Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ChÊt lîng ATVSTP cã liªn quan trùc tiÕp hµng ngµy, thêng xuyªn, liªn tôc ®Õn søc kháe con ngêi, ¶nh hëng l©u dµi ®Õn nßi gièng d©n téc Sö dông thùc phÈm kh«ng ®¶m b¶o chÊt lîng[.]
1 T VN Chất lợng ATVSTP có liên quan trực tiếp hàng ngày, thờng xuyên, liên tục đến sức khỏe ngời, ảnh hởng lâu dài đến nòi giống dân tộc Sử dụng thực phẩm không đảm bảo chất lợng, vệ sinh dẫn đến ngộ độc cấp tính, ngộ độc mạn tính, bệnh truyền qua thực phẩm Chất độc tính lũy thể gây ảnh hởng đến sức khỏe lâu dài, giảm khả lao động, gây bệnh mạn tính, rối loạn chuyển hóa gây ung th Không thế, ảnh hởng đến phát triển kinh tế, xà hội, an ninh trị quan hệ quốc tế [13] Theo thống kê Trung tâm kiểm soát phòng ngừa bệnh tật Mỹ hàng năm giới có khoảng 1,3 tỷ ngời tiêu chảy có 70% nguyên nhân sử dụng thực phẩm không an toàn [26] Tại nớc phát triển, năm có khoảng 1/3 dân số bị bệnh thực phẩm gây ra, bệnh tiêu chảy thờng gặp gây tử vong khoảng 2,2 triệu ngời [22] Ở Việt Nam ngộ độc thực phẩm vấn đề quan tâm hàng đầu, theo ước tính Y tế, riêng năm 2001 có 4,2 triệu người bị ngộ độc thực phẩm Từ năm 2001-2006, nước ghi nhận 5600000 ca tiêu chảy ngộ độc thực phẩm, có 84 ca tử vong Riêng tháng đầu năm ngoái ghi nhận 750.000 ca tiêu chảy có 12 ca tử vong Thực tế theo chuyên gia phải gấp 10 lần số công bố [10].[20] Các bệnh liên quan đến thực phẩm mối nguy tác động đến sức khoẻ người giới (Wood CS 1983) Trong đó, vi khuẩn E.coli sinh độc tố (ETEC) nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy quan trọng cho trẻ em quốc gia phát triển cho khách du lịch đến vùng có dịch lưu hành Thực phẩm nước bị ô nhiễm phương tiện lây truyền chủ yếu loại vi khuẩn Các mẫu xét nghiệm thực phẩm nước thường có tỷ lệ nhiễm cao với ETEC vùng có dịch lưu hành (Black CS, 1981,1982; Ryder CS, 1976) Nhiễm trùng ETEC thường xảy vào mùa nóng, ẩm ướt điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển thực phẩm nước ETEC có khả sinh độc tố chịu nhiệt ST độc tố không chịu nhiệt LT Độc tố không chịu nhiêt có cấu trúc chức độc tố tả (cholerae toxin) Vì người bị nhiễm độc tố bị tiêu chảy cấp tính với mức độ nước trầm trọng Trên giới nhiều nhà khoa học nhiên cứu sản xuất thành công protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B độc tố LT ETEC sử dụng protein tái tổ hợp để thiết kế sinh phẩm chẩn đoán ETEC gây bệnh kỹ thuật ELSA latex thu kết tốt (Cryan B,1990; Oto CS,1983) Nguyên lý kỹ thuật sử dụng protein tái tổ hợp tiểu đơn vị B độc tố LT gây miễn dịch tạo kháng thể kháng LT sau sử dụng kháng thể để phát độc tố LT ETEC Tuy nhiên giá thành sản phẩm cao chưa đáp ứng với điều kiện kinh tế nước ta Ở Việt Nam, chi phí điều trị cho bệnh liên quan đến thực phẩm nguyên vi khuẩn gây nên đắt Tuy nhiên chưa có thống kê rõ ràng nguyên gây vụ ngộ độc thực phẩm nên khó phịng chống Với điều kiện khí hậu nóng ẩm Việt Nam thiếu hiểu biết vệ sinh an toàn thực phẩm người dân nên ngộ độc thực phẩm E Coli sinh độc tố (ETEC) chiếm tỷ lệ không nhỏ Phương pháp nuôi cấy phát ETEC thực phẩm mà phải phát có mặt độc tố ETEC thực phẩm kỹ thuật ELISA hay latex nhằm phát gen mã hóa độc tố chủng ETEC thực phẩm Cho đến có nghiên cứu Việt Nam tác giả Nguyễn Thị Thanh Yến CS năn 2005 viện dinh dưỡng ứng dụng kỹ thuật ELISA để phát khả sinh độc tố LT ETEC mẫu thực phẩm Tuy nhiên kỹ thuật giá thành cịn cao phức tạp khó áp dụng cho phong xét nghiệm thực phẩm tuyến tỉnh Xuất phát từ thực tiễn chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế biểu protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT ETEC sản xuất kháng thể đa dịng kháng LT quy mơ phịng thí nghiệm” Đây bước quan trọng cho nghiên cứu nhằm mục đích sản xuất sinh phẩm chẩn đốn độc tố không chịu nhiệt (LT) ETEC số nhóm thực phẩm Mục tiêu nghiên cứu: Thiết kế vector biểu gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp EltB biến nạp vào tế bào khả biến DH5α Biểu tinh Protein EltB tế bào vi khuẩn E.coli BL21 Sản xuất kháng thể kháng LT thỏ quy mơ phịng thí nghiệm Chương TỔNG QUAN 1.1.Tình hình vệ sinh an tồn thực phẩm 1.1.1.Trên giới Theo thống kê Trung tâm kiểm soát phòng ngừa bệnh tật Mỹ hàng năm giới có khoảng 1,3 tỷ ngời tiêu chảy có 70% nguyên nhân sử dụng thực phẩm không an toàn [26] Tại nớc phát triển, năm có khoảng 1/3 dân số bị bệnh thực phẩm gây ra, bệnh tiêu chảy thờng gặp gây tử vong khoảng 2,2 triệu ngời [22] Tại Úc, ngày có khoảng 11.500 người bị ngộ độc thực phẩm Ở Mỹ hàng năm ước đoán có khoảng đến triệu người bị mắc bệnh nguyên nhân ăn uống 9000 trường hợp tử vong [12].[48] Một nghiên cứu khác bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm VSV gây bệnh New-York Mỹ, phát có gia tăng gấp lần từ 1980 đến 1990 [6] Ở Trung Quốc năm 1998 có 292.000 người bị ngộ độc thực phẩm virus viêm gan A làm tử vong người Năm 1999 xảy 591 vụ ngộ độc thực phẩm với 17.971 người mắc, chết 108 người Nguyên nhân thực phẩm bị ô nhiễm VSV 8.505 trường hợp, hóa chất 9.506 trường hợp, thực vật hặc động vật có chất độc 2.719 trường hợp Phần lớn trường hợp ngộ độc xảy căng tin 7.529 trường hợp[2] Một thống kê 10 năm xác định yếu tố nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm Trung Quốc cho thấy 93,24 % nguyên nhân vi sinh vật, có 6,76% yếu tố hóa học [23] Ngộ độc thực phẩm VSV ngày gia tăng quốc gia phát triển quốc gia phát triển, đăc biệt E.coli Ở Nhật Bản năm 1996 có khoảng 800 người bị nhễm bệnh Enterohaemorrhagie E.coli [3] 1.1.2 Vit Nam Tình trạng ô nhiễm thực phẩm diễn phổ biến nớc, chủ yếu ô nhiễm mầm bệnh sinh học hóa chất [10] Tại Hà Nội, tỷ lệ thức ăn đờng phố ô nhiễm vi khuẩn cao (46,7%) [10] Điều tra thành phố Hồ Chí Minh cho thấy, 100% mẫu thực phẩm đợc kiểm tra: bánh mì, thịt nguội, thịt quay da muối không đảm bảo vệ sinh thực phẩm mặt vi sinh [3] Tại Hải Phòng có 76,4% thực phẩm không đạt tiêu chuẩn vệ sinh, tỷ lệ không đạt vệ sinh thức ăn đờng phố 92,9% Có tới 85% mẫu thực phẩm ăn chợ không đạt tiêu chuẩn vi sinh, với số lợng vi khn cã thùc phÈm vỵt møc cho phÐp nhiỊu lần, kể vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm [20] Không thành phố lớn, tình trạng nhiễm vi sinh vật gây bệnh thực phẩm diễn phổ biến nhiều địa phơng khác nớc [10] Cùng với tình trạng ô nhiễm thực phẩm, ngộ độc thực phẩm Việt Nam xảy thờng xuyên Theo thống kê cha đầy đủ Cục ATVSTP, từ năm 2000 đến năm 2007, trung bình năm có khoảng 181 vụ ngộ độc thực phẩm xảy với khoảng 5.211 ngời mắc khoảng 48 ca tử vong Tỷ lệ mắc ngộ độc thực phẩm trung bình 6,05/100.000 dân, tỷ lệ chết 0,06/100.000 dân/năm Tuy nhiên, thực tế, cha có hệ thống giám sát đến sở, việc thống kê báo cáo cha đợc thiết lập nên số ca ngộ độc thực phẩm thực tế hàng năm cao nhiều Theo ớc tính WHO, ngộ độc thực phẩm hàng năm Việt Nam khoảng triệu ca Ngoài tình trạng ngộ độc thực phẩm cấp tính, ngộ độc thực phẩm mạn tính diễn phức tạp Ngộ độc thực phẩm mạn tính thờng đợc biểu lâm sàng thờng không dội nh ngộ độc cấp tính Tuy nhiên, hậu ngộ độc thực phẩm mạn tính nguy hiểm nhiều, dẫn đến hƯ lơy cho søc kháe céng ®ång Riêng q IV năm 2010, nước xảy 18 vụ ngộ độc làm người tử vong, có vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên Số người bị ngộ độc 323 người với 242 người nhập viện Nguyên nhân vi sinh (gồm nhóm vi khuẩn Salmonella, Streptoccocus, E.Coli Staphylococcus); độc tố tự nhiên hóa chất Có 5/18 vụ ngộ độc không xác định nguyên nhân không lấy mẫu thực phẩm lưu sở Mới nhất, ngày 30/12, có 461 cơng nhân thuộc công ty địa bàn quận 12 huyện Hóc Mơn, TP.HCM phải nhập viện cấp cứu ngộ độc thực phẩm (Dinh dưỡng com.vn) 1.2.Ngộ độc thực phẩm E.coli 1.2.1 Vài nét E.coli E.coli Eschirich phân lập từ phân người năm 1885 E.coli ký sinh bình thường đại tràng người số động vật Sau trẻ đời khoảng 3h, người ta thấy E.coli đại tràng từ sống suốt đời với thể vật chủ E.coli góp phần tiêu hóa thức ăn, phân giải muối mật, sản xuất số sinh tố, giữ thăng vi khuẩn chí ruột Trong số vi khuẩn hiếu khí đại tràng, E.coli chiếm 80% Một số hình ảnh E.coli Hình Hình ảnh E.coli kính hiển vi điện tử Hình 2: khuẩn lạc E.coli môi trường thạch Endo 1.2.2 Phân loại Có nhiều cách phân chia lồi E.coli cách phân loại theo type huyết hay dùng Cách phân loại dựa cấu trúc kháng nguyên khác có bề mặt tế bào vi khuẩn - Kháng nguyên O định kháng nguyên quan trọng Bản chất lipopolisaccharide nằm vách tế bào vi khuẩn Có 171 loại kháng nguyên O xác định, số số chúng có phản ứng chéo với vi khuẩn khác [34].[44] - Kháng nguyên K kháng nguyên bề mặt Kháng nguyên K nằm bên kháng nguyên O Người ta xác định khoảng 80 loại kháng nguyên K khác [14].[34] - Kháng nguyên H kháng ngun lơng có chất hóa học protein Có 56 loại kháng ngun lơng khác [14].[34] Dựa kháng nguyên O, K H người ta phân biệt 700 type huyết khác E.coli Phân loại dựa vào ly giải phage đặc hiệu có khoảng 50 type phage Phân loại dựa vào tính chất gây bệnh chia làm loại [21] - EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột - EHEC ( Enterohemorrhagic E.coli): E.coli gây chảy máu đường ruột - ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột - EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập đường ruột - EAEC Enteroadherent E.coli) E.coli bám dính đường ruột 1.2.3 Đặc điểm sinh học 1.2.3.1 Hình thái học - E.coli trực khuẩn kích thước trung bình 1-3µx 0,5µm, đứng riêng rẽ thành đôi Trong điều kiện khơng thích hợp (ví dụ: mơi trường có kháng sinh), vi khuẩn dài sợi - Bắt mầu Gram (-) - Di động hệ thống lông xung quanh thân không di động - Có thể có vỏ 1.2.3.2 Tính chất ni cấy - Là loại hiếu khí hay hiếu kỵ khí tùy tiện - Nhiệt độ thích hợp 37 oC mọc 40 oC, sống nhiệt đô 5-40o C - pH 7,4 - E.coli phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường, số phát triển mơi trường tổng hợp nghèo chất dinh dưỡng - Ở điều kiện thích hợp, E.coli phát triển nhanh, thời gian phân chia thành hệ khoảng 20 đến 30 phút - Trong môi trường lỏng (như canh thang) sau 3-4h E.coli làm đục nhẹ môi trường, sau 24h làm đục Những ngày sau, đáy ống có cặn - Trên mơi trường đặc sau khoảng 8-10h, dùng kính lúp thấy khuẩn lạc Sau 24h đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5mm, hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S: trịn, lồi, ướt, màu xám, bề mặt sáng bóng, bờ đều, gặp dạng M dạng R - Trên mơi trường thạch dinh dưỡng NA tạo khóm trịn ướt (dạng S) màu trắng đục Để lâu khóm trở nên khơ nhăn (dạng R) Kích thước khóm 23mm - Trên thạch máu: Có chủng dung huyết β, có chủng khơng dung huyết α - Trên mơi trường chẩn đốn chun biệt EMB (Eozin Methyl Blue) tạo khóm tím ánh kim - Trên môi trường Rapid’ E.coli tạo khuẩn lạc màu tím - Trên mơi trường Macconkey, Endo, SS tạo khóm hồng đỏ - Trên mơi trường đường: Lên men sinh lactose, glucose, galactose Lên men không saccarose không lên men dextrin, glycogen ... tỉnh Xuất phát từ thực tiễn chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: ? ?Thiết kế biểu protein tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT ETEC sản xuất kháng thể đa dòng kháng LT quy mơ phịng thí nghiệm”... kDa bao gồm 28 kDa tiểu đơn vị A 11,5 kDa tiểu đơn vi B (LTB) Khả b? ?m dính tiểu đơn vị B vào thụ thể GM1 niêm mạc ruột non cho phép độc tố xâm nhập vào b? ?n tế b? ?o niêm mạc ruột Tiểu đơn vị A... cho kháng nguyên tái tổ hợp EltB biến nạp vào tế b? ?o khả biến DH5α Biểu tinh Protein EltB tế b? ?o vi khuẩn E.coli BL21 Sản xuất kháng thể kháng LT thỏ quy mơ phịng thí nghiệm Chương TỔNG QUAN 1.1.Tình