ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC GIAI ĐOẠN 2013 2018 "KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ PHỤC VỤ PHÁT TRIỂN BỀN VỮNG VÙNG TÂY BẮC" Mã số KHCN TB/13 18 BÁO CÁO TỔNG[.]
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC GIAI ĐOẠN 2013-2018 "KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ PHỤC VỤ PHÁT TRIỂN BỀN VỮNG VÙNG TÂY BẮC" Mã số: KHCN-TB/13-18 BÁO CÁO TỔNG HỢP ĐỀ TÀI: “Nghiên cứu phát triển (theo hướng GACP) bào chế số chế phẩm từ dược liệu Ô đầu, Ý dĩ, Tam thất, Đan sâm vùng Tây Bắc” Mã số: KHCN-TB.05C/13-18 Cơ quan chủ trì đề tài: Khoa Y Dược, ĐHQGHN Chủ trì đề tài: PGS.TS.Nguyễn Thanh Hải Hà Nội - 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC GIAI ĐOẠN 2013-2018 "KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ PHỤC VỤ PHÁT TRIỂN BỀN VỮNG VÙNG TÂY BẮC" Mã số: KHCN-TB/13-18 BÁO CÁO TỔNG HỢP ĐỀ TÀI “Nghiên cứu phát triển (theo hướng GACP) bào chế số chế phẩm từ dược liệu Ô đầu, Ý dĩ, Tam thất, Đan sâm vùng Tây Bắc” Mã số: KHCN-TB.05C/13-18 Chủ nhiệm đề tài: Cơ quan chủ trì đề tài: PGS.TS Nguyễn Thanh Hải PGS.TS Đinh Đồn Long Hà Nội - 2017 THÔNG TIN CHUNG Tên đề tài: “Nghiên cứu phát triển (theo hướng GACP) bào chế số chế phẩm từ dược liệu Ô đầu, Ý dĩ, Tam thất, Đan sâm vùng Tây Bắc” Mã số đề tài: KHCN-TB.05C/13-18 Thuộc: Chương trình (tên, mã số chương trình): Khoa học Cơng nghệ trọng điểm cấp Nhà nước, giai đoạn 2013-2018: “ Khoa Công nghệ phục vụ phát triển bền vững vùng Tây Bắc” Mã số chương trình: KHCN-TB/13-18 Chủ nhiệm đề tài: Họ tên: Nguyễn Thanh Hải Ngày, tháng, năm sinh: 11/08/1965 Giới tính: Nam Học hàm, học vị/ Trình độ chun mơn: Phó giáo sư, tiến sĩ Dược học Chức danh khoa học: Tiến sĩ Chức vụ: Phó Chủ nhiệm Khoa Y Dược, Chủ nhiệm Bộ mơn Bào chế Công nghệ Dược phẩm, Khoa Y Dược Điện thoại: Tổ chức : (04)37450166 Nhà riêng: (04)39710634 Mobile: 0913512599 Fax: 0437450188 E-mail: haipharm@yahoo.com Tên tổ chức công tác: Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Địa tổ chức: 144 Xuân Thủy - Cầu Giấy - Hà Nội Địa nhà riêng: Số 26/666, Đường Bạch Đằng, quận Hai Bà Trưng, tp.Hà Nội Tổ chức chủ trì đề tài: Tên tổ chức chủ trì đề tài: Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội Điện thoại: 0485876452 E-mail: smp@vnu.edu.vn Fax: 0437450188 Website: smp.vnu.edu.vn Địa chỉ: 144 Xuân Thủy- Cầu Giấy - Hà Nội Tên tổ chức chủ quản đề tài: Đại học Quốc gia Hà Nội Tên tổ chức chủ trì đề tài: Khoa Y Dược, ĐHQGHN Họ tên thủ trưởng tổ chức: PGS.TS Nguyễn Thanh Hải Số tài khoản: 3713 MSNS 1109888 Kho bạc Nhà nước Cầu Giấy-Hà Nội Cơ quan chủ quản đề tài: Đại học Quốc gia Hà Nội DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AC : Aconitin ACN : Acetonitril AUC : Diện tích đường cong nồng độ-thời gian (Area Under the Curve) DLTW : Dược liệu trung ương FDA : Cơ quan quản lý dược phẩm thực phẩm Hoa Kì (Food and Drug Administration) HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) LC/MS GC/MS : Sắc ký lỏng – Khối phổ (Liquid Chromatography – Mass spectrometry) : Sắc ký khí/ detector khối phổ (Gas Chromatography/Mass Spectrometry) LD50 : Lượng chất cần thiết để giết nửa số lượng động vật thí nghiệm sau quãng thời gian định sẵn (Lethal dose) MeOH : Methanol RSD : Độ lệch chuẩn tương đối ( Relative Standard Deviation) UV- Vis : Tử ngoại – khả kiến (Ultra Violet-Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tên Bảng Trang Một số alcaloid thuộc nhóm khác phân lập từ chi Aconitum 11 Bảng 1.2 Các hợp chất flavonoid phân lập từ ý dĩ 24 Bảng 1.3 Các hợp chất lignan phân lập từ ý dĩ 26 Bảng 1.4 Các hợp chất phenolic phân lập từ ý dĩ 26 Bảng 1.5 Nhóm hoạt chất phenol acid phenolicphân lập từ rễ chi 35 Salvia L Bảng 1.6 Nhóm hoạt chất diterpen chi Salvia L 36 Bảng 1.7 Các thành phần hoạt chất khác có chi Salvia L 37 Bảng 1.8 Một số Saponin thuộc nhóm PPD phân lập từ chi Panax 48 Bảng 1.9 Một số Saponin thuộc nhóm PPT phân lập từ chi Panax 49 Bảng 1.10 Một số Saponin thuộc nhóm Octillol phân lập từ chi Panax 50 Bảng 1.11 Một số Saponin thuộc nhóm OA phân lập từ chi Panax 51 Bảng 1.12 Sơ đồ chiết xuất phân lập saponin từ rễ tam thất 52 Bảng 2.1 Phân loại thành phần cấp hạt 62 Bảng 2.2 Các tiêu tiêu chuẩn sản phẩm theo DĐVN4 79 Bảng 3.1 Kết phân tích mẫu đất huyện Quản Bạ 83 Bảng 3.2 Kết phân tích mẫu đất huyện Đồng Văn 85 Bảng 3.3 Kết phân tích mẫu đất huyện Mù Cang Chải 89 Bảng 3.4 Kết phân tích mẫu đất huyện Bắc Hà 94 Bảng 3.5 Kết phân tích mẫu đất huyện Si Ma Cai 97 Bảng 3.6 Kết phân tích mẫu đất huyện Sa Pa 101 Bảng 3.7 Sự phát triển, suất chất lượng Ô đầu vùng 102 trồng huyện Đồng Văn tỉnh Hà Giang Bảng 3.8 Sự phát triển, suất chất lượng Ô đầu vùng 102 trồng huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang Bảng 3.9 Giống gieo trồng ảnh hưởng đến phát triển, suất chất lượng Ý dĩ vùng trồng huyện Bắc Hà, Lào Cai 103 Bảng 3.10 Giống gieo trồng ảnh hưởng đến phát triển, suất 103 chất lượng Ý dĩ huyện Mù Cang Chải, tỉnh Yên Bái Bảng 3.11 Khả sinh trưởng đan sâm 104 Bảng 3.12 Khả phát triển Đan sâm 104 Bảng 3.13 Sự phát triển, suất chất lượng Tam thất vùng 105 trồng huyện Si Ma Cai, tỉnh Lào Cai Bảng 3.14 Sự phát triển, suất chất lượng Tam thất vùng 105 trồng huyện Đồng Văn tỉnh Hà Giang Bảng 3.15 Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR phổ DEPT chất OD7 125 Bảng 3.16 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất OD5 128 Bảng 3.17 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất OD8 130 Bảng 3.18 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất OD9 132 Bảng 3.19 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất OD10 134 Bảng 3.20 Số liệu phổ 1H-NMR 13C-NMR chất OD6 139 Bảng 3.21 Tỷ lệ chuột chết lô chuột uống phân đoạn D 142 Bảng 3.22 Tỷ lệ chuột chết lô chuột uống phân đoạn E 143 Bảng 3.23 Tỷ lệ chuột chết lô chuột uống PĐ I 144 Bảng 3.24 Ảnh hưởng PĐ E lên thời gian phản ứng với nhiệt độ 146 chuột nhắt trắng Bảng 3.25 Tác dụng giảm đau PĐ E chuột nhắt trắng 147 phương pháp gây đau máy tail-flick Bảng 3.26 Ảnh hưởng PĐ E lên số quặn đau chuột nhắt 148 trắng Bảng 3.27 Ảnh hưởng thuốc thử lên trọng lượng tuyến ức tương đối 150 Bảng 3.28 Ảnh hưởng thuốc thử lên số lượng bạch cầu 150 Bảng 3.29 Ảnh hưởng thuốc thử lên nồng độ IgG máu ngoại vi 151 Bảng 3.30 Ảnh hưởng thuốc thử đến phản ứng bì với kháng nguyên 151 OA Bảng 3.31 Ảnh hưởng thuốc thử đến nồng độ IL-2 152 Bảng 3.32 Ảnh hưởng thuốc thử đến nồng độ TNF-α 153 Bảng 3.33 Kết giải phẫu vi thể tuyến ức 153 Bảng 3.34 Số liệu phổ NMR chất PG1 158 Bảng 3.35 Số liệu phổ NMR hợp chất PG2 159 Bảng 3.36 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn n-Hexane chiết từ Ý 167 dĩ Bảng 3.37 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn etyl acetate chiết từ Ý dĩ 167 Bảng 3.38 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn butanol chiết từ Ý dĩ 168 Bảng 3.39 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn H2O chiết từ Ý dĩ 168 Bảng 3.40 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn Etanol chiết từ Ý dĩ 168 Bảng 3.41 Phần trăm ức chế enzyme tyrosinase phân đoạn dịch chiết ý dĩ 172 Bảng 3.42 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn n-Hexane chiết từ 185 Đan sâm Bảng 3.43 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn etyl acetate chiết từ 185 Đan sâm Bảng 3.44 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn butanol chiết từ Đan sâm 185 Bảng 3.45 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn H2O chiết từ Đan sâm 186 Bảng 3.46 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn Etanol chiết từ Đan 186 sâm Bảng 3.47 Kết ly giải huyết khối in vitro 187 Bảng 3.48 Kết thời gian APPT, PT TT phân đoạn chiết từ Đan sâm in vivo 188 Bảng 3.49 Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết 189 Đan sâm Bảng 3.50 IC50 phân đoạn dịch chiết từ rễ Đan sâm 190 Bảng 3.51 Kích thước khối u nhóm chuột theo thời gian 190 Bảng 3.52 Trọng lượng thể nhóm chuột 192 Bảng 3.53 Trọng lượng khối u kết thúc thí nghiệm 192 Bảng 3.54 Số liệu phổ 1H 13C-NMR phần aglycon hợp chất GC-1 197 Bảng 3.55 Số liệu phổ 1H 13C-NMR phần đường hợp chất GC-1 198 Bảng 3.56 Số liệu phổ 1H 13C-NMR phần aglycon hợp chất GC-2 200 Bảng 3.57 Số liệu phổ 1H 13C-NMR phần đường hợp chất GC-2 201 Bảng 3.58 Số liệu phổ 1H 13C-NMR phần aglycon hợp chất GC-3 203 Bảng 3.59 Số liệu phổ 1H 13C-NMR phần đường hợp chấtGC-3 204 Bảng 3.60 Số liệu phổ 1H 13C-NMR phần aglycon hợp chất GC-4 206 Bảng 3.61 Số liệu phổ 1H 13C-NMR phần đường hợp chất GC-4 206 Bảng 3.62 Số liệu phổ 1H 13C-NMR phần aglycon hợp chất GC-5 208 Bảng 3.63 Số liệu phổ 1H 13C-NMR phần đường hợp chất GC-5 209 Bảng 3.64 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn n-Hexane chiết từ 210 Tam thất Bảng 3.65 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn etyl acetate chiết từ Tam thất 210 Bảng 3.66 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn butanol chiết từ Tam 210 thất Bảng 3.67 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn H2O chiết từ Tam thất 211 Bảng 3.68 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn Etanol chiết từ Tam thất 211 Bảng 3.69 Giá trị mật độ quang học (OD), tỷ số tăng sinh (A%) giá trị IC50 216 Bảng 3.70 Giá trị mật độ quang học (OD), tỷ số tăng sinh (A%) giá 216 trị IC50 Saponin Paclitaxel dòng TB ung thư HCT116 Bảng 3.71 Giá trị mật độ quang học (OD), tỷ số tăng sinh (A%) giá 217 trị IC50 phân đoạn saponin Paclitaxel dòng TB ung thư H460 Bảng 3.72 Giá trị mật độ quang học (OD), tỷ số tăng sinh (A%) giá 218 trị IC50 phân đoạn saponin Paclitaxel dịng TB ung thư BT474 Bảng 3.73 Kích thước khối u nhóm chuột theo thời gian 219 Bảng 3.74 Trọng lượng thể nhóm chuột (g) 220 Bảng 3.75 Trọng lượng khối u 221 Bảng 3.76 Tác dụng Saponin lên số công thức máu (n=5) 227 Bảng 3.77 Đánh giá tiêu chuẩn cồn thuốc chứa Ô đầu bảo quản 235 điều kiện thường Bảng 3.78 Đánh giá tiêu chuẩn cồn thuốc chứa Ô đầu bảo quản điều kiện lão hóa cấp tốc 236 Bảng 3.79 Đánh giá tiêu chuẩn cao ý dĩ Ý bảo quản điều kiện thường 239 Bảng 3.80 Đánh giá tiêu chuẩn cao ý dĩ bảo quản điều kiện lão hóa cấp tốc 240 Bảng 3.81 Ảnh hưởng yếu tố số lần chiết đến trình chiết 257 Bảng 3.82 Ảnh hưởng yếu tố thời gian chiết đến trình chiết 257 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cấu trúc alcaloid C18-diterpenoid Hình 1.2 Cấu trúc khung C19-diterpenoid alcaloid Hình 1.3 Hình 1.3 Một số alcaloid thuộc nhóm C19-diterpenoid alcaloid Hình 1.4 Khung C20-diterpenoid alcaloid Hình 1.5 Cấu trúc số alcaloid thuộc nhóm C20-diterpen alcaloid 10 Hình 1.6 Khung cấu trúc nhóm Alcaloid bisditerpenoid 11 Hình 1.7 Khung cấu trúc chung nhóm dẫn chất quercetin kaempferol 12 Hình 1.8 Một số hình ảnh thuốc sản xuất từ số loài thuộc chi 19 Aconitum Hình 1.9 Hình ảnh lồi Coix lacryma-jobi L var lacryma-jobi 20 Hình 1.10 Hình ảnh lồi Coix lacryma-jobi L var stenocarpa Stapf 21 Hình 1.11 Hình ảnh lồi Coix lacryma-jobi L var ma-yuen Stapf 21 Hình 1.12 Cấu tạo vỏ hạt ý dĩ 22 Hình 1.13 Một số hình ảnh sản phẩm chứa ý dĩ 32 Hình 1.14 Một số hình ảnh sản phẩm chứa đan sâm 43 Hình 1.15 Cấu trúc nhóm PPD 48 Hình 1.16 Cấu trúc nhóm PPT 49 Hình 1.17 Sơ đồ chiết xuất phân lập saponin từ rễ tam thất 53 Hình 1.18 Một số hình ảnh sản phẩm chứa tam thất 58 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tác dụng tăng cường miễn dịch 68 Hình 3.1 Bản đồ huyện Quản Bạ - tỉnh Hà Giang 81 Hình 3.2 Bản đồ Huyện Đồng Văn – Tỉnh Hà Giang 84 Hình 3.3 Bản đồ Huyện Mù Cang Chải – Tỉnh Yên Bái 87 Hình 3.4 Bản đồ Huyện Bắc Hà – Tỉnh Lào Cai 91 Hình 3.5 Bản đồ Huyện Si Ma Cai – Tỉnh Lào Cai 95 Hình 3.6 Bản đồ Huyện Sa Pa – Tỉnh Lào Cai 99 Hình 3.7 Một số hình ảnh đầu 108 Hình 3.8 Một số hình ảnh ý dĩ 110 tín hiệu proton elefin 02 proton nhóm oxymethylene xác định tín hiệu cộng hưởng δ 9,31 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-1), 8,32 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-6), 7,77 (1H, d, J = 8,4 Hz, H-7), 7,59 (1H, dd, J = 9,2, 6,8 Hz, H-2), 7,41 (1H, d, J = 6,8 Hz, H-3), 4,98 (1H, t, J = 9,6 Hz, H-16a) 4.44 (1H, dd, J = 9,6, 6,4 Hz, H-16b) Các tín hiệu cộng hưởng δ 2,71 (3H, s, H-18) 1.42 (3H, d, J = 6,8 Hz, H-17) khẳng định tồn nhóm metyl bậc nhóm vinyl metyl Phổ 13 C NMR xuất tín hiệu 18 cacbon Trong đó, nhóm oxymethylene nhóm oxo (C=O) khẳng định tín hiệu cộng hưởng δ 81,7 (C-16), 184,3 (C-11) 175,8 (C-12) Bên cạnh đó, phổ 13 C NMR 12 tín hiệu cộng hưởng olefin cacbon đặc biệt nhóm methyl đặc trưng tín hiệu cộng hưởng δ 18,9 (C-17) 29,7 (C-18) Phổ khối lượng ESI-MS xuất tín hiệu m/z 279 phù hợp với ion phân tử [M+H]+ C18H14O3 (M = 278) Từ tất phân tích nêu trên, với phù hợp hoàn toàn số liệu phổ NMR so với số liệu tương ứng công bố [54], [67] cho phép xác định cấu trúc hóa học dihydrotanshinone I Hợp chất (chất mới) Hình 3.40 Cấu trúc hóa học hợp chất Hợp chất phân lập dạng chất bột màu da cam, có giá trị quay o cực riêng [α]25 D = 42 (c 0.3, CHCl3) Công thức phân tử xác định C20H20O5 (M = 340) phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS m/z 341,11396 [M + H]+, tính tốn lý thuyết cho C20H21O5, 341,1389) Phổ 1H 13 C NMR chất có dạng tương tự chất Điều cho thấy hai hợp chất 179 có cấu trúc tương tự, nhóm diterpene tanshinone Phân tích cụ thể thấy khác biệt thuộc vòng A với xuất tín hiệu nhóm methylene (CH2) cacbon bậc tương ứng với tín hiệu cộng hưởng 13 C NMR DEPT δ 27,9 (C-1), 20,1 (C-2), 35,3 (C-3) 48,6 (C-4) tín hiệu proton có độ dịch chuyển hóa học δ 1,6-3,4 chất thay tín hiệu nối đơi chất Thêm xuất tín hiệu cacbon δ 176,8 (C-19) đặc trưng cho nhóm cacbonyl este (COOR) tín hiệu nhóm methoxy (-OCH3) qua tín hiệu δC 52,9 δH 3,57 gợi ý có mặt nhóm COOCH3 chất Tất số liệu độ chuyển dịch hóa học cacbon gán với số liệu proton tương ứng thông qua phổ chiều HMQC phần (2.2.2) Phân tích chi tiết phổ NMR chiều H-H COSY HMBC cho phép khẳng định vị trí, cấu trúc phần tồn phần đặc biệt vị trí nhóm este COOCH3 gắn vào C-4 Từ tất phân tích nêu trên, cấu trúc hóa học hợp chất xác định hình 2.3 Đây hợp chất có cấu trúc mới, lần phân lập từ thiên nhiên đặt tên methyldihydrotanshinoat Hợp chất 3: Trijuganone B Hình 3.41 Cấu trúc hóa học hợp chất Hợp chất phân lập dạng chất bột màu đỏ, có giá trị quay cực o riêng [α]25 D = 68 (c 0,8, CHCl3) Tương tự chất 2, phổ NMR mang đặc trưng diterpene tanshinone với tín hiệu cộng hưởng cacbonyl δC 184,9 (C-11) 176,2 (C-12) nhóm metyl [δC 19,8 (C-17)/δH 1,38 (3H, d, J = 6,4 Hz, H-17) δC 18,8 (C-18)/δH 2,07 (3H, br s, H-18) Phân tích cụ thể phổ NMR 180 thấy khác biệt so với vòng A với xuất nối đơi vị trí C-3/C-4 phù hợp với tín hiệu metyl vinyl δH 2,07 (3H, br s) Phổ khối ESIMS thể ion phân tử m/z 281 [M + H]+ phù hợp với công thức C18H16O3 (M = 280) Trên sở phân tích phù hợp số liệu công bố [84] cho phép xác định chất trijuganone Hợp chất 4: Cryptotanshinone Hình 3.42 Cấu trúc hóa học hợp chất Hợp chất phân lập dạng chất bột màu đỏ Phân tích phổ H 13 C NMR thấy diterpene tanshinone có khung 19 cacbon Phổ khối ESI-MS thể tín hiệu ion m/z 297 phù hợp với ion phân tử cryptotanshinone C19H20O3 (M = 296) Theo gợi ý nêu với phù hợp phổ 1H 13C với số liệu cơng bố [90] giúp khẳng định xác chất Cryptotanshinone 2.3.5 Hợp chất 5: 2β-hydroxypomolic acid Hình 3.43 Cấu trúc hóa học hợp chất 181 Hợp chất thu dạng bột màu trắng Trên phổ ESI-MS xuất peak ion 489 [M+H]+ phù hợp với công thức phân tử C30H48O5 Phổ 1H NMR mang đặc điểm đặc trưng hợp chất triterpene khung ursane với tín hiệu nhóm methyl bậc δ 1,68 (3H, s), 1,45 (3H, s), 1,28 (3H, s), 1,25 (3H, s), 0,98 (3H, s), 0,92 (3H, s) nhóm metyl bậc đặc trưng δ 1,16 (3H, d, J = 4,0 Hz, H-30) Trên phổ xác nhận có mặt proton olefin δ 5,20 (1H, br s, H-12) proton oxymetin δ 3,86 (1H, ddd, J = 11,2, 9,6, 4,0 Hz, H-2α) 3,23 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-3α) Phổ 13C NMR xuất 30 tín hiệu cacbon khung triterpene C30, có cacboxylic cacbon trường thấp δ 182,3 (28-COOH), olefin cacbon δ 129,3 (C-12), 140,0 (C-13) đặc trưng nối đôi C-12/C-13 với oxymetin cacbon δ 67,1 (C-2) 80,1 (C-3) [91] Từ kiện phổ kết hợp với so sánh số liệu phổ 1H 13C NMR 2β-hydroxypomolic acid công bố tài liệu thấy hoàn toàn phù hợp [5] Như hợp chất xác định 2β-hydroxypomolic acid, lần phân lập từ Đan sâm Hợp chất 6: Maslinic acid Hình 3.44 Cấu trúc hóa học hợp chất Hợp chất phân lập dạng bột màu trắng Phổ khối ESI-MS xuất píc ion m/z 473 phù hợp với công thức phân tử C30H48O4 (M = 472) Dựa vào đặc điểm phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phần 2.2.6) cho phép dự đoán hợp chất triterpene khung oleane [8] Trên phổ 1H NMR xuất tín hiệu proton olefin δ 5,41 (1H, br s, H-12); proton oxymethine δ 3,96 (1H, 182 ddd, J = 11,2, 9,6, 4,0 Hz, H-2β) 3.25 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-3α) với tín hiệu metyl bậc δ 1,27 (3H), 1,08 (3H), 1,01 (6H), 0,98 (3H) 0,94 (3H) (s, CH3) đặc trưng cho triterpene khung oleane có nhóm oxymethine C-2 C-3 Phổ 13 C NMR có 30 tín hiệu cộng hưởng nguyên tử cacbon khung triterpene C30, có cacboxylic cacbon δ 181,4 (C-28), hai olefin cacbon δ 122,9 (C-12) 144,7 (C-13) oxymethine cacbon δ 69,1 (C-2) 84,0 (C-3) thêm khẳng định cấu trúc triterpene oleane có hai nhóm hydroxyl vị trí 3, nhóm cacboxylic vị trí 28 nối đơi C-12/C-13 Căn vào độ dịch chuyển hóa học tương tác phổ cộng hưởng từ hạt nhân kết hợp so sánh với số liệu hợp chất maslinic acid tài liệu tham khảo [90], hợp chật phân lập nghiên cứu maslinic acid Hợp chất lần phân lập từ Đan sâm Hợp chất 7:Asiatic acid Hình 3.45 Cấu trúc hóa học hợp chất Hợp chất thu dạng chất bột màu trắng có điểm chảy (Mp) 301oC Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13 C NMR mang đặc trưng triterpene khung ursane giống hợp chất 2β-hydroxypomolic acid (5) Phổ 1H NMR thể tín hiệu proton olefin δ 5,23 (1H, br s, H-12); proton oxymethine δ 3.72 (1H, ddd, J = 11,6, 9,6, 4.4 Hz, H-2β) 3,36 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-3α); proton đặc trưng cho nhóm –CH2O- δ 3,64 (1H, d, J = 10,8 Hz, H23a) 3,40 (1H, d, J = 10,8 Hz, H-23b) với tín hiệu nhóm metyl bao gồm nhóm bậc [δ 1.16 (3H, s), 1,09 (3H, s), 1.00 (3H, s), 0.94 (3H, s)] nhóm bậc [δ 0,96 (3H, d, J = 6,0 Hz) 0,85 (3H, d, J = 6,0 Hz)] đặc trưng cho triterpene 183 khung ursane có nhóm -OH C-2 C-3 tương tự chất nhóm -CH2OH thay cho nhóm –CH3 [8] Phổ 13 C NMR DEPT xuất tín hiệu cộng hưởng 30 nguyên tử cacbon có cacbon cacboxylic δ 183,2 (C-28), cacbon nối đôi δ 125,1 (C-12) δ 139,4 (C-13), cacbon oxymethin [δ 68,9 (C-2) 83,8 (C-3)] nhóm cacbon oxymethylene δ 72,3 (C-23) Từ liệu phân tích kết hợp so sánh với số liệu công bố tài liệu tham khảo [90], hợp chất xác định asiatic acid, triterpene lần phân lập từ loài Đan sâm Hợp chất 8: Ursolic acid Hình 3.46 Cấu trúc hóa học hợp chất Hợp chất thu chất bột màu trắng xác định cấu trúc dựa số vật lý, số liệu phổ khối phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13C NMR phần 2.2.8 Tương tự chất 7, phổ NMR chất mang đặc trưng triterpen khung ursane [90] Phổ 13C NMR xuất tín hiệu cộng hưởng nhóm acid cacboxylic (COOH) δ 181,1 (C-28), hai olefin cacbon nối đôi C-12/C-13 δ 126,0 (C-12) 138,7 (C-13) oxymethine cacbon δ 79,1 (C-3) Kết hợp so sánh với số liệu phổ 13C NMR, điểm chảy độ quay cực hợp chất với hợp chất ursolic acid thấy hoàn toàn phù hợp [91], cho phép xác định hợp chất ursolic acid thành phần hóa học cơng bố từ Đan sâm 3.2.3.2.Kết độc tính cấp phân đoạn 184 Kết thử độc tính cấp phân đoạn dịch chiết từ Đan sâm trình bày bảng đây: Bảng 3.42 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn n-Hexane chiết từ Đan sâm STT n Liều thử PĐ n- Tỷ lệ chuột chết lô (%) Hexane (g/kg) 10 10 10 12 10 15 10 18 Bảng 3.43 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn etyl acetate chiết từ Đan sâm STT n Liều thử PĐ etyl Tỷ lệ chuột chết lô (%) acetate (g/kg) 10 10 10 12 10 15 10 18 Bảng 3.44 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn butanol chiết từ Đan sâm STT n Liều thử PĐ Tỷ lệ chuột chết lô (%) butanol (g/kg) 10 10 10 12 10 15 10 18 185 Bảng 3.45 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn H2O chiết từ Đan sâm STT n Liều thử PĐ H2O Tỷ lệ chuột chết lô (%) (g/kg) 10 10 10 12 10 15 10 18 Bảng 3.46 Số liệu thử độc tính cấp phân đoạn Etanol chiết từ Đan sâm STT n Liều thử PĐ Etanol Tỷ lệ chuột chết lô (%) (g/kg) 10 10 10 12 10 15 10 18 Kết bảng cho thấy sau uống phân đoạn với liều cao tương đương với 18 g dịch chiết phân đoạn/kg trọng lượng, chuột hoạt động bình thường, sau 72 khơng có chuột chết Khi kết thúc ngày thí nghiệm, mổ chuột lơ thấy tim, thận tươi nhuận; dày, ruột hết dịch chiết Đan sâm Không nhận thấy biểu ngộ độc chuột thí nghiệm ngày theo dõi Ở lơ từ lô 1-lô (tương ứng với liều phân đoạn g /kg đến liều 12 g/kg), chuột ăn uống, vận động bình thường, khơng bị khó thở, ngồi phân khơ Ở lơ lơ (tương ứng với với liều 15 g đến 18 g), số chuột có tượng ỉa chảy vịng 24 sau uống, ngày sau bình thường Chuột nhắt cho uống dịch chiết lỏng phân đoạn dịch chiết Đan sâm nồng độ đậm đặc nhất, thể tích tối đa 0,25 ml/4,5 g số lần tối đa lần vòng 186 24 giờ, tương đương 18 g/kg thể trọng chuột Theo hướng dẫn WHO hướng dẫn nghiên cứu thuốc Đan sâm dược liệu an tồn 3.2.3.3 Tác dụng sinh học * Xác định kết tác dụng chống huyết khối: Kết bao gồm thời gian thromboplastin hoạt hóa phần (APTT), thời gian prothrombin (PT) thời gian thrombin (TT) huyết tương nghèo tiểu cầu chuột cống Kết % ly giải huyết khối in vitro phân đoạn dịch chiết trình bày bảng 3.47 Bảng 3.47 Kết ly giải huyết khối in vitro (n=15) Khối lượng Khối lượng trung bình cục trung bình cục % ly giải máu đông trước máu đông bị ly huyết khối ly giải (mg) giải (mg) Đối chứng (1) 574,2 ± 32,1 25,9 ± 2,7 4,52 Streptokinase (2) 532,5 ± 32,7 476,3 ± 15,8* 89,45* P2-1< 0,001 EtOH (3) 550,3 ± 15,8 126,9 ± 16,2* 23,05* P3-1< 0,001 n-hexan (4) 529,0 ± 24,1 63,4 ± 35,0* 11,99* P4-1< 0,05 EtOAc (5) 511,4 ± 32,6 167,7 ± 14,7* 32,78* P5-1< 0,001 BuOH (6) 532,0 ± 21,7 210,5 ± 24,5* 39,56* P6-1< 0,001 Mẫu thử p * Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng (p < 0,05) Nhận xét: Trong xét nghiệm đánh giá khả tan huyết khối in vitro cách sử dụng phương pháp ly giải cục máu đông, phân đoạn BuOH EtOAc cho thấy tác dụng phần trăm ly giải cục máu đông cao 39,56% 32,78% so với chuẩn dương streptokinase 89,45% Phần trăm ly giải cục máu đông phân đoạn dịch chiết khác có ý nghĩa so với so sánh với đối chứng Điều chứng tỏ 187 phân đoạn dịch chiết từ Đan sâm có khả làm tan huyết khối *Tác dụng tan huyết khối in vivo Tác dụng tan huyết khối in vivo đánh giá dựa thông số đông máu TT (thrombin time), (thromboplastin time), APTT (activated partial thromboplastin time) Nếu thông số bị kéo dài lâu phân đoạn có khả làm tan huyết khối máu lâu bị đơng Kết trình bày bảng 3.48 Bảng 3.48 Kết thời gian APPT, PT TT phân đoạn chiết từ Đan sâm in vivo (n=10) Nhóm APTT (s) PT (s) TT (s) p Đối chứng (1) 17,34 ± 0,25 13,21 ± 0,67 27,92 ± 0,34 Streptokinase (2) 27,52 ± 0,31* 19,24 ± 0,14* 45,32 ± 0,53* P 2-1< 0,001 EtOH (3) 24,12 ± 0,14* 16,21 ± 0,45* 32,42 ± 0,63* P3-1< 0,001 Hexan (4) 21,23 ± 0,29 14,24 ± 0,52 28,56 ± 0,44 P4-1> 0,05 EtOAc (5) 25,48 ± 0,38* 17,64 ± 1,32* 34,18 ± 0,87* P5-1< 0,001 BuOH (6) 26,29 ± 0,53* 18,82 ± 0,35* 34,89 ± 0,76* P6-1< 0,001 Tải FULL (422 trang): https://bit.ly/3fQM1u2 Dự phòng: fb.com/KhoTaiLieuAZ * Khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nhóm đối chứng (p < 0,05) Nhận xét: Dựa kết bảng 3.48., quan sát thấy phân đoạn dịch chiết có thời gian đơng máu (APTT, PT TT) theo thứ tự giảm dần sau: BuOH > EtOAc > EtOH > n-hexan So với mẫu chứng, phân đoạn dịch chiết BuOH EtOAc làm tăng thời gian APTT, PT TT có ý nghĩa thống kê Huyết khối hình thành gắn kết tiểu cầu vùng bị tổn thương bề mặt tế bào nội mơ Q trình huyết khối bắt đầu tiểu cầu kích hoạt hình thành liên kết tiểu cầu liên kết với tế bào bạch cầu tạo thành phức 188 hợp Đông máu không kết trình phức tạp mà bắt đầu cách kích hoạt yếu tố nội sinh ngoại sinh đường chung mà trình có liên quan đến q trình điều hịa tương tác tiểu cầu, yếu tố đông máu thành mạch máu [35] Trong xét nghiệm đông máu, thời gian thromboplastin hoạt hóa phần (APTT) sử dụng để đánh giá yếu tố đông máu nội sinh, thời gian prothrombin (PT) sử dụng để đánh giá yếu tố đông máu ngoại sinh, thời gian thrombin (TT) để đánh giá hình thành fibrin [35] Kết cho thấy phân đoạn dịch chiết, đặc biệt phân đoạn BuOH, có khả kéo dài thơng số đơng máu APTT, PT TT có ý nghĩa thống kê so với nhóm chứng Cơ chế chống huyết khối phân đoạn dịch chiết liên quan đến ức chế yếu tố nội sinh, ngoại sinh q trình đơng máu hình thành fibrin Kết nghiên cứu phù hợp với nghiên cứu tác dụng chống huyết khối in vitro in vivo Đan sâm công bố [21], [40] Theo tác giả Yang Seun-Ah cộng dịch chiết methanol Đan sâm kéo dài đáng kể thông số APTT, PT in vitro nhờ vào khả quét gốc tự nghiên cứu tác dụng chống huyết khối in vitro in vivo Đan sâm công bố Tác dụng chống huyết khối Đan sâm liên quan đến khả chống kết tập tiểu cầu thành phần acid salvianolic A gây Cơ chế liên quan đến khả làm tăng AMP vòng Điều giải thích tác dụng chống huyết khối cao phân đoạn BuOH so với phân đoạn khác *Tác dụng chống ung thư: -Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết: Qua nghiên cứu thực nghiệm, thu số kết sau: Phân đoạn dịch chiết EtOH, Hexane, EtOAc, BuOH thử đánh giá dòng tế bào ung thư vú cho kết sau: Bảng 3.49 Hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn dịch chiết Đan sâm TT Mẫu % ức chế nồng độ thử 189 10µg/mL 1µg/mL EtOH 20 Hexan 3 EtOAc 26 BuOH 36 10 Kết cho thấy dịch chiết BuOH thể hoạt tính gây độc tế bào phân đoạn khác có hoạt tính gây độc tế bào yếu dòng tế bào ung thư vú nồng độ thử - Giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết Bảng 3.50 IC50 phân đoạn dịch chiết từ rễ Đan sâm STT Ký hiệu Nồng độ ức chế 50% phát triển tế bào ung thư phân đoạn vú IC50 (µg/mL) EtOH 23,80 n-Hexan >60 EtOAc 19,20 BuOH 13,80 Qua kết Bảng 3.50 cho thấy phân đoạn chứa nhiều saponin (phân đoạn BuOH) có tác dụng tốt phân đoạn cịn lại có chứa saponin Điều chứng tỏ có liên quan thành phần saponin tác dụng chống ung thư Kết phân đoạn dịch chiết Đan sâm ức chế phát triển khổi u trình bày bảng 2.1 hình 2.1 Các phân đoạn dịch chiết từ Đan sâm thể tác dụng ngăn ngừa phát triển khối u, phân đoạn n-Hexane có tác dụng phát triển khối u cao (42%), sau phân đoạn etyl acetate (33%), buthanol (31%) ethanol (29%) sau tuần Bảng 3.51: Kích thước khối u nhóm chuột theo thời gian Nhóm Bắt đầu Tuần Tuần Tuần Tuần Chứng 25,2 ± 2,4 37,3±3,7 64,4±4,7 98,2± 5,9 112,6±4,1 190 n-Hexane 25,1 ± 1,1 27,1 ± 2,6 38,2 ± 2,7 56,3 ± 2,7 65,7 ±3,4 (42%) EtOAc 25,5 ± 3,2 34,7 ± 2,2 47,6 ± 1,3 69,4 ± 1,8 79,3 ±2,7 (29%) BuOH 25,6 ± 1,7 32,2± 3,4 45,2 ± 1,6 67,2± 2,3 75,1 ±3,4 (33%) EtOH 25,3 ± 2,3 30,3 ± 1,2 49,7 ± 2,1 71,8 ± 1,8 77,4 ±2,7 (31%) Tải FULL (422 trang): https://bit.ly/3fQM1u2 Dự phòng: fb.com/KhoTaiLieuAZ Trọng lượng thể Trên nhóm chuột, khơng có khác nhóm điều trị Trọng lượng thể nhóm điều trị phân đoạn dịch chiết n-Hexane, EtOAc, BuOH EtOH so với nhóm chứng trước sau điều trị khơng khác có ý nghĩa thống kê Khơng có khác biệt nhóm thời điểm đo Điều cho thấy với liều 100 mg/kg thể trọng chuột điều trị với phân đoạn dịch chiết Đan sâm an tồn, khơng ảnh hưởng tới trọng lượng thể chuột 120 Kích thước khối u mm3 100 Control n-Hexane EtOAc BuOH EtOH 80 60 40 20 Tuần Hình 3.47 Sự phát triển kích thước khối u theo thời gian Bảng 3.52 Trọng lượng thể nhóm chuột (g) Tuần Tuần Tuần Tuần Nhóm chứng 184,3 ± 2,14 194,2 ± 1,52 207,9 ± 2,27 226,6 ± 2,35 n-Hexane 185,6 ± 3,25 196,5 ± 3,57 210,4 ± 3,47 230,2 ± 3,47 191 EtOAc 184,1± 2,15 197, 6± 2,65 213,2 ± 1,34 231,5 ± 1,43 BuOH 186,8± 1,28 196,9 ± 3,49 213,4 ± 1.47 232,1 ± 4,14 EtOH 185,4 ± 2,54 198,3 ± 3,18 212,1 ± 3,91 231,3 ± 2,37 Trọng lượng khối u Trọng lượng khối u thời điểm cuối ngày thí nghiệm trình bày bảng 3.52 Theo kết quả, trọng lượng khối u nhóm điều trị phân đoạn dịch chiết n-Hexane so với nhóm chúng khác có ý nghĩa thống kê Trọng lượng khối u nhóm điều trị phân đoạn dịch chiết ethanol, buthanol, etyl acetate giảm so với nhóm chứng khơng khác có ý nghĩa thống kê Điều cho thấy với liều 100 mg/kg thể trọng chuột điều trị với phân đoạn dịch chiết Đan sâm có khả giảm trọng lượng khối u đặc biệt phân đoạn n-Hexane Tải FULL (422 trang): https://bit.ly/3fQM1u2 Dự phòng: fb.com/KhoTaiLieuAZ Bảng 3.53 Trọng lượng khối u kết thúc thí nghiệm Nhóm Trọng lượng (g) Nhóm chứng 5,32 ± 0,45 n-Hexane 3,13 ± 0,37 EtOAc 4,24 ± 0,29 BuOH 4,12 ± 0,31 EtOH 4,17 ± 0,26 *Tác dụng tăng tuần hoàn Kết saponin toàn phần Tam thất phân đoạn dịch chiết Đan sâm ức chế kết tập tiểu cầu in vitro in vivo trình bày hình 3.48 hình 3.49 Theo kết hình 3.48 saponin toàn phần Tam thất phân đoạn dịch chiết Đan sâm có tác dụng ức chế kết tập tiểu cầu gây ADP Ngoài kết hợp saponin tồn phần Tam thất Đan sâm tác dụng ức chế tiểu cầu tăng mạnh hẳn dùng độc lập thành phần Điều chứng tỏ hai thành phần có tác dụng hiệp đồng với 192 Hình 3.48 Phần trăm ức chế kết tập tiểu cầu saponin toàn phần Tam thất phân đoạn dịch chiết Đan sâm in vitro Hình 3.49 Phần trăm ức chế kết tập tiểu cầu saponin toàn phần Tam thất phân đoạn dịch chiết Đan sâm in vivo 3.2.4 Cây Tam thất 3.2.4.1 Kết nghiên cứu thành phần hóa học Tam thất * Chiết xuất, phân lập tinh chế thành phần saponin từ Tam thất Mẫu củ Tam thất (500 g) sau rửa sạch, phơi khô, xay-nghiền nhỏ chiết siêu âm 40oC dung môi ethanol 80%, chiết lần (lần 1: 700 mL, lần 193 6837308 ... ? ?Nghiên cứu phát triển (theo hướng GACP) bào chế số chế phẩm từ dược liệu Ô đầu, Ý dĩ, Tam thất, Đan sâm vùng Tây Bắc? ?? thực nhằm mục tiêu sau: Nghiên cứu phát triển nguồn cung cấp dược liệu chuẩn (theo. .. thất, Đan sâm Nghiên cứu phát triển phương thức sử dụng dược liệu Ô đầu, Ý dĩ, Tam thất, Đan sâm làm thuốc Nghiên cứu đề xuất mô hình phát triển bền vững dược liệu Ơ đầu, Ý dĩ, Tam thất, Đan sâm. .. tài: ? ?Nghiên cứu phát triển (theo hướng GACP) bào chế số chế phẩm từ dược liệu Ô đầu, Ý dĩ, Tam thất, Đan sâm vùng Tây Bắc? ?? Mã số đề tài: KHCN-TB.05C/13-18 Thuộc: Chương trình (tên, mã số chương