TIỂU LUẬN CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

TIỂU LUẬN CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

TR B GIÁO D C VÀ ĐÀO T O NG Đ I H C NƠNG LÂM TP.H CHÍ MINH B MÔN CÔNG NGH SINH H C L P: DH06SH Yo0oZ Bài ti u lu n mơn Chẩn đốn b nh gia súc, gia cầm sinh h c phân tử Đề tài: CÁC K THU T S C KÝ GVHD: PGS.TS NGUY N NG C H I Sinh viên thực hi n: ĐINH CÁT ĐI M MSSV: 06126027 Thành ph H Chí Minh, tháng 10/2009 I) Đ T V N Đ Các tế bào sống ch a hàng trăm loại hợp chất hóa học khác Các hợp chất bao gồm đại phân tử nh protein, acid nucleic, lipid,… nh hợp chất có trọng l ợng phân tử nhỏ Những hợp chất diện số l ợng nhỏ, d ới dạng vết (enzyme) hay số l ợng nhiều (các protein cấu tạo) Ng ời ta muốn biết thành phần hóa học c a tế bào, nhằm hiểu rõ quy trình biến đổi c a nó, qua giúp sống ngày thêm tốt đẹp Muốn vậy, ng ời ta phải tìm cách tách tách riêng chúng để xác định cấu trúc hóa học Từ đó, kỹ thuật tách riêng hợp chất đời với tên gọi sắc ký (chromatography) Ngày nay, sắc ký đ ợc sử dụng để tách tất hợp chất dù có màu hay khơng, dù trọng l ợng phân tử nhỏ hay lớn Nh ng phân tử sinh học thiên hình vạn trạng với trọng l ợng phân tử lớn nhỏ khác nhau, tính phân cực nhiều hay khác nên khơng thể có kỹ thuật sắc ký chung cho loại hợp chất khác Vì lý đó, tơi thực đề tài: “Các kỹ thuật sắc ký” với h ớng dẫn c a thầy Nguyễn Ngọc Hải II) T NG QUAN II.1) L ch sử s c ký ¾ Năm 1903, nhà bác học Nga Michael Tswett cho dung dịch sắc tố thực vật ete dầu hoả lên cột nhồi bột mịn canxi cacbonat, ông thấy sắc tố bị hấp phụ lên đầu cột Khi cho ete dầu hoả lên cột, sắc tố di chuyển cột từ xuống d ới, sắc tố có tốc độ riêng, tách thành vùng hay vòng màu xếp chồng lên nhau, hình thành hệ mà Tvest gọi sắc đồ Ông đặt tên cho ph ơng pháp tách sắc ký (Chromatography) Trong tiếng Hy Lạp,“chroma” có nghĩa chất màu, graphein có nghĩa viết Tên gọi ngày đ ợc sử dụng ph ơng pháp đ ợc dùng tách chất khơng màu ¾ Đến thập kỷ 1930-1940, ph ơng pháp đ ợc phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác nh sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lực, ¾ Năm 1954, Mould D.L phát triển sắc ký gel để tách hợp chất mang điện tích theo trọng l ợng phân tử c a chúng Đến năm 1964, Moor gọi “gel permeation chromatography” hay gọi sắc ký lọc gel ¾ Năm 1906, sắc ký khí đ ợc biết đến nh ng đến 1952, kỹ thuật phát triển mạnh mẽ, thập niên 1960 ¾ Năm 1967, Horvath C tác giả tạo máy sắc ký lỏng cao áp II.2) Đ nh nghĩa s c ký Sắc ký nhóm ph ơng pháp hoá lý dừng để tách thành phần c a hỗn hợp Sự tách sắc ký đ ợc dựa phân chia khác c a chất khác vào hai pha tiếp xúc khơng hồ lẫn vào nhau: pha tĩnh pha động (Trong thí nghiệm c a Tvest: pha tĩnh canxi cacbonat, pha động ete dầu hoả) Pha tĩnh trì hỗn di chuyển c a thành phần mẫu Khi thành phần di chuyển qua hệ thống sắc ký với tốc độ khác nhau, chúng đ ợc tách khỏi theo thời gian Mỗi thành phần qua hệ thống khoảng thời gian riêng biệt, gọi thời gian l u Trong kỹ thuật sắc ký, hỗn hợp đ ợc chuyên chở chất lỏng khí thành phần c a đ ợc tách phân bố khác c a chất hòa tan chúng chảy qua pha tĩnh rắn lỏng Nhiều kỹ thuật khác đ ợc dùng để phân tích hợp chất ph c tạp dựa tính khác c a chất mơi tr ờng động khí lỏng môi tr ờng hấp phụ tĩnh mà chúng di chuyển qua nh giấy, gelatin hay gel magnesium silicate, Sắc ký ph ơng pháp để phân tách tinh phân tử sinh học Sắc ký ph ơng pháp nhanh, dễ dàng không ảnh h ởng đến protein, ph ơng pháp đ ợc đề nghị nghiên c u định l ợng protein hay phân tử II.3) Các giai đo n trình s c ký: Quá trình sắc ký gồm giai đoạn chính: a) Đ a h n h p lên pha tĩnh (ví dụ: đ a dung dịch sắc tố lên đầu cột canxi cacbonat) Các chất đ ợc giữ pha tĩnh b) Cho pha đ ng ch y qua pha tĩnh (dung môi để dầu hoả qua cột), pha động kéo theo chất di chuyển pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi có vị trí khác pha tĩnh tạo thành s c ký đ (chromatogram) Giai đoạn gọi khai triển sắc ký Nếu tiếp tục cho pha động chạy qua chất lần l ợt bị kéo pha tĩnh (ví dụ: khỏi cột) Đó q trình rửa giải dung môi dùng đ ợc dung môi rửa giải (eluent), dịch h ng đ ợc cuối cột gọi dịch rửa giải (eluate) Nếu chất đ ợc tách pha tĩnh (sắc ký khai thêm ta lấy phần pha tĩnh có mang chất (phân đoạn bột cột) đem chiết lấy chất Nếu chất đ ợc tách pha tĩnh (sắc ký rửa giải) ta h ng thu lấy phân đoạn dịch rửa giải có chất cần phân tích c) Phát hi n ch t: Các chất màu phát dễ dàng, chất khơng màu phát đèn tử ngoại hay thuốc thử Trong sắc ký rửa giải phát chất chúng khỏi cột cách cho dung dịch rửa giải qua phận phát gọi detector đặt sau cột II.4) Phân lo i ph ơng pháp s c ký II.4.1) Theo b n ch t v t lý pha Pha động chất lỏng hay chất khí Pha tĩnh chất rắn (hạt xốp hay bột mắn) hay chất lỏng (đ ợc giữ chất mang rắn) Ư Do đó, dựa vào chất pha ta phân biệt ph ơng pháp (trong tên c a ph ơng pháp, pha động đ ợc nêu tr ớc pha tĩnh): S c ký lỏng - lỏng (liquid - liquid chromatography LLC) S c ký lỏng - r n (liquid - song chromatography LSC) S c ký khí - lỏng (gas - liquid chromatography GLC) S c ký khí - r n (gas - solid chromatography GSC) Hai ph ơng pháp đầu gọi chung sắc ký lỏng (LC) Hai ph ơng pháp cuối gọi chung sắc ký khí (GC) II.4.2) Theo hi n t ng s c ký S c ký h p ph (absorption chromatography): pha tĩnh chất rắn có khả hấp phụ, ph ơng pháp sắc ký lỏng - rắn khí - rắn S c ký phân b (partition chromatography): pha tĩnh chất lỏng khơng hồ lẫn đ ợc với pha động, chất lỏng đ ợc bao bề mặt c a chất rắn gọi giá hay chất mang phải chất trơ, không tham gia vào sắc ký Sắc ký phân bố bao gồm sắc ký lỏng - lỏng sắc ký khí - lỏng S c ký trao đ i ion (ion - exchange chromatography): pha tĩnh chất nhựa trao đổi ion chớp chất cao phân tử có mang ion có khả trao đổi với ion dấu c a dung dịch hỗn hợp sắc ký) S c ký theo lo i cỡ (size - exclusion chromatography): gọi sắc ký gel Các phân tử cỡ lớn đ ợc loạt phân tử nhỏ đ ợc tách theo kích th ớc phân tử nhỏ di chuyển chậm II.4.3) Theo k thu t ph ơng ti n s c ký II.4.3.1) Theo ph ơng pháp giữ pha tĩnh: S c ký c t (column chromatography: CC) pha tĩnh đ ợc ch a cột kim loại hay thuỷ tinh S c ký l p mỏng (thin layer chromatography: TLC): pha tĩnh đ ợc tráng giữ mặt phẳng c a thuỷ tinh, nhựa hay nhôm Lớp mỏng pha tĩnh th ờng là: silicagel, nhôm oxit, xenlulozơ, chất nhựa trao đổi lớn có chiều dày khoảng 0,25 - 0,5mm S c ký gi y (paper chromatography - PC) pha tĩnh (lỏng) đ ợc thấm loại giấy lọc đặc biệt gọi giấy sắc ký II.4.3.2) Theo cách cho pha đ ng ch y ta có: S c ký khai tri n (development chromatography) cho pha động kép chất chạy tách pha tĩnh (Sắc đồ nằm pha tĩnh) S c ký rửa gi i (elution chromatoglaphy) cho pha động chạy kép chất lần l ợt ngồi pha tính (ra khỏi cột, khỏi giấy) II.5) T c đ di chuy n m t ch t, peak hình dáng peak II.5.1) T c đ di chuy n m t ch t Tốc độ di chuyên c a chất đ ợc đặc tr ng hệ số phân bố c a hai pha đại l ợng l u giữ c a chất pha tĩnh (thời gian l u, thể tích l u) a Th i gian l u th tích l u Thời gian l u thời gian cần để chất di chuyển qua cột sắc ký, khỏi cột nhờ thiết bị detector ghi nhận tín hiệu xuất rực sắc đồ (tính từ lúc bơm mẫu đến xuất peak) Tm thời gian l u c a chất không bị l u giữ, nghĩa tốc độ di chuyển c a tốc độ di chuyển trung bình c a dung môi, thời gian đ ợc gọi thời gian chết tR lớn, chất bị l u giữ mạnh tốc độ di chuyển c a nhỏ Hình: S c ký đ m t ch t Thời gian l u hiệu chỉnh tR đ ợc tính theo cơng th c: Nếu trục hoành c a sắc đồ, dùng đơn vị đo thể tích dung mơi ta có đại l ợng t ơng tự: thể tích l u VR thể tích l u hiệu chỉnh VR' thể tích VM đ ợc gọi thể tích chết c a cột hay cịn gọi thể tích rỗng Vo b H s phân b Trong đó: Cs Cm nồng độ chất tan pha tĩnh pha động cân đ ợc thiết lập Khi nồng độ nhỏ K phụ thuộc vào chất pha, chất tan nhiệt độ K lớn chất phân bố nhiều pha tĩnh di chuyển chậm c H s dung l ng K' (h s phân b kh i l ng) Trong đó: Qs QM l ợng chất tan phân bố pha anh pha động, K' phụ thuộc vào chất pha, chất chất tan, nhiệt độ đặc điểm c a cột Để tách hỗn hợp chất, ng ời ta th ờng chọn cột, pha động điều kiện phân tích khác cho K' nằm khoảng từ đến II.5.2) Peak hình dáng peak a Hình dáng peak: Hình dáng lý t ởng c a t c lực đối x ng, nh ng thực tế lúc sắc ký gần đối x ng Chiều rộng c a tục đ ợc đo 1/10 chiều cao c a peak b Sự kéo dài peak: kết c a di chuyển nhanh chậm khác c a phân tử c a chất qua cột sắc khí Các lực chậm tù c Hi u lực c t: Hiệu lực c a cột th ờng đ ợc đo hai thông số: số đĩa lý thuyết N chiều cao đĩa lý thuyết H Ta coi nh cột sắc khí đ ợc chia thành N lớp hay N tầng mỏng, lớp phân bố chất tan vào hai pha đạt trạng thái cân Những tầng mỏng giả định đ ợc gọi địa lý thuyết Nếu cột sắc khí có chiều dài L thì: H = N/L Cột có N lớn cột có hiệu lực cao d Đ phân gi i: Độ phân giải Rs tỉ số khoảng cách hai peak độ rộng trung bình c a peak Rs = 0,75 hai pic tách khơng tốt, cịn xen ph nhiều; Rs = 1,0 hai pic tách tốt, xen ph 4%; Rs = l,5 hai pic tách hoàn toàn (chi xen ph 0,3%) II.6) Các k thu t s c ký II.6.1) S c ký gi y Sắc ký giấy ph ơng pháp phân tách dễ dàng thành phần c a hỗn hợp (acid amin) Trong sắc ký giấy, pha tĩnh tờ giấy cellulose ( thí dụ nh tờ giấy thấm, giấy lọc phịng thí nghiệm) Các lọai giấy có tính n ớc nên thực tế, pha tĩnh lớp n ớc (H2O) thật mỏng đ ợc che ph lên bề mặt c a tờ giấy, sắc ký giấy lọai sắc ký phân chia Pha động chất lỏng( chất lỏng hay hỗn hợp dung môi) Ph ơng pháp th ờng đ ợc sử dụng để tách chất a n ớc nh amino acid, đ ờng, Trong giấy, cellulose có dạng sợi, sợi nằm cạnh tạo thành mạng l ới với lỗ rỗng to Khi ly giải, dung môi di chuyển dọc theo bề mặt sợi lỗ rỗng đ ợc ph đầy dung môi Nh thế, chất tan bị phân tán nhiều lỗ rỗng khiến vết sắc ký to Bột giấy hấp thu n ớc, n ớc bị giữ lại cấu trúc glucopyranose cầu nối hydrogen, trình sắc ký xảy theo chế phân chia Hình: S c ký gi y, ch t màu di chuy n theo dung môi lên gi y v i m khác (a) Một giọt hỗn hợp (drop of mixture) đặt góc mảnh giấy lọc, cạnh giấy nằm dung môi (b) Dung môi di chuyển lên giấy lực hút mao mạch, chất phân bố theo tỷ lệ khác Mỗi hợp chất di chuyển với tốc độ phản ánh kích th ớc c a phân tử c a hịa tan c a dung mơi (c) Những chất khác đ ợc trải điểm khác biệt bảng , tạo thành sắc ký đồ Ö Hiện nay, sắc ký giấy dần đ ợc thay sắc ký lớp mỏng Do phần lớn chất hữu khơng có màu, nên sắc ký giấy không cho thấy đ ợc vị trí c a mẫu chất q trình dung môi di chuyển lên giấy Nh c m s c ký gi y: Trong giấy, cellulose dạng sợi dài nằm song song kề cách tự nhiên, hệ thống mạng nh chắn có lỗ hỗng Khi dung mơi giải ly di chuyển (mang theo chất tan, solute) dọc theo bề mặt c a sợi, lỗ rỗng đ ợc dịp ph đầy dung môi, chất tan có dịp khuếch tán vào lỗ rỗng này, khiến chất tan lúc to dần so với vết chấm tạo m c xuất phát ban đầu Còn sợi cellulose đ ợc nén chặt dòng chảy khó di chuyển II.6.2) S c ký l p mỏng Sắc ký lớp mỏng hay gọi sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa ch yếu vào t ợng hấp thu pha động dung môi hỗn hợp dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh chất trơ (thí dụ nh : silicagel hay oxid alumin) Pha tĩnh đ ợc tráng thành lớp mỏng, đều, ph lên phẳng nh kiếng, nhôm hay plastic Do chất hấp thu đ ợc tráng thành lớp mỏng nên ph ơng pháp đ ợc gọi sắc ký lớp mỏng ¾ Bình sắc ký: Một chậu, hũ, lọ th y tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy ¾ Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25 nm c a loại hợp chất hấp thu (silicagel, alumin, ) đ ợc tráng thành lớp mỏng, đều, ph lên kiếng, nhôm, hay plastic Chất hấp thu nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay lọai polymer hữu ¾ Mẫu cần phân tích: th ờng hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha lõang 2-5%, nhờ vi quản để chấm thành điểm gọn pha tĩnh, vị trí phái cao chút so với mặ thoáng c a chất lỏng ch a bình Hình: Bình sắc ký lớp mỏng ¾ Pha động: dung môi hay hỗn hợp dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo lớp mỏng, lơi kéo mẫu chất theo Dung mơi di chuyển cao nhờ tính mao quản Mỗi thành phần chất di chuyển với vận tốc khác nhau, phía sau mực c a dung mơi Vận tốc di chuyển phụ thuộc vào lực t ơng tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ mẫu chất lại pha tĩnh tùy thuộc vào độ hịa tan c a mẫu chất dung mơi ¾ u điểm: -Chỉ cần l ợng mẫu để phân tích -Có thể phân tích đồng thời mẫu chất chuẩn đối ch ng điều kiện phân tích -Tất hợp chất mẫu phân tích đ ợc định vị sắc ký lớp mỏng ¾ Các b ớc thực sắc ký lớp mỏng: -Chuẩn bị ống vi quản: ống th y tinh có đ ờng kính ống nhỏ, khỏang 1-2mm, đầu đ ợc vót nhọn, dài 10-20cm Sử dụng ống vi quản để chấm nhiều lọai mẫu dung dịch khác nhau, cần sau lần sử dụng, rửa vi quản dung môi hữu nh aceton -Chuẩn bị mỏng: mỏng th ơng mại 20x20cm, dùng kéo cắt với kiách th ớc cần thiết, phải vừa bình giải ly Dùng bút chì vạch nhẹ nét xuất phát m c tiền tuyến dung môi -Chuẩn bị dung dịch mẫu: Mẫu chất lỏng, chấm trực tiếp mẫu lên mỏng, mẫu dung dịch sễt, pha lỗng mẫu Với mẫu chất rắn phải hịa tan dung mơi hữu phù hợp, nồng độ 2-5% Nhờ vi quản để dung dịch mẫu lên bề mặt sắc ký lớp mỏng cách thận trọng, tránh không cho làm lũng bề mặt c a lớp mỏng Mỗi vết chấm không ch a nhiều 12ug (10ug tối u) mẫu chất -Sấy nhẹ để dung môi bay khỏi vết chấm, nhúng vào dung dịch giải ly -Giải ly để dung môi giải ly di chuyển lên: Sau bình bão hịa dung mơi, ng ời ta đặt mỏng vào bình khai triển vết chấm mẫu bờ cạnh phía d ới đáy bình Cạnh đáy c a lớp mỏng nậgp dung môi giải ly khỏang 0.5-1cm Các vết mẫu khơng đ ợc ngập dung mơi giải ly, nh dung môi khuếch tán vào dung mơi -Hiện hình vết sau giải ly: Các hợp chất có màu đ ợc nhìn thấy mắt th ờng, nh ng phần lớn hợp chất hữu khơng có màu, nên muốn nhìn thấy vết, cần sử dụng phuơng pháp vật lý (Phát tia tử ngoại UV: đèn chiếu tia UV 254nm ánh sáng nhận hợp chất hấp thu tia UV, hợp chất có màu tối sẫm sáng; đèn chiếu tia UV 366nm ánh sàng phát nhữgn hợp chất có phát hùynh quang, vết sẫm c a chất mẫu có màu sáng mỏng sẫm màu) hay dùng ph ơng pháp hóa học (Bằng cách dung thuốc thử hình nh iod, 2,7-fluorescein phát đa số hợp chất hữu cơ, ninhydrin phát aminoacid hay amin, 2,4-dinitrophenylhydrazin phát aldehyde hay caton, clorur antimony phát steroid hay vitamin hay carotenoid,…) - Ðại l ợng đặc tr ng cho m c độ di chuyển c a chất phân tích hệ số di chuyển Rf đ ợc tính tỷ lệ khoảng dịch chuyển c a chất thử khoảng dịch chuyển c a dung mơi: Trong đó: a khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm c a vết mẫu thử, tính cm, b khoảng cách từ điểm xuất phát đến m c dung môi đo đ ờng c a vết, tính cm Rf: Chỉ có giá trị từ đến l Hình: Các b ớc c a trình sắc ký lớp mỏng II.6.3) S c ký c t: Sắc ký cột đ ợc tiến hành điều kiện áp suất khí Pha tĩnh hạt có kích th ớc t ơng đối lớn (50-150um), đ ợc nạp cột th y tinh Mẫu chất cần phân tích đ ợc đặt đầu cột, phía pha tĩnh (có lớp th y tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình ch a dung mơi giải ly đ ợc đặt phái cao Dung môi giải ly khỏi cột phần bên d ới cột đ ợc h ng vào lọ nhỏ đặ ống dẫn c a cột Ph ơng pháp th ờng làm cho trình tách bị chậm, hiệu thấp so với sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Tuy vậy, sắc ký cột có u điểm pha tĩnh dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, triển khai với l ợng mẫu t ơng đối lớn ¾ Các b ớc thực sắc ký cột: -Lựa chọn chất hấp thu :pha tĩnh silicagel loại th ờng, hợp chất không phân cực đ ợc giải ly khỏi cột tr ớc, hợp chất phân cực đ ợc giải ly sau Vơí phân tử khơng phân cực, phân tử n có trọng luợng phân tử lớn có tính phân cực mạnh phân tử kia, bị pha tĩnh giữ lại cột nên di chuyển khỏi cột chậm so với phân tử nhỏ, có nóở lại lâu cột so với phân tử có tính phân cực - Lựa chọn dung mơi:Mẫu cần sắc ký đuợc hồ tan hồn tồn dung mơi phù hợp với nồng độ 10mg/ml, gọi dung dịch mẫu (A) Chuẩn bị 4-6 mỏng 2,5x10cm Chấm lên tấm khoảng 2-5ul dd(A) Mỗi mỏng đ ợc triển khai với loại dung môi giải ly khác nhau, kế phát đèn UV hay thuốc thử Với đơn dung môi dễ dàng thấy đ ợc dung mơi phù hợp Từ kết đó, cố gắng tìm hỗn hợp dung mơi, dung môi phân cực dung môi phân cực thí dụ nh ete dầu hỏa: etyl acetate -Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đ ng giá, cho dung môi loại phân cực vào khoảng 2/3 chiều cao cột Cho chất hấp thu dạng khô vào thẳng cột, đặn, lần l ợng nhỏ, vừa cho vừa khỏ nhẹ vào thành cột Khi lớp chất hấp thu đạt đ ợc chiều cao khoảng 2cm cột, mở nhẹ khố bên d ới để cột dung môi chảy ra, h ng vào becher trống để bên d ới cột, dung mơi dẽ đ ợc rót lại lên đầu cột Sau nạp xong, cho dung môi chảy qua chất hấp thu vài lần đến chất hấp thu cột đồng -Nạp mẫu: Mẫu dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký Nếu mẫu dạng rắn hồ tan mẫu chất vào l ợng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởi đầu sắc ký Thực nạp mẫu lên cột nh sau: +Mở khố cho dung mơi chảy khỏi cột để hạ m c dung môi cột xuống cho vừa sát với mặ thoáng c a chất hấp thu cột +Đóng khố lại, nạp dung dịch mẫu vào đầu cột Muốn nạp mẫu, sử dụng pipet hút dung dịch mẫu chất, đặt đầu pipet gần sát mặt thoáng cảu chất hấp thu cột, vừa bóp vừa rây pipet dọc quanh thành cột cho dung dịch chảy theo thành c a cột, chạm xuống bề mặt chất hấp thu +mở khoá bên d ới cho dung môi chảy khỏi cột, làm cho dung dịch mẫu đ ợc thấm hết vào chất hấp thu đầu cột, cần canh chừng không cho chất hấp thu đầu cột bị khô +Dùng pipet cho luợng nhỏ dung môi lên đầu cột, đồng thời dùng dung môi để rửa ống mà dung dịch dính thành cột +Mở khố cho dung mơi chảy Lặp laị vài lần giúp cho dung dịch mẫu thấm sâu vào chất hấp thu, dung môi suốt không lây màu c a chất mẫu +Sử dụng bơng th y tinh, bơng gịn, cát hay giấy lọc đặt nhẹ lên mặt thoáng chất hấp thu để bảo vệ mặt cột +Cho dung môi vào đầy cột để tiến hành giải ly cột II.6.4) S c ký trao đ i ion Sự trao đổi ion gắn kết có tính chất thuận nghịch phân tử có mang điện tích Trong sắc ký cột nhồi , pha tĩnh R có gắn thêm nhóm ch c G mang điện tích Giả sử cho ngang qua cột hỗn hợp mẫu chất ban đầu có ch a nhiều lọai chất tan (solute) khác nhau, chất tan có mang điện tích ng ợc dấu với điện tích c a nhóm ch c, thí dụ chất tan S, chất tan dẽ đuổi đối ion C chỗ vào, để gắn vào pha tĩnh, nh chất tan bị giữ lại cột, chất khác c a hỗn hợp mẫu chất ban đầu không bị giữ lại nên khỏi cột kỹ thuật tách riêng đ ợc hợp chất S khỏi hỗn hợp ban đầu RG- + S+ Ỉ RG-S+ + C+ Hoặc RG+ +S- -Ỉ RG+S- + CTrong đó: R pha tĩnh hay gọi nhựa (resin), G nhóm ch c mang điện tích đ ợc cố định pha tĩnh hay cịn gọi nhóm ch c họat động c a nhựa C đối ion c a G S chất hữu có mang điện tích trái dấu với G ¾ Các loại hạt nhựa trao đổi ion: nhựa polystyren, silicagel, polymer carbohydrate ¾ Các b c s c ký trao đ i ion: -Nhồi nhựa trao đổi ion vào cột: Giữ cột thẳng đ ng giá, khóa vịi bên d ới cột Nhựa trao đổi ion đã đ ợc cân dung dịch đệm, l ợng nhựa thể tích dung mơi cho rót nhựa dễ dàng vào cột, khơng tạo bọt khí nằm giữ hạt nhực Để yên 5-10 phút cho hạt nhựa lắng xuống, rót đầy cột dung dịch đệm, mở khóa hạt nhựa lắng xuống Khi nhồi cột hoàn tất, cần cân cột chách cho dung dịch đệm chày qua cột, cuối kiểm tra pH c a dung dịch chảy khỏi cột -Nạp mẫu chất lên đầu cột: dung dịch mẫu đ ợc lọc suốt tr ớc nạp vào cỗt, lọc tờ giấy lọc hay ngang qua lớp celite L ợng mẫu tùy vào l ợng nhựa nh khả trao đổi c a nhựa Đầiu quan trọng tất cấu tử quan trọng c a mẫu chất đ ợc hấp thu hết vào nhựa, t c ý số l ợng mẫu thể tích c a mẫu Để nạp mẫu lên cột: mở khóa để hạ m c dung dịch đệm xuống vừa sát m c nhựa đầu cột, khóa lại dùng pipet hút đặt dung dịch mẫu lên đầu cột, mở khóa cho dung dịch mẫu hút vào lớp nhựa đầu cột Để yên 10-20 phút mẫu chất tiếp xúc cân với nhựa 10 -Khi tất mẫu đ ợc gắn lên đầu cột nhựa, cho vài ml dung dịch đệm ban đầu chảy qua, nối cột với bình cung cấp dung dich giải ly -Giải ly cách tắng dần nồng độ dung dịch giải ly: hỗn hợp mẫu gắn vào nhựa trao đổi ion dung dịch đệm có nồng độ thấp Để tách mẫu chất khỏi nhựa th ờng, cần phải gia tăng lực ion c a dung dịch đệm cách cho thêm NaCl Khi có thêm NaCl dung dịch đệm, ion c a dung dịch đệm cạnh tranh với hỗn hợp mẫu chất, để giành lấy nhóm ch c họat động cảu nhựa, đẩy hợp chất khỏi nhựa, theo dòng chảy khỏi cột ¾ Trong ph ơng pháp sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh hạt mang sẵn điện tích định, hạt t ơng tác với phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Cụ thể, hạt mang điện âm (nh cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình đ ợc gọi s c ký trao đ i ion d ơng, t ơng tác với phân tử mang điện tích d ơng Ng ợc lại, hạt mang điện tích d ơng (nh cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAEcellulose)), gọi s c ký trao đ i ion âm, t ơng tác với phân tử mang điện tích âm Vì thế, protein dấu với cột chạy khỏi cột protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích protein này, ta tăng nồng độ ion c a pha động, ion phân tử protein t ơng tác với hạt mang điện tích Ví d , sắc ký trao đổi ion d ơng, ta thêm muối natri clorua hay muối khác dung dịch tách giải ion natri tranh bám vào cột với protein có điện tích d ơng, đó, protein mang điện tích d ơng đ ợc phóng thích ngồi cột lần l ợt theo độ lớn điện tích II.6.5) S c ký gel Trong sắc ký gel, pha tĩnh mạng polymer có lỗ rỗng lỗ rỗng đ ợc ph đầy dung môi dùng làm pha động Một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất có trọng l ợng phân tử khác cò thể tách riêng đ ợc hay khơng tuỳ vào kích th ớc lỗ rỗng Các phân tử có kích th ớc lớn lỗ rỗng, chui lọt vào bên lỗ rỗng, nhanh chóng theo dịng chảy c a pha động khỏi cột phân tử có trọng l ợng phân tử (TLPT) nhỏ kích th ớc lỗ rỗng, toàn phần hay bán phần lọt vào lỗ rỗng, cuối theo dòng chảy khỏi cột nh ng chậm trễ Dòng chảy pha động khiến phân tử lớn chui vào lỗ rỗng c a mạng gel, nhanh chóng xuyên qua cột, khỏi cột, phân tử nhỏ khỏi cột lâu cịn chui vào khỏi lỗ rỗng c a gel Nh vậy, thành phần khác c a hỗn hợp mẫu ngang qua cột sắc ký gel, khỏi cột lần l ợt theo trình tự TLPT lớn khỏi cột tr ớc, phân tử nhỏ khỏi cột sau 11 S c ký gel ph i thực hi n c t hình ng tr thu tinh, g m b c sau: -Nhồi gel vào cột: hạt gel tr ơng nở diện dạng huyền phù dung môi phù hợp cho vào cột Huyền phù đ ợc chỉnh cho thật sệt nh ng rót chảy vào cột thành dòng dễ dàng Cân cột cách cho dung môi giải ly chảy ngang qua cột, l ợng dung mơi tích 2-3 lần thể tích cột Kiểm tra chặt chẽ c a cột cách cho l ợng mẫu thử vào đầu cột mẫu thử th ờng đ ợc chọn dextran blue 2000, có màu xanh d ơng để đ ợc quan sát mắt th ờng di chuyển c a mẫu cột -Đặt mẫu cần sắc ký lên đầu cột gel: dung dịch mẫu cần phân tách phải đ ợc lọc bỏ hợp chất cịn dạng rắn, cặn Dung dịch mẫu hồ tan vào dung dịch đệm, đặt lên đầu cột giống nh sắc ký cột -Triển khai sắc ký gel: triển khai giải ly đơn giản, sử dụng kỹ thuật dung môi đơn nồng độ (nghĩa sử dụng loại dung môi hay hỗn hợp hai dung môi, bắt đầu kết thúc trình giải ly s dụng loại dung mơi đó) giải lycó thể trọng lực nh ng tốt sử dụng bơm đẩy từ đầu cột h ng dung mơi giải ly lọ nhỏ, lọ có thể tích định Các chất tan khỏi cột theo th tự TLPT giảm dần ¾ ng dụng: kỹ thuật dùng để tách đại phân tử có nguồn gốc sinh học nh : protein, polysaccharide, acid nuleic, enzyme, Ng ời ta ng dụng vào việc đóan TLPT c a hợp chất ch a biết II.6.6) S c ký lực Sắc ký lực hấp thụ phát lực sinh học mà phân tử sinh học có với phân tử khác đ ợc cố định pha ổn định Có nhiều ph ơng pháp để rửa giải phân tử lực có nhiều loại sắc ký lực khác nhau, b ớc theo gradient th ờng đ ợc sử dụng Th ờng sử dụng hệ thống có áp suất thấp Các giá thể (th ờng agarose) th ờng chịu đ ợc áp suất d ới 50psi Nh c m: đắt tiền, khó tẩy rửa, chọn lọc ligand (phối tử), gắn kết ligand lên giá thể hoạt hóa th ờng gặp nhiều khó khăn u m: phát triển ph ơng pháp tinh protein A (protein A antigen cho IgG), b ớc bắt giữ tốt, cho phép phân tách protein dạng ngun th y cịn họat tính với dạng biến tính 12 ™ Sử d ng s c ký lực cho t ơng tác kháng nguyên kháng th : ta tinh kháng nguyên chách cho mẫu qua cột có ch a giá thể liên kết với kháng thể để thu nhận protein Ng ợc lại, giá thể có liên kết với kháng nguyên chuyên biệt bắt giữ kháng thể chuyên biệt cho kháng nguyên ng dụng nhiều gắn kết protein A vào gel để gắn kết với globulin miễn dịch II.6.7) S c ký t ơng tác kỵ n c Sắc ký t ơng tác kỵ n ớc phuơng pháp bổ sung tốt cho kỹ thuật phân tách khác Trong năm gần đây, ph ơng pháp trở nên thông dụng nh b ớc trình sắc ký Loại hạt Macro-Prep có dẫn xuất nhóm kỵ n ớc, gốc methyl hay t-butyl Các gốc hấp dẫn gốc kỵ n ớc khác có bề mặt protein Khi cho mẫu protein vào điều kiện nồng độ muối cao ép phần kỵ n ớc lại gần đính với Quá trình rửa giải đ ợc thực cách giảm dần nồng độ muối phần kỵ n ớc lại vào dung dịch Đ c m: Phân tách phân tử theo tính kỵ n ớc c a phân tử Các nhóm kỵ n ớc khác đựợc cố đinh bề mặt giá thể D ới điều kiện nồng độ muối cao (thấp) CÁC phần kỵ n ớc phân tử t ơng tác nhóm cố định Các phân tử gắn kết đ ợc r a giải cách giảm áp lực ion hịa tan phân tử khỏi giá thể u m: Là b ớc cho phép cô mẫu, công suất cao, nhanh, mẫu đ ợc thu nhận nồng độ muối thấp Nh c m: số protein bị t a nồng độ muối cao, khó nâng cấp quy mơ lớn 13 II.6.8) S c ký khí Sắc ký khí ph ơng pháp đ ợc dùng để tách chất thể khí bay hơi, với pha động chất khí, gọi khí mang (carrier gas) Sắc ký khí cịn áp dụng cho chất khí, lỏng, rắn dễ bay bền nhiệt độ cao, có TLPT M2000 - Các thành phần c a máy sắc ký lỏng hiệu cao 1) Bình ch a dung môi Th ờng làm thuỷ tinh, làm thép không rỉ, ph ơng pháp rửa giải thơng th ờng cần bình ch a dung môi, ph ơng pháp rửa giải gradient th ờng dùng 2, 3, bình ch a dung môi khác hệ dung môi rửa giải hỗn hợp c a loại dung môi trộn lẫn với theo ti lệ đ ợc xác định Cần loại hạt khí hồ tan dung môi 2) Hệ thống bơm Bơm dùng ph ơng pháp phải tạo đ ợc áp suất cao (3000 - 6000 psi hay khoảng 250 500at), l u l ợng bơm khoảng 0,1 đến 10 ml/ph, phải trơ với dung môi Hệ thống bơm phải có khả bơm pha động qua cột áp suất cao mà không bị ngắt quãng tạo nhịp sóng làm sai lệch lực thu đ ợc Có nhiều kiểu bơm dùng máy HPLC; nh ng kiểu phông xoay chiều đ ợc dùng phổ biến 3) Hệ bơm mẫu (hệ tiêm mẫu) 16 Mẫu đ ợc bơm vào cột nhờ hệ thống van mẫu Ng ời ta bơm mẫu vào vịng mẫu với thể tích th ờng từ 10 đến 20 μl 4) Cột sắc ký Kiểu cột th ờng phụ thuộc vào ph ơng pháp dùng để tách, nh ng th ờng cột thép không gỉ, có cỡ lỗ xác đ ờng kính từ đến túm dài từ 10 đến 30cm (những cột dùng cho SEC đ ờng rộng dài đến 100cm) Loại cột có hiệu lực cao, có số (ra lý thuyết lên đến 100.000 đĩa cho 1m chiều dài cột) 5) Detector Là phận phát chất ch ng khỏi cột ghi nhận tín hiệu ghi sắc ký đồ Hiện sử dụng loại detector sau: Detector tử ngoại (UV): Dùng đèn thuỷ ngân cho vạch 254nm Nhiều chất hấp thụ b ớc sóng Detector tử ngoại khả kiến (UV-VIS): Dùng phổ quang kế lựa chọn b ớc sóng từ 195 đến 750 nm Loại đ ợc dùng nhiều Detector điện hố detector huỳnh quang có độ nhạy độ chọn lọc cao dùng phân tích vết Dùng detector điện hố phát đ ợc l ợng picrogam (10-12g) ™ Các ph ơng pháp s c ký hi u cao a) S c ký phân b hi u cao Gồm hai loại: Sắc khí lỏng - lỏng sắc ký pha liên kết - Sắc ký lỏng - lỏng (LLC): Pha tĩnh chất lỏng đ ợc bao bề mặt c a hạt chất mang, t c đ ợc hấp phụ chất mang - Sắc ký pha liên kết (BPC): Pha tĩnh đ ợc gắn hoá học với chất mang tạo liên kết siloxan nối nhóm - silic với silicagen b S c ký h p ph hi u cao (s c ký lỏng - r n LSC) Pha tĩnh chất rắn mà bề mặt có ch a nhóm hiđroxil phân cực, pha động dung môi không phân cực c) S c ký trao đ i ion hi u cao (IEC) Pha tĩnh rắn ch a nhựa trao đổi lớn d ới dạng bột mịn, pha động th ờng dung dịch n ớc d S c ký lỏng hi u cao gel (s c ký lo i cỡ SEC) Ph ơng pháp đ ợc ng dụng ch yếu cho chất có phân tử l ợng lớn Chất nhồi cho SEC hạt xốp c a silicagent hay polyme có kích th ớc nhỏ ( 10 μm) Pha tĩnh dung môi nằm lỗ xốp c a hạt, pha động dung môi chảy hạt Chỉ phân từ nhỏ khuếch tán vào lớp xốp, rửa giải phân tử lần l ợt theo cỡ từ lớn đến nhỏ 17 So Sánh Giữa K Thu t S c Ký Lỏng Cao Áp (HPLC) S c Ký Khí (GC) - Đ bay + HPLC: Không yêu cầu bay hơi, mẫu phải tan đ ợc pha động + GC: Mẫu phải bay đ ợc - Đ phân cực + HPLC: Tách đ ợc loại hợp chất phân cực không phân cực + GC: Mẫu phân cực không phân cực - Đ b n nhi t + HPLC: Phép phân tích đ ợc thực nhiệt độ thấp (nhiệt độ phòng hay thấp hơn) + GC: Mẫu buộc phải tồn nhiệt độ cao (nhiệt độ tách c a cột buồng tiêm mẫu) - Kh i l ng phân tử + HPLC: Khơng có giới hạn mặt lý thuyết, thực tế độ hoà tan giới hạn + GC: Đặc tr ng < 500 amu - Chuẩn b m u + HPLC: Mẫu buộc phải lọc, mẫu nên có dung mơi hồ tan nh pha động + GC: Dung môi phải bay có nhiệt độ sơi thấp chất phân tích - L ng m u + HPLC: L ợng mẫu phụ thuộc vào đ ờng kính (trong) c a cột + GC: Th ờng từ –5 μl - Cơ ch tách + HPLC: Thực pha động tĩnh + GC: Chỉ có pha động mang mẫu - Detecter – Đầu dò + HPLC: Thông dụng UV-VIS + GC: Thông dụng FID, dùng cho phân tích chất hữu 18 III K T LU N: Sắc ký kỹ thuật đ ợc ng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực giới Việt Nam tiếp cận kỹ thuật vào năm c a thập niên 80 Vì điều kiện sống ngày cao, nên đòi hỏi phải có cơng nghệ kỹ thuật đáp ng nhu cầu Bên cạnh có số ng ời, lợi nhuận cá nhân mà bất chấp tất Ngày nay, để kiểm soát kiểm tra tình hình chất l ợng hàng hố để đáp ng nhu cầu sống nh : thực phẩm, d ợc phẩm, hố chất… Vì kỹ thuật sắc ký có vai trị lớn cơng tác kiểm tra, giám sát chất l ợng mà kỹ thuật hoàn toàn đảm đ ơng đ ợc nh ng yêu cầu Ví dụ nh : kiểm tra d l ợng kháng sinh (nitrofuran, tetracycline…) thuỷ sản, kiểm tra d l ợng hoocmon (clenbuterol, salbutamol…) kích thích tăng tr ởng, tạo nạc cho gia súc, kiểm tra d l ợng màu bị cấm có thực phẩm mỹ phẩm nh : Sudan có tr ng gia cầm son mơi, MCPD (3_monoclo_propan_1,2_diol) có n ớc t ơng, formone có bánh phở, xác định số ph ơng pháp chế biến bảo quản nhằm loại trừ phát triển c a nấm mốc gây độc (có độc tố Aflatoxin) lơ hàng nông sản dự trữ xuất đặc biệt đậu t ơng lạc …Trong công nghiệp d ợc phẩm, sơn: Kiểm tra hàm l ợng hoạt chất d ợc phẩm, d luợng chất gây độc hại… Ngồi cịn ng dụng nhiều lĩnh vực khác nh quan trắc, mơi tr ờng… Vì vậy, với mục đích sử dụng mà ta chọn ph ơng pháp sắc ký phù hợp để phân tích mẫu t ơng ng IV) TÀI LI U THAM KH O 1) Nguyễn Kim Phi Phụng, Phương pháp cô lập chất hữu cơ, NXB ĐHQGTPHCM, 2007, Trang 151-451 2) Trần Nhật Ph ơng, Học phần kỹ thuật Công Nghệ Sinh Học- Proteomic/Sắc ký, 2008, 12trang 3) Nguyễn Tuấn Anh, Đỗ Thị Lan, Nguyễn Thế Hùng, Giáo trình phân tích môi trường, ĐH Nông Lâm Thái Nguyên, trang 49-59 4) Sắc ký giấy: http://www.chemguide.co.uk/analysis/chromatography/paper.html http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/C/Chromatography_paper.html http://en.wikipedia.org/wiki/file:cromatography_tank.png http://peer.tamu.edu/podium_poster_presentations/Paper% 20Chromatography.ppt 5) Sắc ký lớp mỏng: Piia Salo, Thin-Layer Chromatography with Ultravioletand Mass Spectrometric Detection: From Preparative-Layer to Miniaturized Ultra-Thin-Layer Technique ,Division of Pharmaceutical Chemistry Faculty of Pharmacy University of Helsinki, Finland http://www.waters.com/waters/nav.htm?locale=en_US&cid=10048919 http://www.chromatography-online.org/Principles/TLC-Apparatus/Chambers.html 6) Sắc ký cột: http://en.wikipedia.org/wiki/Column_chromatography 7) Sắc ký trao đổi ion: http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/ResourceCenter/Pr inciplesofChromatography/IonExchange/ 8) Sắc ký gel: http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/ResourceCenter/Pr inciplesofChromatography/SizeExclusion/ 9) Sắc ký t ơng tác kỵ n ớc: 19 http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/ResourceCenter/Pr inciplesofChromatography/HydrophobicInteraction/ 10) Sắc ký lực: http://fachschaft.biochemtech.uni-halle.de/downloads/chromatography/affchr.pdf http://www.separations.us.tosohbioscience.com/ServiceSupport/TechSupport/ResourceCenter/Pr inciplesofChromatography/Affinity/ 11) Sắc ký khí: http://en.wikipedia.org/wiki/Gas-liquid_chromatography http://teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gaschrm.htm http://www.chemistry.nmsu.edu/Instrumentation/GC_MS.html 12) Sắc ký lỏng cao áp: http://elchem.kaist.ac.kr/vt/chem-ed/sep/lc/hplc.htm 20