA này, kháng thể phát sử dụng loại kháng thể cộng hợp với enzyme alkaline phosphatase, chất sử dụng để phát pnitrophenol photphate Dưới tác dụng alkaline phosphatase, nhóm phosphate từ alkaline phosphatase không màu bị loại bỏ tạo thành sản phẩm p-nitrophenol có màu quan sát mắt thường [9] Do đó, hàm lượng p-nitrophenol photphate ảnh hưởng đến hành thành tín hiệu màu kỹ thuật ELISA Thời gian ủ chất liên quan đến lượng sản phẩm p-nitrophenol hình thành ảnh hưởng đến cường độ tín hiệu màu phản ứng ELISA Trong nghiên cứu này, tiến hành theo dõi thời gian để kết ELISA hiển thị rõ ràng đặc hiệu Kết thể hình 4.5 dưới đây: Hình 4.5 Kết nghiên cứu thời gian ủ chất màu a 1h sau thêm chất; b 2h sau thêm chất; c 3h sau thêm chất; d 4h sau thêm chất Kết hình 4.5 cho thấy: Sau 1h ủ chất (hình 4.5a), chưa có tín hiệu màu xuất mẫu kiểm chứng dương tính, mẫu kiểm chứng âm tính Luan van 29 mẫu phân tích, chứng tỏ thời gian ủ chưa đủ để enzyme chuyển hóa chất thành sản phẩm màu Sau ủ chất 2h (hình 4.5b), giếng bắt đầu xuất màu vàng nhạt, quan sát mắt thường nhiên khác biệt màu sắc giếng kiểm chứng dương tính mẫu phân tích so với mẫu kiểm chứng âm tính chưa rõ ràng Sau thời gian ủ 3h (hình 4.5c), tín hiệu màu xuất rõ ràng, dễ nhận biết mắt thường Đồng thời, cường độ tín hiệu màu mẫu kiểm chứng dương tính khác biệt hồn tồn với mẫu kiểm chứng âm tính Các mẫu phân tích có cường độ tín hiệu màu cao hẳn so với mẫu kiểm chứng âm tính phù hợp với kết phân tích mẫu bị bệnh tristeza Kết hoàn toàn đặc hiệu Khi tăng thời gian ủ chất lên 4h (hình 4.5d), cường độ tín hiệu màu cao khơng có khác biệt mẫu kiểm chứng âm tính với mẫu cịn lại Đây kết phân tích khơng đặc hiệu Từ kết cho phép kết luận rằng: kỹ thuật ELISA này, thời gian ủ chất phù hợp 3h 4.2.5 Kết nghiên cứu thời gian ủ mẫu phân tích Thời gian ủ mẫu phản ứng ELISA ảnh hưởng đến khả bắt cặp kháng nguyên với kháng thể bắt giữ (capture antibody) Để nghiên cứu ảnh hưởng này, mẫu ủ giếng ELISA 2h 4h trước rửa để loại bỏ phân tử lai không đặc hiệu Kết phản ứng ELISA thể hình 4.6 dưới đây: Hình 4.6 Kết phân tích ảnh hưởng thời gian ủ mẫu phân tích a ủ 2h; b ủ 4h Luan van 30 Kết phân tích hình 4.6 cho thấy: tăng thời gian ủ mẫu từ 2h lên 4h, cường độ tín hiệu màu tăng lên hoàn toàn quan sát mắt thường Tín hiệu màu mẫu kiểm chứng dương tính mẫu phân tích cao so với mẫu kiểm chứng âm tính hồn tồn đặc hiệu Như vậy, thời gian ủ mẫu phân tích 4h phù hợp cho kỹ thuật ELISA phát tristeza phát triển nghiên cứu 4.2.6 Kết nghiên cứu xác định nồng độ mẫu tối thiểu cần cho phản ứng ELISA Để xác định nồng độ mẫu tối thiểu cần cho phản ứng ELISA, tiến hành nghiền 0,2 g bị bệnh tristeza 1,2 ml đệm tách chiết, ly tâm thu dịch sau pha lỗng dịch ban đầu nồng độ pha loãng 2, 4, 8, 16 32 lần 200 µl dung dịch mẫu nồng độ pha loãng khác sử dụng để thử nghiệm kỹ thuật ELISA Kết phản ứng ELISA thể hình 4.7 sau: Hình 4.7 Kết nồng độ mẫu tối thiểu cần cho phản ứng ELISA a Bước ủ mẫu phân tích; b Kết sau ủ chất Kết nghiên cứu thể hình 4.7 cho thấy: nồng độ dung dịch mẫu thấp, cường độ tín hiệu màu kỹ thuật ELISA thấp Ở độ pha loãng 16 lần (giếng 1G 2G) 32 lần (giếng 1H 2H), cường độ tính hiệu màu giếng phân tích khơng có sai khác so với cường độ tín hiệu màu giếng kiểm chứng âm tính (giếng 1B 2B) Điều chứng tỏ nồng độ pha loãng 16 lần trở lên, hàm lượng kháng nguyên virus tristeza không đủ phép phát mẫu dương tính kỹ thuật ELISA nghiên cứu Như vậy, kỹ thuật ELISA phát triển nghiên cứu phát bệnh tristeza độ pha loãng mẫu lần trở lên Luan van 31 Từ kết phân tích trên, chúng tơi xây dựng quy trình kỹ thuật ELISA phát tristeza sau: Bước 1: Chuẩn bị mẫu: - Lấy 0,2 g mẫu cam, quýt, cắt nhỏ cho vào ống eppendorf loại 2ml mới, vô trùng Bổ sung vào ống eppendorf viên bi inox 1.200 µl dung dịch đệm tách chiết Đặt eppendorf chứa mẫu vào máy đồng hóa, nghiềm mẫu chu kỳ, chu kỳ 30 giây tốc độ 4.000 vòng/phút để thu dung dịch đồng - Ly tâm mẫu tốc độ 10.000 vòng/phút 15 phút, nhiệt độ 10oC - Dùng micropipet chuyển phần dịch sang ống eppendorf 1,5 ml mới Bước 2: Chuẩn bị kháng thể bắt giữ đặc hiệu: - Pha loãng kháng thể bắt giữ (Capture antibody) hãng Agritest dung dịch đệm Coating buffer theo tỷ lệ 1:500 (v/v) - Bổ sung 200 µl kháng thể bắt giữ đặc hiệu pha loãng vào giếng - Ủ 37oC 2h Để cố định kháng thể vào giếng - Rửa đĩa lần dung dịch đệm rửa (Washing buffer) nhiệt độ phòng, lần ngâm phút Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch giếng Bước 3: Bổ sung mẫu phân tích: - Bổ sung 200 µl/giếng dung dịch mẫu phân tích - Ủ 4h 37oC - Rửa đĩa lần dung dịch đệm rửa (Washing buffer) nhiệt độ phòng, lần ngâm phút Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch giếng Bước 4: Bổ sung kháng thể cộng hợp enzyme: - Pha loãng kháng thể cộng hợp enzyme (Conjugate antibody) hãng Agritest dung dịch đệm cộng hợp (Conjugate buffer) (hàm lượng BSA đệm 4g/lít) theo tỷ lệ 1:500 (v/v) - Bổ sung 200 µl/giếng dung dịch chứa kháng thể cộng hợp - Ủ 2h 37oC qua đêm oC - Rửa đĩa lần dung dịch đệm rửa (Washing buffer) nhiệt độ phòng, lần ngâm phút Dùng micropipipet để loại bỏ hoàn toàn dung dịch giếng Bước 4: Bổ sung chất: - Pha loãng chất p-nitrophenil phosphate (Merck) dung dịch đệm chất (Substrate buffer) theo tỷ lệ 1/10 (m/v) Luan van 32 - Bổ sung 200 µl chất vào giếng - Ủ nhiệt độ phòng nơi tránh ánh sáng 3h hiển thị màu rõ ràng phát mắt thường Bước 5: Kiểm tra đọc kết Quan sát tín hiệu màu hình thành giếng Kết xác định trường hợp mẫu kiểm chứng dương tính có cường độ màu cao so với mẫu kiểm chứng âm tính Các mẫu cho tín hiệu màu cao so với mẫu kiểm chứng âm tính xác định mẫu nhiễm virus gây bệnh tristeza có múi Các mẫu có tín hiệu màu thấp tín hiệu màu mẫu kiểm chứng âm tính xác định mẫu âm tính với virus gây bệnh tristeza Quy trình kỹ thuật ELISA có giới hạn phát nồng độ mẫu pha loãng lần 4.3 Kết thử nghiệm quy trình kỹ thuật ELISA phát bệnh Tristeza mẫu thu thập Với quy trình kỹ thuật ELISA phát virus gây bệnh tristeza có múi xây dựng, tiến hành thử nghiệm 20 mẫu có múi gồm 10 có kiểu hình bị bệnh tristeza 10 mẫu có kiểu hình không bị bệnh tristeza Kết thử nghiệm tổng hợp hình 4.8 bảng 4.2 dưới đây: Hình 4.8 Kết thử nghiệm quy trình ELISA phát bệnh tristeza mẫu thu thập I Kết phản ứng ELISA; II Ghi thứ tự bổ sung mẫu phân tích Luan van 33 Bảng 4.2 Kết thử nghiệm quy trình ELISA phát bệnh tristeza mẫu thu thập Kết phát Đặc điểm biểu ELISA bệnh STT Ký hiệu mẫu CBH -1 Bị bệnh Không bị bệnh CBH -2 Không bị bệnh Không bị bệnh CS1-1 Không bị bệnh Không bị bệnh CS2-1 Không bị bệnh Không bị bệnh CS4-1 Không bị bệnh Không bị bệnh CS5-1 Bị bệnh Không bị bệnh CS0-1 Không bị bệnh Không bị bệnh CC1 Không bị bệnh Không bị bệnh CC2 Không bị bệnh Không bị bệnh 10 QN4 Không bị bệnh Không bị bệnh 11 V2-1 Bị bệnh Bị bệnh 12 V2-2 Bị bệnh Bị bệnh 13 V2-3 Bị bệnh Bị bệnh 14 V2-4 Bị bệnh Bị bệnh 15 V2-5 Bị bệnh Bị bệnh 16 V2-6 Không bị bệnh Bị bệnh 17 V2-7 Bị bệnh Bị bệnh 18 V2-8 Bị bệnh Bị bệnh 19 V2-9 Bị bệnh Bị bệnh 20 V2-10 Bị bệnh Bị bệnh Kết phân tích ELISA hình 4.8 tổng hợp bảng 4.2 cho thấy: Trong số 10 mẫu cam, qt có kiểu hình bị bệnh tristeza, kỹ thuật ELISA phát mẫu (chiếm tỷ lệ 90%) mẫu cho kết Luan van 34 âm tính, chiếm tỷ lệ 10% Như vậy, kỹ thuật ELISA phát triển nghiên cứu có 9/10 mẫu dương tính thật 01 mẫu âm tính giả Trong số 10 mẫu có kiểu hình khơng bị bệnh, kỹ thuật ELISA phát mẫu (chiếm tỷ lệ 80%) có mẫu cho kết dương tính, chiếm tỷ lệ 20% Như vậy, kỹ thuật ELISA phát 8/10 mẫu âm tính thật 02 dương tính giả Từ kết thử nghiệm trên, xác định độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật ELISA so với kết phân tích kiểu hình 90% 80% Luan van 35 Phần KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu trên, đưa số kết luận sau: Đã thu thập 20 mẫu cam, quýt phục vụ cho nghiên cứu có 10 mẫu có kiểu hình bị bệnh 10 mẫu có kiểu hình khơng bị bệnh tristeza Đã xây dựng quy trình kỹ thuật ELISA phát virus gây bệnh tristeza có múi Quy trình có giới hạn phát sử dụng 200 µl mẫu có độ pha lỗng lần Đã thử nghiệm quy trình kỹ thuật ELISA 20 mẫu cam quýt Kết thử nghiệm cho thấy, độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật ELISA 90% 80% so với kết phân tích kiểu hình 5.2 Kiến nghị Do thời gian có hạn, đề tài cịn nhiều nội dung cần tiếp tục nghiên cứu: - Cần xác định giới hạn phát kỹ thuật ELISA theo nồng độ kháng nguyên virus mẫu phân tích - Cần thử nghiệm kỹ thuật ELISA với số lượng mẫu lớn để xác định xác độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật so với kết phân tích kiểu hình - Cần nghiên cứu xác định kết ELISA máy đọc ELISA Luan van 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nơng Thơn (2020), Tổng diện tích ăn phân theo địa phương, Số liệu trồng trọt Nguyễn Minh Châu (2012) Quản lý tổng hợp bệnh vàng greening có múi ớ tỉnh phía Nam Việt Nam, Bệnh virus hại thực vật Việt Nam 2: 264-277 Bùi Huy Đáp (1960), Cây ăn nhiệt đới, tập (1), Nxb Nông Thôn La Việt Hồng, Chu Hoàng Hà, Đặng Thị Hương, Lâm Đại Nhân (2011), Nghiên cứu cấu trúc di truyền số dòng citrus tristeza gây bệnh ăn chi Citrus Việt Nam Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP Hà Nội 2, 16: 117-126, Hà Nội Hoàng Thị Thủy (2015) Nghiên cứu đặc điểm sinh học số biện pháp kỹ thuật đối với nguồn thực liệu tạo khơng hạt có múi Luận án Tiến sỹ Nơng nghiệp Hà Minh Trung (2006), Hồn thiện cơng nghệ sản xuất có mùi đặc (cam, qt, bưởi) bệnh greening bệnh virus khác tính phía Bắc, Kỷ yếu Hội nghị tổng kết khoa học công nghệ nông nghiệp Nhà xuất Nơng nghiệp, 190- 205 Hồng Văn (1/2021), Cây ăn có múi mang lại giá trị kinh tế cao, Tạp chí Kinh tế nơng thơn II Tiếng Anh Ahmad M H., A R J Eaglesham A.R.J., and Hassouna S (1981) Examining serological diversity of “cowpea” rhizobia by the ELISA technique Archives of Microbiology 130: 281–287 Aulbach A.D., and Amuzie C.J (2017) Chapter One - Calcium and Bone Metabolism Indices Advances in Clinical Chemistry 82: 1-46 10 Bar-Joseph M., Garnsey S.M., Gonsalves D., Moscovitz M., Punrcifull D.E., Clark M.F Loebenstein G (1979) The use of Enzyme – linked Luan van 37 Immunosorrbenrt assay for detection of citrus tristeza virus Phytopathology 69: 190-194 11 Berk Z (2016) Diseases and pests In Citrus Fruit Processing, Academic Press 83-93 12 Borah M., Nath P.D Saikia A.K (2014) Biologycal and serological techniques for detection of citrus tristeza virus affecting Citrus species of Assam, India African Journal of Agricultural Research (52): 3804-3810 13 Cambra M., Goriris M.T., Marroquin C., Roman M.P Olmos A.O., Martinez M.C., Hermoso de Mendoza A Lopez A and Navarro L (2000) Incidence and epidemiology of Citrus tristeza virus in the Valencian Community of Spain Virus Research 71 (1–2): 85-95 14 Castillo J., Martí M.R., Gowda S., Hilf E.M., Garnsey S.M., and Dawson W.O (1997) Kinetics of Accumulation of Citrus Tristeza Virus RNAs Virology 228 (1): 92-97 15 Cheng C.M., Martinez A.W., Jinlong Gong, Mace C.R., Phillips S.T., Carrilho E., Mirica K.A., Whitesides G.M (2010) Paper-Based ELISA Angewandte Chemie 49 (28): 4771-4774 16 Domínguez A., Guerri J., Cambra M., Navarro L., Moreno P., and Peña L (2000) Efficient production of transgenic citrus plants expressing the coat protein gene of citrus tristeza virus Plant Cell Reports 19: 427–433 17 Gmitter F.G., and Hu X (1990) The possible role of Yunnan, China, in the origin of contemporary citrus species (Rutaceae) Economic Botany 44: 267–277 18 Gutherie H and Picciano M (1995) Human nutrition St Louis, MO, USA, Mosby 19 Knight A.R., Taylor E.L., Lukaszewski R., Jensen K.T., Jones H.E., Carré J.E., Isupov M.N., Littlechild J.A (2018) A high-sensitivity electrochemiluminescence-based ELISA for the measurement of the oxidative stress biomarker, 3-nitrotyrosine, in human blood serum and cells Free Radical Biology and Medicine 120: 246-254 Luan van 38 20 Moreno P., Ambrós S., Albiach-Marti M.R., Guerri J., and Peña L (1957) Tristeza virus of citrus: a pathogen that changed the course of the citrus industry Molecular Plant Pathology (2): 251–268 21 Reuther W., Batchelor L.D., Webber H.J., et al (1967) The Citrus Industry Volume I: History, World Distribution, Botany, and Varieties CAB Direct 190–430 22 Steinitz M (2000) Quantitation of the Blocking Effect of Tween 20 and Bovine Serum Albumin in ELISA Microwells Analytical Biochemistry 282 (2): 232-238 23 Tanaka Tyozaburo (1969) Taxonomic Problem of Citrus Fruits in the Orient Bulletin of the University of Osaka 21: 133-138 24 Thaitrong N., Charlermroj R., Himananto O., Seepiban C., and Karoonuthaisiri N (2013) Implementation of microfluidic sandwich ELISA for superior detection of plant pathogens PLoS One (12): 1-9 25 United States Department of Agriculture (2021) Citrus: World Markets and Trade Foreign Agricultural Service 26 Vela C., Cambra M., Cortés E., Moreno P., Miguet J.G., Pérez De San Román C., and Sanz A (1986) Production and characterization of monoclonal antibodies specific for citrus tristeza virus and their use for diagnosis Journal Of General Virology 67 (1): 91-96 27 Walker H.K., Hall W D and Hurst J W (1990) Clinical methods: The history, physical, and laboratory examinations” 3rd edition Butterworth Publishers ISBN-10: 0-409-90077-X 28 Whitney E and Rolfes S (1999) Understanding nutrition Belmont, Ca., USA, West/Wadsworth Eighth ed 29 Xiao Y and Isaacs S.N (2012) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) and Blocking with Bovine Serum Albumin (BSA) - Not all BSAs are alike Journal of immunological methods 384 (1-2): 148–151 Luan van ... thực đề tài: ? ?Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật ELISA chẩn đoán bệnh Tristeza cam, quýt? ?? 1.2 Mục tiêu đề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Xây dựng phương pháp chẩn đoán bệnh Tristeza cam, quýt 1.2.2 Mục... TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ YẾN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ELISA CHẨN ĐOÁN BỆNH TRISTEZA TRÊN CÂY CAM, QUÝT KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo: Chính quy Chuyên ngành:... tiêu cụ thể - Thu thập mẫu bệnh Tristeza cam, quýt - Xây dựng quy trình kỹ thuật ELISA phát bệnh Tristeza - Thử nghiệm quy trình kỹ thuật ELISA phát bệnh Tristeza cam, quýt 1.3 Ý nghĩa khoa học