Luận Án Tách Dõng, Biểu Hiện Và Nghiên Cứu Tính Chất Của Endochitinase Từ Bacillus Thuringiensis Phân Lập Ở Việt Nam.pdf

1 MỞ ĐẦU Đặt vấn ề Trong nhiều năm qua, thuốc tr sâu sinh học t vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) nghiên cứu ứng dụng để diệt tr loại côn trùng hại trồng bảo vệ sức khỏe cộng đồng Cùng với phát triển kinh tế - xã hội, nhu cầu sử dụng sản phẩm nông nghiệp sạch, hạn chế mức thấp thuốc tr sâu hóa học sản xuất nơng nghiệp người ngày cao Thuốc tr sâu sinh học Bt sử dụng, chúng khắc phục tính kháng thuốc trùng diệt lồi trùng có hại mà khơng ảnh hưởng đến môi trường sinh thái sức khỏe người Trong trình sinh trưởng, vi khuẩn Bt sản sinh số chất chuyển hóa có tiềm ứng dụng như: enzym thủy phân chitin (chitinase) chất kháng sinh Các sản phẩm chuyển hóa ức chế vi khuẩn gây bệnh qua thực phẩm ho c kìm hãm phát triển vi sinh vật gây bệnh vi khuẩn, nấm Vì vậy, việc tạo lượng lớn enzym, đ c biệt chitinase bổ sung vào chế phẩm sinh học Bt để tăng hoạt tính diệt trùng cần thiết Chitinase (EC 3.2.1.14) thuộc nhóm enzym thủy phân, xúc tác trình phân hủy chất chitin khơng tan nước thành sản phẩm chitin-oligosaccharide hịa tan nước thơng qua trình thủy phân liên kết β-(1,4)- glucoside C1 C4 hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp chitin Hiện nay, chitinase ứng dụng chủ yếu sản xuất chitooligosaccharide, nano-chitin, N-acetyl-D-glucosamine Đây sản phẩm giá trị ứng dụng cao sử dụng thực phẩm, nơng nghiệp, y dược Ngồi ra, chitinase đ c biệt endochitinase sử dụng thuốc tr sâu sinh học nông nghiệp nhờ khả phân hủy chitin cấu trúc thành tế bào nấm, côn trùng gây bệnh xử lý chất thải giàu chitin Do kiểu phân cắt mà endochitinase phân cắt chất chitin vách tế bào nấm chứa chitin tốt so với chitobiosidase N – acetylglucosaminidase Vì vậy, việc phân lập tìm chủng Bt sinh endochitinase cao qui trình tạo endochitinase có hoạt tính cao cơng nghệ gen nhằm góp phần tăng hiệu chế phẩm sinh học cần thiết Xuất phát t lý trên, tiến hành lựa chọn đề tài luận án: “Tách d ng, biểu nghiên cứu tính chất c a endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập Việt Nam” M c tiêu nghiên cứu 2.1 M c tiêu chung Tuyển chọn chủng vi khuẩn B thuringiensis địa có khả sinh chitinase cao biểu chitinase tái tổ hợp E coli phục vụ nghiên cứu sản xuất chế phẩm hỗ trợ khả diệt côn trùng chế phẩm BT ức chế nấm hại trồng 2.2 M c tiêu c thể (1) Sàng lọc thu nhận chủng vi khuẩn B thuringiensis Việt Nam có khả sinh tổng hợp chitinase cao xác định trình tự nucleotide gen mã hóa chitinase t chủng vi khuẩn Bt tuyển chọn (2) Biểu tinh chitinase tái tổ hợp (rChiA) E coli BL21 (DE3) (3) Đánh giá tác dụng tương hỗ chitinase tái tổ hợp với protein tinh thể Cry diệt côn trùng khả ức chế nấm gây bệnh thực vật Nội dung nghiên cứu (1) Phân lập nghiên cứu đ c điểm sinh học số chủng vi khuẩn B thuringiensis Việt Nam có khả sinh tổng hợp chitinase cao; (2) Nghiên cứu số điều kiện ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng B thuringiensis tuyển chọn; (3) Nghiên cứu tách dịng xác định trình tự gen mã hóa chitinase phân lập t chủng B thuringiensis tuyển chọn; (4) Nghiên cứu biểu gen mã hóa chitinase t chủng B thurigiensis tuyển chọn tinh chitinase tái tổ hợp; (5) Nghiên cứu số tính chất hóa lý chitinase tái tổ hợp; (6) Nghiên cứu khả ức chế nấm gây bệnh thực vật chitinase tái tổ hợp tác dụng hỗ trợ chitinase khả diệt côn trùng protein tinh thể Cry Nh ng ng g p c a luận án (1) Tuyển chọn 36 chủng vi khuẩn B thuringiensis Việt Nam có khả sinh tổng hợp chitinase cao (2) Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu cách có hệ thống endochitinase (tự nhiên tái tổ hợp) t chủng B thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 Việt Nam có khả bảo vệ kép (Dual control) - v a kháng nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani gây bệnh thực vật v a tăng hoạt tính diệt côn trùng chế phẩm BT nhằm phục vụ cho phát triển thuốc tr sâu bệnh sinh học hệ (3) Bổ sung sở liệu nguồn gen chitinase chủng B thuringiensis Việt Nam phục vụ cho nghiên cứu, đào tạo ứng dụng sau Ý nghĩa khoa học th c tiễn c a ề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học Bổ sung thêm sở liệu gen mã hóa chitinase t chủng vi khuẩn phân lập Việt Nam, làm sở khoa học nguyên liệu di truyền để tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả sinh tổng hợp thu hồi chitinase cao so với chủng tự nhiên, ứng dụng sản xuất công nghiệp Kết luận án cịn góp phần phát triển cơng nghệ lên men vi sinh vật tái tổ hợp sản xuất chitinase có hiệu suất cao Cơng trình làm phong phú thêm thông tin lĩnh vực công nghệ enzym nhờ nghiên cứu sinh tổng hợp, tinh sạch, đ c tính lí hóa định hướng ứng dụng chitinase 5.2 Ý nghĩa th c tiễn Kết luận án góp phần khai thác có hiệu tiềm nguồn gen vi sinh vật nước nói chung gen chiA nói riêng nhằm tạo sản phẩm enzym cơng nghiệp có giá trị ứng dụng lĩnh vực nông nghiệp, công nghiệp, hướng tới phát triển cơng nghệ sản phẩm có ích cho sức khỏe người, không gây ô nhiễm môi trường Tạo chủng E coli tái tổ hợp biểu cao chitinase t chủng B thuringiensis serovar kurstaki MSS1.1 Việt Nam bước đầu nghiên cứu phát triển chế phẩm sinh học BT diện côn trùng nấm gây bệnh nhằm hỗ trợ thay thuốc tr sâu hóa học Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khu n Bacillus thuringiensis l c v B thuringiensis Bacillus thuringiensis (Bt) vi khuẩn đất thuộc chi Bacillus, mơi trường sống Bt gồm đất, côn trùng, hạt ngũ cốc, bề m t thực vật B thuringiiensis có dạng hình que, gram dương, hơ hấp hiếu khí ho c kị khí khơng bắt buộc, sinh bào tử, bào tử hình oval, trình hình thành bào tử hầu hết chủng Bt tổng hợp protein tinh thể Tinh thể có kích thước 0,6 - µm, có hình dạng khơng cố định hình lập phương, hình lưỡng tháp ho c hình cầu Tinh thể chiếm tới 30% trọng lượng khô tế bào Khi nhuộm tế bào Bt thuốc nhuộm coomassie brilliant blue quan sát kính hiển vi, tinh thể Bt bắt màu xanh đậm cịn bào tử bắt màu xanh nhạt Trong mơi trường lỏng Bt có khả chuyển động nhờ lơng roi bề m t tế bào (Hình 1.1) (Ngơ Đình Bính, 2011) Bt có khả sinh trưởng, phát triển khoảng nhiệt độ 20 - 40ºC, nhiệt độ tối ưu 28 32ºC, Bt phát triển tối ưu pH = Bt phân loại theo nhiều phương pháp khác nhau: dựa đ c điểm hình thái đ c điểm sinh hố, theo ngoại hình enzym lipase, theo typ huyết kháng nguyên - O, theo typ huyết kháng protein tinh thể, theo typ huyết kháng nguyên - H, theo nguồn bệnh theo gen mã hóa protein độc tố diệt trùng Trong đó, phương pháp phân loại theo de Barjac Bonnefoi dựa nguyên lý phản ứng kháng nguyên - kháng thể sử dụng rộng rãi (khi kháng nguyên tiêm mao kết hợp với kháng thể xảy phản ứng ngưng kết tạo c n lắng màu trắng xuống đáy ống nghiệm quan sát mắt thường Dưới kính hiển vi quang học ho c đối pha quan sát thấy tế bào bị cố định lại khơng chuyển động (Hình 1.2) Đến năm 1999, phát 69 typ huyết bao gồm 82 thứ huyết khác Bt (de Barjac Bonnefoi, 1962) Axit nucleic Màng tế bào Thành tế bào Tiêm mao Ribosome Plasmide Mezosome Hình đồ cấu tạo tế bào B thuringiensis (Ngu n: Ngô Đ nh nh, 2011 Tế bào vi khuẩn Phân tử kháng thể với kháng nguyên với hai vị trí liên bề m t kết đ c hiệu Hình Phản ứng ngưng kết Phản ứng ng ng kết vi khuẩn Bt với kháng nguyên tiêm mao H Ngu n: Ngô Đ nh nh, 2011 Các tinh thể protein hình thành trình tạo bào tử, chúng tạo thành t ho c vài gen cry (crystal) gen cyt (cytolytic) mã hóa tinh thể độc nằm plasmid lớn số xuất nhiễm sắc thể Tùy theo thành phần protein cấu tạo khác mà tinh thể có hình dạng khác Hầu hết tinh thể có hoạt tính với trùng cánh vảy có dạng hình lưỡng tháp, tinh thể có hoạt tính với trùng hai cánh có dạng hình cầu, tinh thể có hoạt tính với trùng cánh cứng có dạng hình cầu, hình khối lập phương Ngồi ra, trình sinh trưởng, phát triển vi khuẩn Bt cịn sản sinh chất chuyển hóa có tiềm ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực như: môi trường, thực phẩm, y tế, nông nghiệp, công nghiệp, công nghệ sinh học…đó enzym thủy phân chitin (chitinase) Hiện nay, giới có khoảng 38 gen chitinase cơng bố thuộc lồi khác như: kenyea, pakistani, colmeri, canadiensis, entomocidus, kurstaki, israelensis konkukian Trong chủ yếu tách dịng Trung Quốc (55%), lại Mexico, M , Ai Cập, Thổ Nhĩ Kỳ, Thái Lan, Ấn Độ, Pakistan, Tunisia Hàn Quốc (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) phát tri n v ứng ng chitinase t B thuringiensis giới Enzym thủy phân chitin (chitinase) t Bt biết đến t đầu năm 1970 tác dụng tương hỗ chitinase thuốc tr sâu sinh học Ấu trùng Choristoneura fumiferana gây bệnh thông xử lý với hỗn hợp Btchitinase chết nhanh nhiều xử lý với chitinase ho c Bt (Smirnoff, 1973; Morris, 1976) Trộn chitinase với Bt cho thấy t lệ chết bướm đêm (Lymantria dispar) tăng nhanh thử nghiệm với Bt (Dubois, 1977) Hoạt tính diệt ấu trùng sâu bướm tăng khoảng lần có tương trợ chitinase vi khuẩn Bt (Gunner et al., 1985) Độc tính với Spodoptera littoralis tăng đáng kể sử dụng hỗn hợp độc tố Bt tái tổ hợp nồng độ thấp endochitinase t Serratia marcescens (Regev et al., 1996) Để tăng hiệu diệt côn trùng độc tố Bt khắc phục tính kháng thuốc trùng gây hại, nhà nghiên cứu sử dụng hỗn hợp protein độc tố với chitinase làm tăng hiệu Cry1Ac chống ấu trùng Helicoverpa armigera Cry1C chống Spodoptera littoralis (Regev et al., 1996) Độc tính hỗn hợp bào tử tinh thể t chủng B thuringiensis var kurstaki HD-1 ấu trùng sâu bướm tăng lên rõ rệt bổ sung chitinase t Bt, đồng thời côn trùng thử nghiệm xuất tổn thương phân hủy tế bào tế bào biểu mô ruột (Wiwat et al., 2000) Năm 2002, Liu cộng chứng minh chitinase sản sinh t Bt pakistani có khả làm tăng hoạt tính diệt ấu trùng Spodoptera exigua chủng Bt DL5789 lên 2,35 lần (Liu et al., 2002) Năm 2003, Lertcanawanichakul cộng chuyển gen chitinase vào chủng vi khuẩn Bt aizawai, kết thu hoạt tính chitinase tăng gấp 15 lần độc tính ấu trùng bướm đêm cao so với bố m Cũng năm này, Arora cộng biểu gen chitinase tách t chủng Bt HD-1 E coli, sau sử dụng chitinase tái tổ hợp kết hợp với protein Vip Bt để tăng hoạt tính chống lại ấu trùng sâu khoang - Spodoptera litura Năm 2004, Reyes-ramirez cộng nghiên cứu chứng minh chitinase t Bt israelensis ức chế 100% nấm Sclerotium rolfsii, ức chế 55 - 82% loài nấm gây bệnh khác như: A terreus, A flavus, Nigrospora sp., Rhizopus sp., A niger, Fusarium sp., A candidus, Absidia sp Helminthosporium sp., 45% Curvularia sp 10% với nấm A fumigatus Khi hạt đậu tương bị nhiễm nấm S rolfsii, tỉ lệ nảy mầm giảm t 93% xuống 25%, bổ sung chitinase (0,8 U/mg protein) tỉ lệ nảy mầm tăng lên đến 90% Năm 2005, Driss cộng tìm gen chitinase chi255 gen t Bt kurstaki, enzym xếp vào lớp chitobiosidase có hoạt tính kháng nấm cao Năm 2007, Kamil cộng phân lập chủng Bt MS4 sinh chitinase mức độ cao kháng mạnh với loài nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh thực vật Năm 2011, Usharani phân lập gen exochitinase có kích thước 1129bp, mã hóa 360 axit amin kháng loại nấm gây bệnh thực vật Năm 2012, Gomaa chứng minh chitinase t chitinase t Bt có hiệu B licheniformis việc làm tăng tỉ lệ nảy mầm hạt đậu lây nhiễm nấm gây bệnh Cũng năm Kuzu cộng phân lập chủng B thuringiensis subsp kurstaki HBK-51 t đất Chủng Bt sản sinh chitinase có khả chịu nhiệt kiềm (ở 110ºC, hoạt tính cịn lại 96% pH 912 cịn lại 98% hoạt tính) Vì vậy, coi chủng quan trọng sử dụng nhà máy sản xuất chitinase, ứng dụng số lĩnh vực quan trọng (Kuzu et al., 2012) Vào năm 2015, nhà khoa học Trung Quốc phân lập gen chiA mã hóa chitinase họ 18 t chủng B thuringiensis YBT-9602, tiến hành gây đột biến gen biểu E coli Hoạt tính thủy phân chitin đột biến ChiW50A tăng 60% với yêu cầu pH, nhiệt độ, ion kim loại tương tự chủng dại Hơn nữa, đột biến ChiW50A thể khả kiểm soát sâu bệnh hoạt động kháng nấm Tác động cộng hưởng đáng kể đột biến với chế phẩm bào tử - tinh thể B thuringiensis chống lại ấu trùng Helicoverpa armigera Caenorhabditis elegans khả ức chế phát triển số nấm gây bệnh thực vật (Ni et al., 2015) Qua thời gian dài phát triển đến năm 2016, gen chiA mã hóa endochitinase chủng B thuringiensis subsp tenebrionis DSM-2803 tạo dòng biểu E coli Protein tái tổ hợp có gắn thêm đoạn 6-Histidine tinh sắc ký lực Emzym tái tổ hợp tinh có tác dụng làm giảm tăng trưởng nấm Colletotrichum gloeosporioides – tác nhân gây bệnh thán thư thực vật (de la Fuente-Salcido et al., 2016) Dựa vào khả diệt côn trùng vi khuẩn Bt, nghiên cứu phát triển theo hướng chính: sâu khai thác nguồn gen vi khuẩn Bt để phát triển chế phẩm sinh học diệt côn trùng cung cấp nguyên liệu cho công tác chuyển gen kháng sâu bệnh vào trồng; tìm hiểu vai trò hệ enzym (chitinase, protease, lipase, amylase) vi khuẩn Bt sinh trình sinh trưởng phát triển Các nghiên cứu chitinase t vi khuẩn Bt thực theo số hướng sau: 1) nhân dịng biểu gen mã hóa chitinase; 2) tinh xác định hoạt tính diệt côn trùng, khả kháng nấm chitinase; 3) hiệu suất tiết protein chitinase E coli; 4) tối ưu trình sinh tổng hợp chitinase Tuy nhiên, hoạt tính chitinase thu cịn thấp M t khác, điều kiện mơi trường khác q trình sinh chitinase chủng Bt ln thay đổi Vì vậy, trình nghiên cứu đầy đủ chitinase t khâu phân lập chủng Bt có khả sinh chitinase đến việc lựa chọn điều kiện mơi trường thích hợp cho việc nâng cao khả tổng hợp chitinase, xác định điều kiện ảnh hưởng tới hoạt tính enzym; việc nhân dòng biểu gen mã hóa chitinase t vi khuẩn Bt E coli để nâng cao hoạt tính thủy phân chitin nhằm hỗ trợ hoạt tính diệt sâu chế 10 phẩm BT khả kháng nấm gây bệnh thực vật hướng nghiên cứu cần thiết để tăng hiệu chế phẩm sinh học 1.2 Chitinase t nhiên Chitinase enzym xúc tác q trình phân hủy chất chitin khơng hòa tan nước thành sản phẩm chitooligosaccharide hòa tan nước thơng qua q trình thủy phân liên kết glucosyl Chitin polysacharide mạch thẳng không cuộn xoắn, có màu trắng, cứng khơng đàn hồi tạo nên t đơn phân N-acetyl glucosamine thông qua liên kết 1,4-β glycoside Chitin chất hữu đứng thứ tự nhiên sau cellulose Công thức phân tử chitin: (C8H13 O5 N)n Khối lượng phân tử: (203,09)n với thành phần nguyên tố: C = 47,29%; H = 6,4%; O = 39,4%; N = 6,91% Ở dạng tinh khiết chitin thường dai, tham gia vào thành phần cấu tạo hầu hết động vật không xương chitin lại nguyên liệu tổng hợp Trong vỏ giáp xác động vật thân mềm, chitin kết hợp với canxi carbonate tạo thành hỗn hợp bền vững Sự kết hợp giúp cho chitin cứng đ c so với dạng tinh khiết, đồng thời bền vững giịn so với canxi carbonate Trong tự nhiên, chitin gồm dạng cấu trúc , β -chitin Ở dạng -chitin, chuỗi polysaccharide xuôi ngược xếp xen k nhau, việc xếp làm cho liên kết hydro trở lên mạnh m hơn, làm cho ổn định (Sikorski et al., 2009) Đây dạng phổ biến tự nhiên Dạng -chitin thành phần cấu tạo nên xương ngồi trùng, giáp xác, nhuyễn thể vách tế bào nấm Dạng β-chitin thường hơn, có cấu trúc song song gồm chuỗi polysaccharide xếp hướng, xen k tồn dạng liên kết với protein Loại β thu chủ yếu t động vật thân mềm mực Trong loại -chitin hình thành t hỗn hợp hai loại -chitin β-chitin, cụ thể chuỗi xuôi xen k với chuỗi ngược Chitin thành phần xương ngồi số lồi động vật khơng xương sống (giáp xác, trùng, nhện) thành tế bào hầu hết vi nấm 145 control of Varroa destructor, a honey bee parasite J Invert Pathol 104: 75–82 140 Uchiyama T, Katouno F, Nikaidou N, Nonaka T, Sugiyama J, Watanabe T (2001) Roles of the exposed aromatic residues in crystalline chitin hydrolysis by chitinase A from Serratia marcescens 2170 J Biol Chem 276: 41343-41349 141 Usharani TR and Gowda TKS (2011) Cloning of chitinase gene from Bacillus thuringiensis Indian J Biotechnol 10: 264-269 142 Weijers CA, Franssen MC, Visser GM (2008) Glycosyltransferase-catalyzed synthesis of bioactive oligosaccharides Biotechnol Adv 26: 436–456 143 Wiwat C, Thaithanun S, Pantuwatana S, Bhumiratana A (2000) Toxicity of Chitinase - Producing Bacillus thuringiensis ssp kurstaki HD-1(G) toward Plutella xylostella J Invertebr Pathol 76(4): 270-277 144 Yamabhai M, Emrat S, Sukasem S, Pesatcha P, Jaruseranee N, Buranabanyat B (2008) Secretion of recombinant Bacillus hydrolytic enzyms using Escherichia coli expression systems J Biotechnol 133: 50–57 145 Yan R, Hou J, Ding D, Guan W, Wang C, Wu Z, Li M (2008) In vitro antifungal activity and mechanism of action of chitinase against four plant pathogenic fungi J Basic Microbiol 48(4): 293–301 146 Yan JW, Qian Y (2009) Cloning and expression of a novel chitinase chi58 from Chaetomium cupreum in Pichia pastoris Biochem Genet 47: 547–558 147 Yang CY, Ho YC, Pang JC, Huang SS, Schen SM (2009) Cloning and expression of an antifungal chitinase gene of a novel Bacillus subtilis isolate from Taiwan potato field Bioresource Technol 100(3): 1454-1458 148 Young JM, Chilcott CN, Broadwell A, Wigley PJ, Lecadet MM (1998) Identification of serovars of Bacillus thuringiensis Berliner 1915 in NewZealand New Zeal J Crop Hort 26: 63-68 149 Zarei M, Aminzadeh S, Zolgharnein H, Safahieh A, Daliri M, Noghabi KA, Ghoroghi A, Motallebi A (2011) Characterization of a chitinase with antifungal activity from a native Serratia marcescens B4A Braz J Microbiol 146 42: 1017-1029 150 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 151 http://www.cazy.org/GH18_structure.html 152 http://vegetablemdonline.ppath.cornell.edu/factsheets/Potato_Rhizoctonia.htm PHỤ LỤC Ph l c Trình t so sánh Ngân hàng gen MSS1_1_ChiF EF581163.2 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | ATGGCTATGA GGTCTCAAAA ATTCACACTG CTATTACTAT CCCTACTACT TTTCTTACCT MSS1_1_ChiF EF581163.2 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | CTTTTTCTCA CAAATTTTAT TACTCCAAAT CTCGCATTAG CAGATTCACC AAAGCAAAGT MSS1_1_ChiF EF581163.2 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | CAAAAAATTG TTGGGTACCT TCCTTCGTGG GGCGTTTACG GACGTAATTA TCAAGTTGCT T MSS1_1_ChiF EF581163.2 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | GACATTGATG CATCAAAACT TACTCACCTT AACTATGCTT TCGCGGATAT TTGTTGGAAT MSS1_1_ChiF EF581163.2 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | GGAAAACATG GAAACCCTTC TACTCATCCT GATAATCCAA ATAAACAAAC GTGGAACTGT MSS1_1_ChiF EF581163.2 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | AAAGAATCTG GTGTACCATT GCAAAATAAA GAGGTTCCTA ATGGTACTCT CGTACTCGGG .G MSS1_1_ChiF EF581163.2 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | GAACCATGGG CTGATGTTAC CAAATCGTAT CCTGGCTCAG GGACAACTTG GGAAGATTGC MSS1_1_ChiF EF581163.2 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | GATAAATATG CCCGTTGCGG AAATTTCGGG GAACTAAAAC GATTAAAAGC TAAATATCCT MSS1_1_ChiF EF581163.2 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | CACTTAAAAA CAATTATTTC CGTTGGTGGC TGGACTTGGT CTAACCGCTT TTCTGATATG MSS1_1_ChiF EF581163.2 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | GCCGCTGATG AAAAAACAAG AAAAGTATTT GCTGAATCTA CAGTAGCTTT TCTTCGCGCA MSS1_1_ChiF EF581163.2 610 620 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | TATGGGTTTG ATGGCGTAGA TTTAGACTGG GAATGTCCGG GCGTTGAAAC GATTCCTGGT C A MSS1_1_ChiF EF581163.2 670 680 690 700 710 720 | | | | | | | | | | | | GGTAGTTATC GTCCTGAAGA TAAACAAAAT TTCACTCTCC TTCTTCAAGA CGTCCGAAAT G MSS1_1_ChiF EF581163.2 730 740 750 760 770 780 | | | | | | | | | | | | GCTTTGAATA AAGCAGGTGC TGAAGATGGC AAACAATATT TACTAACAAT CGCTTCAGGT MSS1_1_ChiF EF581163.2 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | GCAAGCCAAC GCTACGCTGA TCATACAGAA CTAAAGAAAA TTTCTCAAAT ACTCGATTGG MSS1_1_ChiF EF581163.2 850 860 870 880 890 900 | | | | | | | | | | | | ATTAATATTA TGACATATGA TTTCCACGGC GGATGGGAAG CTACTTCTAA TCATAATGCA MSS1_1_ChiF EF581163.2 910 920 930 940 950 960 | | | | | | | | | | | | GCTCTATATA AGGATCCAAA TGATCCAGCA GCAAATACGA ATTTTTACGT AGATGGTGCT C MSS1_1_ChiF EF581163.2 970 980 990 1000 1010 1020 | | | | | | | | | | | | ATAAATGTTT ATACAAATGA AGGTGTTCCA GTCGATAAAC TAGTATTAGG CGTACCCTTT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1030 1040 1050 1060 1070 1080 | | | | | | | | | | | | TACGGACGTG GCTGGAAAAG TTGTGGCAAA GAAAATAACG GACAATATCA ACCTTGCAAA MSS1_1_ChiF EF581163.2 1090 1100 1110 1120 1130 1140 | | | | | | | | | | | | CCAGGTAGTG ATGGGAAACT TGCTTCTAAA GGTACTTGGG ATGATTACTC TACCGGTGAC MSS1_1_ChiF EF581163.2 1150 1160 1170 1180 1190 1200 | | | | | | | | | | | | ACAGGTGTCT ATGATTACGG TGATTTAGCA GCCAATTACG TTAATAAAAA TGGTTTTGTA MSS1_1_ChiF EF581163.2 1210 1220 1230 1240 1250 1260 | | | | | | | | | | | | CGCTACTGGA ATGACACAGC TAAAGTACCT TACTTATATA ATGCAACTAC AGGCACATTT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1270 1280 1290 1300 1310 1320 | | | | | | | | | | | | ATTAGCTACG ATGACAATGA ATCTATGAAA TACAAAACAG ACTATATAAA GACGAAAGGT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1330 1340 1350 1360 1370 1380 | | | | | | | | | | | | TTAAGTGGAG CAATGTTTTG GGAACTAAGC GGAGATTGCC GTACAAGTCC AAAATATAGT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1390 1400 1410 1420 1430 1440 | | | | | | | | | | | | TGCAGTGGTC CAAAATTACT TGATACGCTA GTAAAAGAAT TACTTGGTGG ACCTATTAAT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1450 1460 1470 1480 1490 1500 | | | | | | | | | | | | CAAAAAGATA CTGAGCCACC AACGAATGTT AAAAACATTG TAGTTACGAA TAAAAATTCA MSS1_1_ChiF EF581163.2 1510 1520 1530 1540 1550 1560 | | | | | | | | | | | | AACTCAGTTC AATTAAACTG GACTGCATCT ACTGATAACG TAGGAGTTAC GGAATATGAA MSS1_1_ChiF kurstaki 1570 1580 1590 1600 1610 1620 | | | | | | | | | | | | ATTACTGCTG GAGAAGAGAA ATGGAGTACA ACAACAAATA GCATTACAAT TAAAAACTTA MSS1_1_ChiF EF581163.2 1630 1640 1650 1660 1670 1680 | | | | | | | | | | | | AAACCTAATA CGGAATACAA ATTTTCAATA ATTGCCAAAG ATGCTGCTGG AAATAAATCG .A MSS1_1_ChiF EF581163.2 1690 1700 1710 1720 1730 1740 | | | | | | | | | | | | CAACCTACCG CTCTTACTGT CAAAACGGAT GAAGCTAATA CGACACCTCC TGATGGAAAT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1750 1760 1770 1780 1790 1800 | | | | | | | | | | | | GGTACTGCTA CATTTTCAGT CACTTCGAAT TGGGGCAGCG GTTATAACTT CTCGATTATA MSS1_1_ChiF EF581163.2 1810 1820 1830 1840 1850 1860 | | | | | | | | | | | | ATCAAAAATA ATGGAACGAA CCCCATTAAA AATTGGAAAT TAGAATTTGA TTATAGCGGC G T MSS1_1_ChiF EF581163.2 1870 1880 1890 1900 1910 1920 | | | | | | | | | | | | AATTTAACAC AAGTTTGGGA TTCTAAAATT AGTAGTAAAA CAAATAATCA TTATGTAATT MSS1_1_ChiF EF581163.2 1930 1940 1950 1960 1970 1980 | | | | | | | | | | | | ACGAACGCAG GATGGGATGG TGAAATTCCT CCTGGTGGAT CTATTACAAT TGGCGGTGCA A MSS1_1_ChiF EF581163.2 1990 2000 2010 2020 2030 | | | | | | | | | | GGAACAGGTA ATCCTGCCGA ACTTTTAAAT GCCGTCATTA GCGAAAACTA G Hình So sánh trình tự nucleotide đoạn gen chiA chủng MSS1.1 với trình tự EF581163.2 GenBank 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa MAMRSQKFTL LLLSLLLFLP LFLTNFITPN LALADSPKQS QKIVGYLPSW GVYGRNYQVA ABQ65137.2 F 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa DIDASKLTHL NYAFADICWN GKHGNPSTHP DNPNKQTWNC KESGVPLQNK EVPNGTLVLG ABQ65137.2 E 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa EPWADVTKSY PGSGTTWEDC DKYARCGNFG ELKRLKAKYP HLKTIISVGG WTWSNRFSDM ABQ65137.2 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa AADEKTRKVF AESTVAFLRA YGFDGVDLDW ECPGVETIPG GSYRPEDKQN FTLLLQDVRN ABQ65137.2 .Y .S 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa ALNKAGAEDG KQYLLTIASG ASQRYADHTE LKKISQILDW INIMTYDFHG GWEATSNHNA ABQ65137.2 310 320 330 340 350 360 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa ALYKDPNDPA ANTNFYVDGA INVYTNEGVP VDKLVLGVPF YGRGWKSCGK ENNGQYQPCK ABQ65137.2 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa PGSDGKLASK GTWDDYSTGD TGVYDYGDLA ANYVNKNGFV RYWNDTAKVP YLYN ATTGTF ABQ65137.2 430 440 450 460 470 480 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa ISYDDNESMK YKTDYIKTKG LSGAMFWELS GDCRTSPKYS CSGPKLLDTL VKELLGGPIN ABQ65137.2 490 500 510 520 530 540 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa QKDTEPPTNV KNIVVTNKNS NSVQLNWTAS TDNVGVTEYE ITAGEEKWST TTNSITIKNL ABQ65137.2 550 560 570 580 590 600 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa KPNTEYKFSI IAKDAAGNKS QPTALTVKTD EANTTPPDGN GTATFSVTSN WGSGYNFSII ABQ65137.2 610 620 630 640 650 660 | | | | | | | | | | | | MSS1.1_aa IKNNGTNPIK NWKLEFDYSG NLTQVWDSKI SSKTNNHYVI TNAGWDGEIP PGGSITIGGA ABQ65137.2 .N 670 | | | MSS1.1_aa GTGNPAELLN AVISEN ABQ65137.2 Hình So sánh trình tự amino acid protein ChiA t chủng MSS1.1 với trình tự chủng HD73 có mã số ABQ65137.2 ngân hàng liệu Ph l c Trình tự nucleotide gen chiA amino acid Chitinase có nguồn gốc t chủng B thuringiensis var kurstaki MSS1.1 đăng ký Ngân hàng sở liệu GenBank Ph l c3 Bản vector biểu pET28b(+) Ph l c Bản đồ vector biểu pET28b(+) Ph l c Kết chạy kiểm tra mơ hình thuật tốn tối ưu Bảng Kết theo mơ hình Số TT Lactose (mM) Thời gian (giờ) Mật ộ TB (OD 600 nm ) Hoạt ộ (U/ml) 6,00 9,00 0,80 7,36 7,00 6,00 1,00 5,14 5,00 6,00 0,60 1,99 7,00 12,00 1,00 4,88 7,00 6,00 0,60 5,59 5,00 12,00 1,00 3,17 5,00 12,00 0,60 1,14 5,00 6,00 1,00 4,02 7,00 12,00 0,60 5,34 10 5,81 6,41 0,75 6,39 11 6,44 12,00 0,62 5,51 12 6,86 6,07 0,80 6,71 13 5,15 6,08 0,85 4,87 14 6,16 9,61 0,65 6,61 15 6,86 11,82 0,94 5,82 16 6,66 6,57 0,69 6,83 17 5,48 8,14 1,00 5,95 18 5,01 9,34 0,67 3,54 19 5,91 9,20 0,88 7,22 20 5,18 9,90 0,65 3,88 21 5,23 9,04 0,74 5,18 22 6,83 11,37 0,88 6,55 23 6,45 7,30 0,75 7,39 24 5,37 10,94 0,71 4,76 25 5,36 6,67 0,88 5,78 26 6,67 7,71 0,70 7,26 27 5,44 11,29 0,91 5,41 28 5,62 11,44 0,66 4,70 29 6,30 6,47 0,87 7,09 30 5,16 8,71 0,83 5,43 31 5,66 7,47 0,95 6,50 32 5,11 9,05 0,93 5,23 33 6,63 6,72 0,92 6,85 34 6,93 10,69 0,63 6,40 35 6,19 9,78 0,93 7,17 36 5,24 9,08 0,92 5,66 37 6,69 6,37 0,94 6,43 38 5,55 6,97 0,88 6,37 39 6,71 9,91 0,66 6,97 40 5,23 10,18 0,82 5,30 41 5,29 7,33 0,91 5,77 42 6,71 10,08 1,00 6,31 43 5,63 11,97 0,99 5,00 44 5,32 6,35 0,79 5,38 45 5,99 9,16 0,95 6,98 46 5,11 6,47 0,74 4,35 47 5,05 11,99 0,63 1,88 48 5,66 10,33 0,60 4,76 49 5,35 11,78 0,84 4,85 50 6,76 9,12 0,91 7,18 51 5,45 11,45 0,69 4,56 52 6,85 6,53 0,72 6,85 53 5,24 11,01 0,73 4,41 54 6,44 6,41 0,89 6,98 55 5,76 11,97 0,94 5,52 56 5,68 8,76 0,93 6,74 57 5,42 9,14 0,98 5,92 58 6,72 9,84 0,78 7,48 59 5,96 7,18 0,92 6,98 60 5,57 6,75 0,98 5,96 61 6,58 9,43 0,65 6,94 62 5,40 8,45 0,65 4,95 63 5,16 9,09 0,73 4,78 64 6,85 11,59 0,89 6,35 65 6,93 7,01 0,98 6,07 66 5,35 7,86 0,76 5,73 67 5,09 11,01 0,95 4,40 68 5,57 7,12 0,89 6,46 69 6,35 9,81 0,92 7,24 70 5,91 11,89 0,96 5,66 71 5,84 9,95 0,86 6,97 72 6,09 10,02 0,80 7,27 73 6,71 7,07 0,64 6,69 74 6,90 8,52 0,64 6,91 75 6,83 7,98 0,70 7,26 76 6,63 11,03 0,70 6,79 77 6,42 10,72 0,70 6,90 78 6,04 8,02 0,99 6,72 79 5,85 8,14 0,89 7,13 80 5,60 6,81 0,91 6,34 81 6,75 6,60 0,79 7,10 82 5,95 7,94 0,76 7,16 83 5,20 8,77 0,80 5,47 84 6,88 6,13 0,97 5,83 85 6,15 8,12 0,87 7,49 86 6,53 11,38 0,99 6,01 87 5,60 6,52 0,96 6,03 88 6,19 9,37 0,91 7,35 89 5,82 6,64 0,93 6,59 90 5,74 7,12 0,65 5,70 10 91 6,61 11,14 0,97 6,20 92 5,86 7,31 0,80 7,00 93 5,18 10,59 0,77 4,73 94 5,62 6,77 0,93 6,29 95 6,06 8,56 0,66 6,68 96 6,35 11,00 0,83 7,08 97 5,81 10,06 0,70 6,28 98 5,15 11,34 0,74 3,96 99 5,78 10,02 0,89 6,80 100 6,46 6,71 0,66 6,68 Bảng Các phương án lựa chọn nằm vùng tối ưu Số TT Lactose (mM) Thời gian (giờ) Mật ộ TB (OD600 nm ) Hoạt ộ (U/ml) 6,00 9,00 0,80 7,36 19 5,91 9,20 0,88 7,22 23 6,45 7,30 0,75 7,39 26 6,67 7,71 0,70 7,26 29 6,30 6,47 0,87 7,09 35 6,19 9,78 0,93 7,17 50 6,76 9,12 0,91 7,18 58 6,72 9,84 0,78 7,48 69 6,35 9,81 0,92 7,24 72 6,09 10,02 0,80 7,27 75 6,83 7,98 0,70 7,26 79 5,85 8,14 0,89 7,13 81 6,75 6,60 0,79 7,10 82 5,95 7,94 0,76 7,16 85 6,15 8,12 0,87 7,49 88 6,19 9,37 0,91 7,35 92 5,86 7,31 0,80 7,00 96 6,35 11,00 0,83 7,08 11 Ph l c 5: Kết thử nghiệm enzyme tái tổ hợp Bảng T lệ sâu tơ chết (%) sau khoảng thời gian thử nghiệm khác Mẫu thí nghiệm Thời gian th nghiệm (giờ) 24 36 48 60 72 SP10.6 26,67 63,33 82,22 93,33 100 rChiA 0 3,33 6,67 7,78 8,89 51,11 81,10 100 - - SP10.6 rChiA + Bảng T lệ sâu khoang chết (%) sau khoảng thời gian thử nghiệm khác Mẫu thí nghiệm Thời gian th nghiệm (giờ) 24 36 48 60 72 SP10.6 27,78 53,33 69,99 78,89 83,33 rChiA 0 3,33 4,44 5,56 6,67 33,33 67,78 84,44 85,56 87,78 SP10.6 rChiA + Chú thích: SP10.6: Protein tinh thể t chủng B thuringiensis SP10.6 rChiA: Enzyme chitinase tái tổ hợp SP10.6 + rChiA: Hỗn hợp protein tinh thể t chủng SP10.6 chitinase tái tổ hợp 12 13 ... tính chất c a endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập Việt Nam” M c tiêu nghiên cứu 2.1 M c tiêu chung Tuyển chọn chủng vi khuẩn B thuringiensis địa có khả sinh chitinase cao biểu chitinase... vật Nội dung nghiên cứu (1) Phân lập nghiên cứu đ c điểm sinh học số chủng vi khuẩn B thuringiensis Việt Nam có khả sinh tổng hợp chitinase cao; (2) Nghiên cứu số điều kiện ảnh hưởng đến khả sinh... tạo endochitinase có hoạt tính cao cơng nghệ gen nhằm góp phần tăng hiệu chế phẩm sinh học cần thiết Xuất phát t lý trên, tiến hành lựa chọn đề tài luận án: ? ?Tách d ng, biểu nghiên cứu tính chất