Tài Liệu Nghiên Cứu Tác Dụng Kháng U Thực Nghiệm Của Rễ Củ Tam Thất.pdf

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÙI THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG U THỰC NGHIỆM CỦA RỄ CỦ TAM THẤT (PANAX NOTOGINSENG (BURK ) F H CHEN, ARALIACEAE) TRỒNG Ở VIỆT NAM TRƯỚC VÀ SAU C[.]

tai lieu, luan van1 of 98 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÙI THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG U THỰC NGHIỆM CỦA RỄ CỦ TAM THẤT (PANAX NOTOGINSENG (BURK.) F.H CHEN, ARALIACEAE) TRỒNG Ở VIỆT NAM TRƯỚC VÀ SAU CHẾ BIẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2022 document, khoa luan1 of 98 tai lieu, luan van2 of 98 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU BÙI THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG U THỰC NGHIỆM CỦA RỄ CỦ TAM THẤT (PANAX NOTOGINSENG (BURK.) F.H CHEN, ARALIACEAE) TRỒNG Ở VIỆT NAM TRƯỚC VÀ SAU CHẾ BIẾN LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LÝ – DƯỢC LÂM SÀNG MÃ SỐ: 972.02.05 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Vũ Mạnh Hùng GS TS Nguyễn Thanh Hải HÀ NỘI, NĂM 2022 document, khoa luan2 of 98 tai lieu, luan van3 of 98 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận án “Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm rễ củ Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen, Araliaceae) trồng Việt Nam trước sau chế biến” cơng trình nghiên cứu tơi với hướng dẫn khoa học tập thể thầy hướng dẫn Các số liệu, kết nêu luận án trung thực công bố báo khoa học nhóm nghiên cứu Luận án chưa công bố, không trùng lặp với luận văn, luận án cơng trình nghiên cứu khoa học tác giả khác Nếu có điều sai tơi hồn tồn chịu trách nhiệm Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2022 Tác giả Bùi Thị Thu Hà document, khoa luan3 of 98 tai lieu, luan van4 of 98 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực Luận án này, nhận nhiều giúp đỡ, động viên từ thầy cô giáo, đồng nghiệp, gia đình bạn bè Lời đầu tiên, xin trân trọng gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy hướng dẫn PGS TS Vũ Mạnh Hùng - nguyên Chủ nhiệm Bộ môn Dược lý, Học viện Quân y GS TS Nguyễn Thanh Hải - Phó Hiệu trưởng trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, hết lòng hướng dẫn, bảo, định hướng, giúp đỡ từ ngày trình học tập, nghiên cứu thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn cán bộ, nhân viên Khoa phân tích-tiêu chuẩn, Viện Dược liệu; cán bộ, kỹ thuật viên Bộ môn Dược lý - Học viện Quân y, hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho q trình học tập, cơng tác Tơi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Dược liệu, Thủ trưởng Bệnh viện 19-8 Bệnh viện Y học Cổ truyền - Bộ Công an tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập thực luận án Từ đáy lịng mình, xin cảm ơn gia đình, cảm ơn chồng, con, bố mẹ hai bên tồn thể gia đình ln tin tưởng, động viên, chia sẻ, ủng hộ giúp đỡ lúc, nơi Xin cảm ơn tất người thân, bạn bè, đồng nghiệp ủng hộ, giúp đỡ tơi q trình thực luận án Xin trân trọng cảm ơn! Bùi Thị Thu Hà document, khoa luan4 of 98 tai lieu, luan van5 of 98 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH UNG THƯ 1.1.1 Tình hình ung thư giới Việt Nam 1.1.2 Ung thư với đáp ứng miễn dịch 1.2 TỔNG QUAN VỀ TAM THẤT 11 1.2.1 Tổng quan thực vật 11 1.2.2 Hóa thực vật rễ củ Tam thất 14 1.2.3 Các tác dụng dược lý Tam thất 16 1.2.3.1 Tác dụng chống ung thư 16 1.2.3.2.Tác dụng tăng cường miễn dịch 18 1.2.3.3 Tác dụng chống oxy hóa bảo vệ tế bào gan 19 1.2.3.4 Các tác dụng khác 21 1.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG U 22 1.3.1 Các mơ hình nghiên cứu in vitro 22 1.3.2 Các mơ hình nghiên cứu in vivo 26 CHƯƠNG 31 CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1 CHẤT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 31 2.1.1 Chất liệu nghiên cứu 31 document, khoa luan5 of 98 tai lieu, luan van6 of 98 2.1.2.Đối tượng nghiên cứu 35 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất sử dụngtrong nghiên cứu 35 2.1.3.1 Thiết bị, dụng cụ sử dụng nghiên cứu 35 2.1.3.2 Hóa chất sử dụng nghiên cứu 37 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp chế biến hấp nhiệt đến hàm lượng saponin rễ củ Tam thất 39 2.2.1.1 Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc saponin có trongcác mẫu Tam thất hấp khơng hấp 39 2.2.1.2 Nghiên cứu biến đổi hàm lượng hoạt chất Tam thất trước sau hấp điều kiện khác phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 40 2.2.1.3 Định lượng hàm lượng saponin mẫu cao NP(O) NP(H) HPLC 42 2.2.2 Nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm dạng cao định lượng số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất 42 2.2.2.1 Đánh giá tác dụng kháng u saponin phân lập cao định lượng NP(O), NP(H) số dòng tế bào ung thư người 42 2.2.2.2 Đánh giá khả gây độc tế bào khả kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) cao định lượng NP(H) dịng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180 44 2.2.2.3 Nghiên cứu tác dụng ức chế phát triển u cao định lượng NP(H) NP(O) chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180 48 2.2.2.4 Đánh giá tác dụng cao định lượng NP(H) NP(O) lên hệ miễn dịch chuột mang khối u rắn sarcoma TG180 50 document, khoa luan6 of 98 tai lieu, luan van7 of 98 2.2.2.5 Đánh giá tác dụng chống oxy hoá cao định lượng NP(H) NP(O) chuột mang khối u rắn sarcoma TG180 52 2.2.2.6 Xác định thời gian sống thêm chuột mang khối u rắn sarcoma TG180.53 2.2.3 Đánh giá độc tính cấp, độc tính bán trường diễn cao định lượng NP(H)…………………………………………………………………………… 54 2.2.3.1 Đánh giá độc tính cấp cao định lượng NP(H) chuột nhắt trắng 54 2.2.3.2 Đánh giá độc tính bán trường diễn cao định lượng NP(H) chuột cống trắng 55 2.3 XỬ LÝ SỐ LIỆU 56 2.4 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 56 CHƯƠNG 59 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 59 3.1 Kết nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp chế biến đến hàm lượng saponin rễ củ Tam thất 59 3.1.1 Kết chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc saponin có mẫu Tam thất hấp không hấp 59 3.1.1.1 Phân lập saponin từ rễ củ Tam thất (dược liệu không xử lý hấp) 59 3.1.1.2 Phân lập saponin rễ Tam thất sau hấp nhiệt độ cao 61 3.1.1.3 Đặc trưng vật lý liệu phổ hợp chất phân lập 64 3.1.1.4 Biện giải cấu trúc hợp chất phân lập từ rễ củ Tam thất 72 3.1.2 Kết nghiên cứu biến đổi hàm lượng hoạt chất Tam thất hấp điều kiện khác phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) …………………………………………………………………………… 78 3.1.2.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký 78 3.1.2.2 Xây dựng đường chuẩn 79 document, khoa luan7 of 98 tai lieu, luan van8 of 98 3.1.2.3 Kết định lượng saponin từ Tam thất hấp điều kiện khác 82 3.1.3 Hiệu suất chiết cao kết định lượnghàm lượng saponin mẫu cao định lượng NP(O) NP(H) HPLC 86 3.1.3.1 Hiệu suất chiết cao từ mẫu dược liệu 86 3.1.3.2 Định lượng mẫu cao chiết 87 3.2 Kết nghiên cứu tác dụng kháng u thực nghiệm dạng cao định lượng số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất 88 3.2.1 Kết đánh giá tác dụng kháng u saponin phân lập cao định lượng NP(O), NP(H) số dòng tế bào ung thư người 88 3.2.2 Kết đánh giá khả gây độc tế bào khả kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) cao định lượng NP(H) dịng tế bào ung thư mơ liên kết chuột sarcoma TG180 91 3.2.2.1 Kết đánh giá khả gây độc tế bào cao định lượng NP(H) 91 3.2.2.2 Kết đánh giá khả kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) cao định lượng NP(H) dịng tế bào ung thư mô liên kết chuột sarcoma TG180 94 3.2.3 Kết nghiên cứu tác dụng kháng u cao định lượng NP(H) NP(O) chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180 97 3.2.3.1 Kết tạo mơ hình khối u sarcoma TG 180 chuột 97 3.2.3.2 Ảnh hưởng cao định lượng NP(H) NP(O) đến trọng lượng thể chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180 98 3.2.3.3 Ảnh hưởng cao định lượng NP(H) NP(O) đến phát triển khối u rắn sarcoma TG 180 99 3.2.4 Kết đánh giá tác dụng cao định lượng NP(H) NP(O) lên miễn dịch chuột mang khối u rắn Sarcoma TG180 103 document, khoa luan8 of 98 tai lieu, luan van9 of 98 3.2.4.1 Kết đánh giá số lượng công thức bạch cầu máu chuột 103 3.2.4.2 Kết đánh giá nồng độ IL-2 TNF-α máu 104 3.2.4.3 Kết đánh giá số tiêu huyết học 105 3.2.4.4 Kết đánh giá cân nặng lách tuyến ức 107 3.2.5 Kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa củacao định lượngNP(H) NP(O)trên chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180 108 3.2.5.1 Hàm lượng MDA, GSH, SOD CAT gan chuột mang khối u rắn sarcoma TG180 108 3.2.5.2 Hoạt độ enzym ALT, AST máu chuột mang khối u rắn sarcoma TG180 110 3.2.5.3 Ảnh hưởng cao định lượng NP(H) NP(O) hình thái đại thể vi thể gan chuột chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180 111 3.3.6 Kết đánh giá tác dụng kéo dài thời gian sống thêm cao định lượng NP(H) NP(O) chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180 113 3.4 Kết đánh giá độc tính cao định lượng NP(H) 116 3.4.1 Kết xác định độc tính cấp (LD50) NP(H) 116 3.4.2 Kết đánh giá độc tính bán trường diễn NP(H) 117 CHƯƠNG 126 BÀN LUẬN 126 4.1 Về ảnh hưởng phương pháp chế biến hấp nhiệt đến hàm lượng saponin rễ củ Tam thất 128 4.1.1 Hàm lượng saponin Tam thất chưa hấp 128 4.1.2 Hàm lượng saponin Tam thất sau hấp 129 4.1.3 Ảnh hưởng điều kiện hấp nhiệt đến hàm lượng saponin rễ củ Tam thất 130 document, khoa luan9 of 98 tai lieu, luan van10 of 98 4.2 Về tác dụng kháng u thực nghiệm dạng cao định lượng số saponin phân lập từ rễ củ Tam thất 132 4.2.1 Về tác dụng kháng u saponin phân lập cao định lượng NP(O), NP(H) số dòng tế bào ung thư người 132 4.2.2 Về kết đánh giá khả kích thích chết tế bào theo chương trình (apoptosis) cao định lượng NP(H) dịng tế bào ung thư mơ liên kết chuột sarcoma TG180 134 4.2.3 Về kết nghiên cứu tác dụng kháng u cao định lượng NP(H) NP(O) chuột nhắt trắng mang khối u rắn sarcoma TG 180 136 4.2.3.1 Về mơ hình nghiên cứu 136 4.2.3.2 Về liều dùng cao định lượng NP(H) NP(O) 138 4.2.4 Về tác dụng cao định lượng NP(H) NP(O) lên miễn dịch chuột mang khối u rắn Sarcoma TG180 141 4.2.5 Về kết đánh giá tác dụng chống oxy hóa chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180 145 4.2.6 Về tác dụng kéo dài thời gian sống thêm chuột mang khối u rắn sarcoma TG 180 147 4.3 Về kết đánh giá độc tính cao định lượng NP(H) 153 4.3.1 Về độc tính cấp cao định lượng NP(H) 153 4.3.2 Về độc tính bán trường diễn cao định lượng NP(H) 154 KẾT LUẬN 159 KIẾN NGHỊ 161 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC document, khoa luan10 of 98 tai lieu, luan van202 of 98 172 Gu CZ, Qiao YJ, Wang D, Zhu HT, Yang CR, Xu M, Zhang YJ (2018), “New triterpenoid saponins from the steaming treated roots of Panax notoginseng”, Nat Prod Res, 32(3), pp 294-301 173 He F, Ding Y, Liang C, Song S B, Dou DQ Song GY, Kim YH (2014), “Antitumor effects of dammarane-type saponins from steamed Notoginseng”, Pharmacogn Mag, 10(39), pp 314-317 174 XuC, LiuT, LiuH, ChenG, GuoY (2019), “Panax notoginseng saponins radiosensitize colorectal cancer cells by regulating the SNHG6/miR-137 axis”, RSC Adv, 9(6), pp 38558-38567 175 Zhang C, Tong X, Qi B, Yu X, Dong S, Zhang S, Li X, Yu M (2013), “Components of Panax notoginseng saponins enhance the cytotoxicity of cisplatin via their effects on gap junctions”, Mol Med Rep, 8(3), pp.897-902 176 Wang CZ, Xie JT, Zhang B, et al (2007), “Chemopreventive effects of Panax notoginseng and its major constituents on SW480 human colorectal cancer cells”, Int J Oncol, 31(5), pp.1149-1156 177 Sun M, Bu R, Zhang B, Cao Y, Liu C, Zhao W (2020), “Lentinan Inhibits Tumor Progression by Immunomodulation in a Mouse Model of Bladder Cancer”, Integrative cancer therapies, 19, pp 1-7 178 Berraondo P, Sanmamed MF, Ochoa MC et al (2019), “Cytokines in clinical cancer immunotherapy”, Br J Cancer, 120, pp 6–15 179 Jiang T, Zhou C, Ren S (2016), “Role of IL-2 in cancer immunotherapy”, Oncoimmunology, 5(6), pp e1163462 180 Vannucci L, Krizan J, Sima P et al (2013), “Immunostimulatory properties and antitumor activities of glucans (Review)”, International Journal of Oncology, 43, pp 357-364 document, khoa luan202 of 98 tai lieu, luan van203 of 98 181 Dai J, Chen J, Qi J et al (2020), “Konjac Glucomannan from Amorphophallus konjac enhances immunocompetence of the cyclophosphamide-induced immunosuppressed mice”, Food Sci Nutr, 9(2), pp 728-735 182 Srinivas, U S., Tan, B., Vellayappan, B A., & Jeyasekharan, A D (2019), “ROS and the DNA damage response in cancer”, Redox biology, 25, pp 101084 183 Aboelella, N S., Brandle, C., Kim, T., Ding, Z C., & Zhou, G (2021), “Oxidative Stress in the Tumor Microenvironment and Its Relevance to Cancer Immunotherapy”, Cancers, 13(5), pp 986 184 Muriel, P and Gordillo, K.R., (2016), “Role of oxidative stress in liver health and disease”, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2016, pp 9037051 185 Melekh, B., Ilkiv, I., Lozynskyi, A and Sklyarov, A., (2017), “Antioxidant enzyme activity and lipid peroxidation in rat liver exposed to celecoxib and lansoprazole under epinephrine-induced stress”, Journal of Applied Pharmaceutical Science, 7, pp 94-99 186 Chen, T., Li, B., Qiu, Y., Qiu, Z., & Qu, P (2018), “Functional mechanism of Ginsenosides on tumor growth and metastasis”, Saudi journal of biological sciences, 25(5), pp 917–922 187 Li W, Wang JQ, Zhou YD, Hou JG, Liu Y, Wang YP, Gong XJ, Lin XH, Jiang S, Wang Z, (2020), “Rare Ginsenoside 20(R)-Rg3 Inhibits D-GalactoseInduced Liver and Kidney Injury by Regulating Oxidative Stress-Induced Apoptosis”, The American Journal of Chinese Medicine, 48(5), pp 1141-1157 188 Hu, S., Zhu, Y., Xia, X., Xu, X., Chen, F., Miao, X., & Chen, X (2019), “Ginsenoside Rg3 Prolongs Survival of the Orthotopic Hepatocellular Carcinoma Model by Inducing Apoptosis and Inhibiting Angiogenesis”, Analytical cellular pathology (Amsterdam), 2019, pp 3815786 document, khoa luan203 of 98 tai lieu, luan van204 of 98 189 Jiang, J W., Chen, X M., Chen, X H., & Zheng, S S (2011), “Ginsenoside Rg3 inhibit hepatocellular carcinoma growth via intrinsic apoptotic pathway”, World journal of gastroenterology, 17(31), pp 3605–3613 190 Aydιn, A., Aktay, G., & Yesilada, E (2016), “A Guidance Manual for the Toxicity Assessment of Traditional Herbal Medicines”, Natural product communications, 11(11), pp 1763–1773 191 OECD (2002), Test No 423: Acute Oral toxicity - Acute Toxic Class Method, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris 192 Erhirhie, E O., Ihekwereme, C P., & Ilodigwe, E E (2018), “Advances in acute toxicity testing: strengths, weaknesses and regulatory acceptance”, Interdisciplinary toxicology, 11(1), pp 5–12 193 OECD (2018), Test No 408: Repeated Dose 90-Day Oral Toxicity Study in Rodents, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris 194 Phạm Thị Minh Đức (2011), Sinh lý học (sách đào tạo bác sĩ đa khoa), Nhà xuất Y học, Hà Nội 195 Đại học Y Hà Nội (2013), Hóa sinh lâm sàng, Nhà xuất Y học, Hà Nội 196 Li, W., Zhang, X., Xin, Y., Xuan, Y., Liu, J., Li, P., & Zhao, Y (2016), “Oral subchronic toxicity evaluation of a novel antitumor agent 25-methoxydammarane3, 12, 20-triol from Panax notoginseng in Sprague-Dawley rats”, Regulatory toxicology and pharmacology : RTP, 77, pp 240–251 197 Murbach, T S., Glávits, R., Endres, J R., Hirka, G., Vértesi, A., Béres, E., & Szakonyiné, I P (2019), “Toxicological Evaluation of a Mixture of Astragalus membranaceus and Panax notoginseng Root Extracts (InnoSlim®)”, Journal of toxicology, 2019, pp 5723851 document, khoa luan204 of 98 tai lieu, luan van205 of 98 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phiếu giám định tên khoa học dược liệu Tam thất document, khoa luan205 of 98 tai lieu, luan van206 of 98 document, khoa luan206 of 98 tai lieu, luan van207 of 98 document, khoa luan207 of 98 tai lieu, luan van208 of 98 Phụ lục 2: Hình ảnh tiêu mẫu Tam thất document, khoa luan208 of 98 tai lieu, luan van209 of 98 Phụ lục 3: Báo cáo kết điều chế cao định lượng từ rễ củ Tam thất I NGUN LIỆU, DUNG MƠI, HỐ CHẤT 1.1 Ngun liệu Các mẫu Tam thất - Tam thất chưa chế: mẫu Tam thất sấy khô, nghiền thành bột - Tam thất chế: bột Tam thất hấp nhiệt độ 120ºC 1.2 Dung mơi, hố chất Dung môi dùng cho chiết xuất: ethanol (CN) Dung môi, hố chất dùng cho phân tích: Acetonitril, methanol, acid phosphoric (Merck), nước cất lần 1.3 Thiết bị dụng cụ Máy chiết máy cô chân không đa (Daihan, Hàn Quốc) Bình chiết thu hồi có dung tích 20 lít 10 lít Hệ thống máy HPLC (Shimadu, Nhật Bản) II PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương pháp điều chế cao chiết Cân khoảng kg dược liệu, chiết hồi lưu với dung môi ethanol 70%, tỷ lệ dung mơi/dược liệu: 10/1 (thể tích/khối lượng), lần, lần Gộp dịch chiết, cô thu hồi dung môi áp suất giảm thu cao đặc Hiệu suất chiết cao đặc từ dược liệu xác định dựa công thức: H= Mcao x (100-acao) x 100 Mdl x (100-adl) Trong đó: H: hiệu suất chiết cao (%) Mcao, Mdl: khối lượng cao, khối lượng dược liệu (g) acao, adl: độ ẩm cao, độ ẩm dược liệu (%) 2.2 Định lượng số saponin cao chiết Chuẩn bị mẫu: document, khoa luan209 of 98 tai lieu, luan van210 of 98 Dung dịch chuẩn: Cân xác 15,0mg chất đối chiếu, hịa tan riêng 5ml methanol, thu dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 3mg/ml Phối hợp dung dịch chuẩn gốc thu dung dịch hỗn hợp chuẩn Pha loãng dung dịch hỗn hợp chuẩn với methanol, thu dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ thích hợp Dung dịch thử: Cân xác khoảng 200mg cao chiết, thêm ethanol 70%, siêu âm cho tan hoàn toàn, chuyển vào bình định mức 25ml, thêm dung mơi đến vạch Các dung dịch chuẩn dung dịch thử lọc qua màng lọc kích thước 0,45µm trước triển khai sắc ký Điều kiện sắc ký: Hệ thống HPLC hãng Shimadzu, Nhật Bản Nhiệt độ buồng cột: 28°C Tốc độ dịng: 1,0ml/phút Thể tích tiêm mẫu: 20µl Bước sóng phát hiện: 205nm Pha tĩnh: Cột Agilent C18 (250 x 4,6mm; 5µm) Pha động: acetonitril (A) – Acid phosphoric 0,1% nước (B), rửa giải theo chương trình sau: Thời gian (phút) Acetonitril (%) Acid phosphoric 0.1% nước (%) 0-20 20-22 80-78 20-45 22-46 78-54 45-55 46-55 54-45 55-70 55 45 Tiến hành: Tiêm dung dịch hỗn hợp chuẩn, ghi nhận sắc ký đồ Xây dựng đường chuẩn biểu diễn phụ thuộc diện tích pic chất đối chiếu nồng độ chúng dung dịch document, khoa luan210 of 98 tai lieu, luan van211 of 98 Tiêm dung dịch thử, tiến hành sắc ký, ghi nhận sắc ký đồ Hàm lượng chất mẫu Tam thất xác định dựa công thức: X (%)= Y-b 100 25 xHxkx x A m x 1000 100-a Trong đó: X: hàm lượng chất cần phân tích tính theo khối lượng cao khơ kiệt (%) Y: diện tích pic chất cần phân tích sắc ký đồ mẫu thử A,b: hệ số phương trình đường chuẩn, xác định thực nghiệm H: độ tinh khiết chất đối chiếu (tính theo diện tích pic) k: hệ số điều chỉnh thực nghiệm m: khối lượng cao chiết (mg) a: độ ẩm cao chiết (%) III KẾT QUẢ 3.1 Hiệu suất chiết cao từ mẫu dược liệu Bảng 1: Hiệu suất chiết cao từ mẫu dược liệu Tên mẫu Khối lượng (g) Mẫu chưa chế Mẫu chế 988,00 970,00 Độ ẩm dược liệu (%) 4,30 13,05 Khối lượng cao (g) 468,70 372,78 Độ ẩm Hiệu suất chiết cao (%) (%) 9,90 6,60 3.2 Định lượng mẫu cao chiết 3.2.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký Tiến hành sắc ký mô tả mục 2.2, thu sắc ký đồ hình document, khoa luan211 of 98 44,66 41,28 tai lieu, luan van212 of 98 Hình 1: Sắc ký đồ cao Tam thất A: Hỗn hợp mẫu chuẩn B: Cao chiết từ mẫu Tam thất chưa chế C: Cao chiết từ mẫu Tam thất chế Hình ảnh sắc ký đồ cho thấy với điều kiện sắc ký chọn, chất cần phân tích cho pic tách rõ ràng, dùng để định lượng mẫu nghiên cứu 3.4.2 Xây dựng đường chuẩn Tiến hành mô tả mục 2.2 Kết trình bày bảng hình document, khoa luan212 of 98 tai lieu, luan van213 of 98 Bảng 2: Kết xây dựng đường chuẩn Nồng độ Diện tích pic Rg1 Re Rb1 Rh1 Rd Rg3 50 237420 203246 248534 367547 213028 314887 100 482741 411054 577000 881443 376099 615333 250 1194066 1022877 946749 1783151 929541 1491191 750 3562974 3055435 2633396 5134706 2639867 4283532 1000 4782154 4099647 3611931 6889350 3544766 5693495 1250 6285688 4690307 4245554 8146239 4381079 6951359 1500 7972059 5341087 5073620 9795781 5276054 8323176 trình y=5181.3 y=3661.5 y=3304.7 y=6470.5 y=3486.9 y=5524.3 đường x-124483 x+126065 x+163421 x+184682 +39266 x+86267 0.9999 0.9997 (µg/ml) Phương chuẩn R2 document, khoa luan213 of 98 0.9955 0.9917 0.9982 0.9987 tai lieu, luan van214 of 98 Hình 2: Đồ thị biểu diễn đường chuẩn saponin đối chiếu document, khoa luan214 of 98 tai lieu, luan van215 of 98 Dựa bảng hình 2, thấy chất cần phân tích có tương quan tuyến tính diện tích pic sắc ký đồ với nồng độ dung dịch Vì dùng phương pháp để xác định hàm lượng chất mẫu cao Tam thất chưa chế biến chế biến Kết định lượng mẫu cao trình bày bảng Bảng 3: Kết định lượng cao chiết từ Tam thất Tên mẫu Độ ẩm (%) Hàm lượng chất cao (%) Rg1 Re Rb1 Rh1 Rd Rg3 Tổng 32,32 ± Cao chiết từ 11,70a 1,81 ± 14,89 ± 0,30 ± 3,23 ± 0,38 ± ± 0,41 Tam thất 9,90 0,01 0,18 0,01 0,08 0,01 b 0,16 chưa chế Cao chiết từ 24,62 ± 5,30 ± 2,57 ± 0,83 ± 16,16 ± Tam thất 6,60 ND ND 0,20 0,07 0,12 0,03 0,07 chế Ghi chú: a: hàm lượng mẫu (%), b: độ lệch chuẩn (%, n=3), ND: không phát document, khoa luan215 of 98 tai lieu, luan van216 of 98 Phụ lục 4: Phiếu phân tích kiểm nghiệm cao chiết Tam thất document, khoa luan216 of 98 ... CHƯƠNG CHẤT LI? ?U, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C? ?U 2.1 CHẤT LI? ?U VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN C? ?U 2.1.1 Chất li? ?u nghiên c? ?u * M? ?u dược li? ?u nghiên c? ?u M? ?u dược li? ?u nghiên c? ?u rễ củ năm Tam thất (Panax... trợ đi? ?u trị ung thư cần nghiên c? ?u đánh giá 1.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG U Để nghiên c? ?u tác dụng kháng u thực nghiệm chế phẩm nghiên c? ?u, nghiên c? ?u thường... định hướng đi? ?u trị ung thư Tam thất trồng Việt Nam Từ thực tế trên, tiến hành nghiên c? ?u đề tài: ? ?Nghiên c? ?u tác dụng kháng u thực nghiệm rễ củ Tam thất (Panax notoginseng, (Burk.) F.H Chen,