Kết quả nghiên cứu độc tính cấp và bán trường diễn của bài thuốc thân thống trục ứ thang trên thực nghiệm

Trờng Đại học Y Hà Nội Cộng hoà xà hội chủ nghĩa Việt Nam Bộ môn Dợc lý Độc lập - Tự - Hạnh phúc Kết Nghiên cứu độc tính cấp bán trờng diễn thuốc thân thống trục ứ thang thực nghiệm Nơi tiến hành nghiên cứu: Bộ môn Dợc lý Trờng Đại học Y Hà Nội Thời gian nghiên cứu: 4-6/2010 Cán tham gia nghiên cứu: PGS TS Nguyễn Trọng Thông PGS TS Nguyễn Trần Thị Giáng Hơng PGS TS Vũ Thị Ngọc Thanh Ths Phạm Thị Vân Anh BS Đậu Thùy Dơng KTV Nguyễn Kiều Vân KTV Đinh Quang Trờng KTV Đàm Đình Tranh A kết thử độc tính cấp thuốc thân thống trục ứ thang I Nguyờn liệu, đối tượng phương pháp nghiên cứu 1.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu Bài thuốc “Thân thống trục ứ thang” - Công thức thuốc sau: Tần giao 12g Xuyên khung 8g Đào nhân 12g Hồng hoa 12g Chích cam thảo 4g Khương hoạt 12g Một dược Đương quy 12g Ngũ linh chi 12g Ngưu tất 12g Địa long 6g 6g Hương phụ chế 8g - Tác dụng thuốc: hành khí hoạt huyết, khứ ứ thơng lạc, thơng tý thống - Dạng thuốc sử dụng: thuốc sắc - Nơi sản xuất: Khoa Dược, Bệnh viện YHCT Trung ương Thuốc đợc bn giao ngy 08/02/2010 Liều dùng ngời 116g/ngày Dịch chiết đợc cô cách thủy đến đậm độ đặc cho chuột uống đợc kim đầu tù chuyên dụng Sau cô đặc đợc cao ®Ỉc tû lƯ 1:4 (1 ml cao chøa gam dợc liệu), dùng cao đặc để đánh giá độc tính cấp thuốc thử xác định LD50 *Động vật thực nghiệm: Chuột nhắt trắng chủng Swiss, hai giống, khoẻ mạnh, trọng lợng 18-22g Viện Vệ sinh dịch tễ TW cấp Súc vật đợc nuôi phòng thí nghiệm - ngày trớc nghiên cứu thức ăn chuẩn (do Viện Vệ sinh dịch tễ TW sản xuất), uống nớc tự 1.2 Phơng pháp nghiên cứu: Xác định LD 50 thuốc Thân thống trục ứ chuột nhắt trắng đờng uống theo phơng pháp Litchfield Wilcoxon Trớc tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm Từng lô chuột nhắt trắng, lô 10 con, đợc uống thuốc thử theo liều tăng dần từ 120g dợc liệu/kg đến liều 480g dợc liệu/kg Mỗi chuột uống lần/24 giờ, cách Tìm đợc liều cao chuột không chết liều thấp gây chết 100% số chuột Theo dõi tình trạng chung chuột số lợng chuột chết lô 72 Sau tiếp tục theo dõi tình trạng chung chuột đến hết ngày thứ sau uống thuốc thử lần đầu II Kết nghiên cứu: Sau uống thuốc thử, lô dùng thuốc liều 120g dợc liệu/kg, chuột tợng đặc biệt: ăn uống, vận động bình thờng, chuột không bị khó thở, phân khô lô chuột uống thuốc thử liều cao 120g dợc liệu/kg, chuột giảm vận động, có tợng khó thở, ỉa lỏng cã chuét chÕt vßng 72 giê sau uèng thuốc thử lần đầu Các chuột bị chết xảy 24 sau uống thuốc lần đầu Số lợng chuột chết vòng 72 đợc ghi lại bảng sau Số lợng chuột chết lô chuét LiÒu dïng (g/kg) Sè chuét chÕt /10con 240 300 330 360 390 420 435 450 465 480 10 Tõ kết bảng vẽ đợc đờng biểu diễn mối tơng quan S chut cht (con) liều dùng sè chuét chÕt LD 50- Thân thống trục ứ 12 y = 0.042x - 11.362 R2 = 0.9301 10 -2 200 400 600 Liều dựng (g/kg) Từ tính đợc LD50 = 389,57 21,21 (g/kg) III KÕt ln MÉu cao láng Th©n thèng trơc ứ gửi đến Bộ môn Dợc lý Trờng Đại học Y Hà Nội yêu cầu thử độc tính cấp theo đờng uống, kết cho thấy: - Các chuột uống Thân thống trục ứ liều từ 120g dợc liệu/kg trở xuống biểu độc tính cấp - Các chuột uống Thân thống trục ứ liều từ 120g dợc liệu/kg có biểu ỉa lỏng, ăn uống kém, gây sút, giảm vận động - Xác định đợc LD50 cao lỏng Thân thống trục ứ chuột nhắt trắng theo đờng uống là: LD50 =389,57 21,21 (g/kg) B kết thử độc tính bán trờng diễn thuốc thân thống trục ứ I Đối tợng phơng pháp nghiên cứu: 1.1 Đối tợng nghiên cứu: 1.1.1 Thuốc hoá chất nghiên cứu: * Thuốc nghiªn cøu: Bài thuốc “Thân thống trục ứ thang” - Công thức thuốc sau: Tần giao 12g Xuyên khung 8g Đào nhân 12g Hồng hoa 12g Chích cam thảo 4g Khương hoạt 12g Một dược Đương quy 12g Ngũ linh chi 12g Ngưu tất 12g Địa long 6g 6g Hương phụ chế 8g - Tác dụng thuốc: hành khí hoạt huyết, khứ ứ thơng lạc, thơng tý thống - Dạng thuốc sử dụng: thuốc sắc - Nơi sản xuất: Khoa Dược, Bệnh viện YHCT Trung ương Thuc đợc bn giao ngy 20/5/2010 * Hoá chất máy móc: - Kit định lợng enzym chất chun ho¸ m¸u: ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol creatinin hÃng Hospitex Diagnostics (Italy) hÃng DIALAB GmbH (áo), định lợng m¸y Screen master cđa h·ng Hospitex Diagnostics (Italy) - Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG hÃng ABX Diagnostics, định lợng máy Vet abcTM Animal Blood Counter - Các hoá chất xét nghiệm làm tiêu mô bệnh học 1.1.2 Động vật thực nghiệm: Thỏ chủng Newzealand White, lông trắng, giống, khoẻ mạnh, trọng lợng 1,8 - 2,2kg Trung tâm chăn nuôi Viện Kiểm nghiệm cung cấp Súc vật đợc nuôi phòng thí nghiệm Bộ môn Dợc lý từ ngày trớc nghiên cứu suốt thời gian nghiên cứu thức ăn chuẩn thỏ công ty liên doanh GuyomarchVCN sản xuất, uống nớc tự 1.2 Phơng pháp nghiên cứu: Thỏ đợc chia làm lô, lô 10 con, nhốt riêng chuồng - Lô chứng: uống nớc cất 3ml/kg/ngày - Lô trị 1: uống Thân thng trục liều 7g/kg/ngày (liều có tác dụng tơng đơng liều dùng ngời, tính theo hệ số 3) - Lô trị 2: uống Thân thng trc liều 21g/kg/ngày (gấp lần lô trị 1) Thỏ đợc uống nớc thuốc tuần liền, ngày lần vào buổi sáng Sau tuần uống thuốc, thỏ đợc ngừng uống thuốc Các tiêu theo dõi trớc trình nghiên cứu: - Tình trạng chung, thể trọng thỏ - Đánh giá chức tạo máu thông qua số lợng hồng cầu, hàm lợng hemoglobin, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lợng bạch cầu, công thức bạch cầu số lợng tiểu cầu - Đánh giá chức gan thông qua định lợng số enzym chất chuyển hoá máu: ALT, AST, bilirubin toàn phần, albumin cholesterol - Đánh giá chức thận thông qua định lợng creatinin huyết Các thông số theo dõi đợc kiểm tra vào trớc lúc uống thuốc, sau tuần uống thuốc sau tuần uống thuốc - Mô bệnh học: Sau tuần uống thuốc, thỏ đợc mổ để quan sát đại thể toàn quan KiĨm tra ngÉu nhiªn cÊu tróc vi thĨ gan, thận 30% số thỏ lô Các xét nghiệm vi thể đợc thực Trung tâm nghiên cứu chẩn đoán sớm ung th, PGS TS Lê Đình Roanh đọc kết 1.3 Xử lý số liệu: Các số liệu nghiên cứu đợc xử lý thống kê theo phơng pháp t - test Student test trớc - sau(Avant - Après) Số liệu đợc biểu diễn dới dạng : X SE Sự khác biệt có ý nghĩa p < 0,05 Kết nghiên cứu: 2.1 Tình trạng chung thay đổi thể trọng thỏ: 2.1.1 Tình trạng chung: Trong thời gian thí nghiệm, thỏ lô chứng lô trị hoạt động bình thờng, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mợt, ăn uống tốt, phân khô Không thấy biểu đặc biệt lô thỏ suốt thời gian nghiên cứu Riêng lô trị 2, thỏ ăn uống kém, ỉa lỏng, mệt mỏi, vận động, lông xù 2.1.2 Sự thay đổi thể trọng thỏ: Bảng 2.1 ảnh hởng Thân thng trc đến thể trọng thỏ % tăng Thời gian Lô chứng trọng % tăng uống thuốc Lô trị trọng Lô trị 1trọng lợng Trớc % tăng lợng 1,94 2,01 0,20 0,11  0,32 Sau 18,20 > 0,05 -3,0% tuÇn 2,14 1,94 uèng  0,21  0,11 < 0,05 > 0,05 % (t- test Student) lỵng 1,82 p 1,94 0% < 0,05  0,37 thuèc p (tríc sau) Sau 22,74 > 0,05 1,09 1,96 -2,0% tuÇn 2,22 uèng  0,23  0,13  0,41 < 0,05 > 0,05 > 0,05 % 1,97 % < 0,05 thuèc p (tríc sau) Kết bảng 2.1 cho thấy: sau tuần tuần uống thuốc, trọng lợng thỏ lô chứng tăng lên rõ rệt so với trớc nghiên cứu (p0,05) Lô trị trọng lợng thỏ giảm so với trớc dùng thuốc so với lô chứng 2.2 Đánh giá chức tạo máu: Bảng 2.2 ảnh hởng Thân thng trc đến số lợng hồng cầu máu thỏ Số lợng hồng cầu ( T/l ) Thời gian Lô trị p (t- test Lô chứng Lô trị 4,83 0,27 4,84 0,51 4,75  0,35 > 0,05 4,72  0,24 5,06  0,48 4,68  0,56 > 0,05 p (tríc - sau) > 0,05 > 0,05 > 0,05 Sau tuÇn 4,91  0,47 5,17  0,29 5,13  0,47 Tríc uèng thuèc Sau tuÇn uèng thuèc Student) > 0.05 biƯt cã ý nghÜa thèng kª so víi lô chứng so với trớc uống thuốc (p > 0,05) 2.4 Đánh giá chức thận: Bảng 2.14 ảnh hởng Thân thng trc đến nồng độ creatinin m¸u thá p Creatinin (mg/dl) (t- test Thêi gian Trớc uống thuốc Sau tuần uống thuốc Lô chứng Lô trị Lô trị Student) 1,06 0,07 1,06  0,08 1,09  0,06 > 0,05 1,04  0,05 1,06  0,08 1,08  0,04 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 1,04  0,09 1,05  0,05 1,04  0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 p (tríc - sau) Sau tn ng thc p (tríc - sau) > 0,05 KÕt qu¶ ë b¶ng 2.14 cho thấy: sau tuần tuần uống thuốc liên tục, lô trị (uống Thân thống trục ứ liều 7g/kg/ngày) lô trị (uống Thân thống trục ứ liều 21g/kg/ngày), hàm lợng creatinin máu thỏ thay đổi khác biệt so với lô chứng so với trớc uống thuốc (p > 0,05) 2.5 Thay đổi giải phẫu bệnh: Sau tuần uống thuốc: 2.5.1 Đại thể: Trên tất thỏ thực nghiệm (cả lô chứng lô trị), không quan sát thấy có thay đổi bệnh lý mặt đại thể quan tim, phổi, gan, lách, tuỵ, thận thỏ 2.5.2 Vi thể: - Hình thái vi thể gan: + Lô chứng: tt c mu bnh phm, t bào gan có cấu trúc bình thường (ảnh 1), có hình ảnh xung huyết nhẹ tĩnh mạch trung tâm (ảnh 2) + Lô trị (uống Thân thống trục ø liỊu 7g/kg/ngµy): 2/3 số mẫu bệnh phẩm gan có cấu trúc bình thường 1/3 số mẫu bệnh phẩm có hình ảnh thối hóa nhẹ (ảnh 3, 4, 5) + Lô trị (uống Thân thống trục ứ liều 21g/kg/ngày): Tất c¸c mẫu bệnh phảm, tế bào gan cã cấu tróc b×nh thường (ảnh 6, 7, 8) Ảnh 1: Hình thái vi thể gan thỏ lơ chứng sau tuần uống thuốc Gan b×nh thêng (HE x 200) Ảnh 2: Hình thái vi thể gan thỏ lơ chứng sau tuần uống thuốc Xung huyÕt nhÑ tÜnh mạch trung tâm (HE x 200) nh 3: Hỡnh thỏi vi thể gan thỏ lô trị sau tuần uống thuốc Gan b×nh thêng (HE x 200) Ảnh 4: Hình thái vi thể gan thỏ lơ trị sau tuần uống thuốc Gan b×nh thêng (HE x 200) Ảnh 5: Hình thái vi thể gan thỏ lơ trị sau tuần uống thuốc Gantho¸i hãa nhĐ (HE x 200) Ảnh 6: Hình thái vi thể gan thỏ lô trị sau tuần uống thuốc Gan b×nh thêng (HE x 200) Ảnh 7: Hình thái vi thể gan thỏ lơ trị sau tuần uống thuốc Gan b×nh thêng (HE x 200) 2 Ảnh 8: Hình thái vi thể gan thỏ lơ trị sau tuần uống thuốc Gan b×nh thờng (HE x 200) - Hình thái vi thể thận: + Lô chứng: Thận có cấu trúc bình thờng Các cầu thận biến đổi màng đáy gian mạch cầu thận Các tế bào ống thận tổn thơng (nh 9, 10, 11) + Lô trị (uống Thân thống trục ứ liều 7g/kg/ngày): 2/3 số mẫu thận cã tho¸i hãa nhẹ tế bào ống lượn gần (¶nh 12, 13) 1/3 số mẫu bnh phm thn có cu trúc bình thng (ảnh 14) + Lô trị (uống Thân thống trục ứ liều 21g/kg/ngày): Thận có cấu trúc bình thờng Các cầu thận biến đổi màng đáy gian mạch cầu thận Các tế bào ống thận tổn thơng (ảnh 15, 16, 17) nh 9: Hỡnh thỏi vi thể thận thỏ lô chứng sau tuần uống thuốc ThËn b×nh thêng (HE x 400) Ảnh 10: Hình thái vi thể thận thỏ lơ chứng sau tuần uống thuốc ThËn b×nh thêng (HE x 400) Ảnh 11: Hình thái vi thể thận thỏ lơ chøng sau tuần uống thuốc ThËn b×nh thêng (HE X 400) Ảnh 12: Hình thái vi thể thận thỏ lơ trị sau tuần uống thuốc ThËn tho¸i hãa rÊt nhĐ (HE X 400) Ảnh 13: Hình thái vi thể thận thỏ lô trị sau tuần uống thuốc ThËn tho¸i hãa rÊt nhĐ (HE X 400) Ảnh 14: Hình thái vi thể thận thỏ lơ trị sau tuần uống thuốc ThËn b×nh thêng (HE X 400) Ảnh 15: Hình thái vi thể thận thỏ lô trị sau tuần uống thuốc ThËn b×nh thêng (HE X 400) Ảnh 16: Hình thái vi thể thận thỏ lơ trị sau tuần uống thuốc ThËn b×nh thêng (HE X 400) Ảnh 17: Hình thái vi thể thận thỏ lơ trị sau tuần uống thuốc ThËn b×nh thêng (HE X 400) NhËn xÐt vµ kÕt luËn: Kết nghiên cứu độc tính bán trờng diễn thuốc Thân thng trc thang cho thấy: Trên hai lô thỏ, lô trị uống Thân thng trc liều 7g/kg/ngày lô trị uống Thân thng trc liều cao gấp lần 21g/kg/ngày), liên tục tuần kết cho thấy: Trên tình trạng chung trọng lợng: + Liều thấp 7g/kg/ngày thuốc thử không làm ảnh hởng xấu đến tình trạng chung thỏ nhng không làm tăng trọng lợng thỏ nh lô chứng + Liều cao 21g/kg/ngày thuốc thử làm ảnh hởng xấu đến tình trạng chung, gây ỉa chảy kéo dài, làm giảm trọng lợng thỏ, gây suy kiệt Trên chức tạo máu: liều Thân thng trc không làm thay đổi kết xét nghiệm đánh giá chức tạo máu (số lợng hồng cầu, hàm lợng huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lợng bạch cầu, công thức bạch cầu số lợng tiểu cầu) Trên chức gan, thận: liều Thân thng trc không làm thay đổi kết xét nghiệm đánh giá chức gan (ALT, AST, bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol) chức thận (creatinin) Trên giải phẫu đại thể vi thể gan, thận thỏ: - liều Thân thng trc Không gây tổn thơng rõ rệt mặt hình thái quan sát đại thể quan thỏ - liều Thân thng trc ứ không gây tổn thơng rõ rệt cấu trúc vi thĨ gan, thËn cđa thá KÕt ln MÉu thuốc thử Thân thng trc đợc gửi đến Bộ môn Dợc lý- trờng Đại học Y Hà Nội yêu cầu thử độc tính bán trờng diễn thỏ theo ®êng ng, kÕt qu¶ cho thÊy: - MÉu thc thư Thân thng trc không gây độc tính bán trờng diễn thỏ cho thỏ uống liều 7g/kg/ngày (liều có tác dụng tơng đơng liều dùng ngời) tuần liên tục: Tất số theo dõi tình trạng chung, cân nặng, chức tạo máu, chức gan, chức thận mô bệnh học gan, thận nằm giới hạn bình thờng, khác biệt rõ rệt so với lô chøng - MÉu thc thư Th©n thống trục ứ g©y độc tính bán trờng diễn thỏ cho thỏ uống liều 21g/kg/ngày (liều gấp lần liều lâm sàng) tuần liên tục: ảnh hửong xấu đến tình trạng chung làm giảm trọng lợng thỏ, gây ỉa cháy kéo dài suy kiệt Vì không đợc tăng liều dùng liều cao lâm sàng cho bệnh nhân Trờng Đại học Y Hà Nội xác nhận Hà Nội, ngày 20 tháng chữ ký bên PGS.TS Nguyễn năm 2010 Trọng Thông, Trởng Bộ môn Dợc lý Trởng Bộ môn Dợc lý PGS.TS Nguyễn Träng Th«ng 3 ... kết thử độc tính cấp thc th©n thèng trơc ø thang I Ngun liệu, đối tượng phương pháp nghiên cứu 1.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu Bài thuốc ? ?Thân thống trục ứ thang? ??... phơng pháp nghiên cứu: 1.1 Đối tợng nghiên cứu: 1.1.1 Thuốc hoá chất nghiên cứu: * Thuốc nghiên cứu: Bài thuốc ? ?Thân thống trục ứ thang? ?? - Công thức thuốc sau: Tần giao 12g Xuyên khung 8g Đào... lỏng Thân thống trục ứ chuột nhắt trắng theo đờng uống là: LD50 =389,57 21,21 (g/kg) B kết thử độc tính bán trờng diễn thuốc thân thống trục ứ I Đối tợng phơng pháp nghiên cứu: 1.1 Đối tợng nghiên