Chiết tách, xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết của lá và hạt cây chùm ngây

1 MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Việt Nam nằm vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trung bình năm khác địa phương…Nhờ yếu tố địa hình khí hậu đa dạng, nước ta có thảm thực vật phong phú nguồn cối với giá trị dinh dưỡng, làm thuốc dồi Việc sử dụng loại thuốc thảo dược theo cách cổ truyền hay từ hợp chất nguồn gốc tự nhiên có xu hướng ngày tăng chiếm vị trí quan trọng y học Chế phẩm thảo dược dù có loại dược liệu lại hỗn hợp nhiều hợp chất khác trường hợp hầu hết chưa xác định rõ hoạt chất chất Vì vậy, thuốc sử dụng thảo dược đối tượng nhà khoa học nghiên cứu cách đầy đủ chất hoạt chất có cỏ thiên nhiên Trên sở nhận thức tầm quan trọng công dụng làm thuốc cỏ có nước ta, tơi chọn lồi có nhiều giá trị kinh tế, đặc biệt làm thuốc, chùm ngây họ chùm ngây để nghiên cứu Cây chùm ngây có tên khoa học Moringa oleifera Lam, phân bố năm Hi Lạp, Ấn Độ, Ý… Các nghiên cứu giới cho thấy rằng, g/ nhiều quốc gia nhiệt đới cận nhiệt đới, biết đến sử dụng hàng ngàn chùm ngây vừa thực phẩm, vừa dược liệu quý Các phận động tim hệ thần kinh, chống u bướu, chống oxi hóa, bảo vệ gan, chống nám Dầu chùm ngây giàu vitamin A, C chất béo khơng bão hịa, có đặc tính khử trùng chống viêm, giúp chữa lành vết thương da vết cắt, vết bầm tím, bỏng, vết trùng cắn Lá chùm ngây hai tổ chức giới WHO FAO dùng giải pháp ưu việt cho Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N rễ, hạt, vỏ cây, hoa chùm ngây có hoạt tính kích thích hoạt bà mẹ thiếu sữa trẻ em suy dinh dưỡng, giải pháp lương thực cho giới thứ ba Hiện có khoảng 80 quốc gia giới trồng chùm ngây làm rau ăn Ở Việt Nam, trước đây, chùm ngây biết đến vị thuốc nam dùng để điều trị số bệnh thông thường dân gian Thế gần đây, nhờ phát y học, hoa, đặc biệt chùm ngây cịn ăn bổ dưỡng cho thể nên nhiều địa phương bắt đầu trồng, kinh doanh loại rau Với tính đa dạng phong phú thế, nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học, ứng dụng phương pháp xác định cấu trúc nghiên cứu hoạt tính sinh học số hợp chất có chùm ngây Việt Nam hướng nghiên cứu có nhiều triển vọng, có ý nghĩa khoa học thực tiễn Vì tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học số dịch chiết hạt chùm ngây ” làm đề tài luận văn tốt nghiệp Mục tiêu nghiên cứu - Tìm điều kiện thích hợp chiết tách chất hạt chùm ngây - Định danh, xác định thành phần hóa học dịch chiết từ hạt chùm - Thăm dị hoạt tính kháng sinh số dịch chiết từ hạt chùm g/ ngây ngây - Lá, hạt chùm ngây thu hái xã Tam Đàn, huyện Phú Ninh, tỉnh Quảng Nam - Phạm vi nghiên cứu: Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình chiết - Xác định thành phần số hợp chất dịch chiết từ hạt chùm ngây Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N Đối tượng, phạm vi nghiên cứu - Q trình thí nghiệm tiến hành phịng thí nghiệm hóa học, phịng thí nghiệm vi sinh, trường Đại học Sư Phạm, Đại học Đà Nẵng Nội dung phương pháp nghiên cứu 4.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết - Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu nguồn nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu hợp chất tự nhiên, thành phần hóa học ứng dụng chùm ngây - Tổng hợp tài liệu phương pháp lấy mẫu, chiết tách xác định thành phần hóa học chất từ thực vật - Tổng hợp tài liệu đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học ứng dụng chùm ngây 4.2 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm - Phương pháp lấy xử lí mẫu - Phương pháp trọng lượng xác định độ ẩm - Phương pháp tro hóa mẫu xác định hàm lượng hữu - Phương pháp AAS xác định hàm lượng kim loại nặng - Phương pháp chiết: Chiết soxhlet dung môi: n-hexan, diclometan, etyl axetat, ethanol trúc cấu tử phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS) g/ - Phương pháp xác định thành phần hóa học, định danh, xác định cấu - Phương pháp sinh học thăm dị hoạt tính kháng sinh số dịch Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Những kết nghiên cứu góp phần cung cấp thơng tin có ý nghĩa khoa học thành phần hố học hoạt tính sinh học chất chiết tách từ hạt chùm ngây, qua góp phần nâng cao giá trị ứng dụng chùm ngây ngành dược liệu Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N chiết Luận văn gồm có: Mở đầu Chương Tổng quan Chương Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Chương Kết thảo luận Kết luận Kiến nghị Tài liệu tham khảo N g/ Phụ lục Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 KHÁI QUÁT VỀ CÂY CHÙM NGÂY 1.1.1 Phân loại khoa học Chùm ngây hay gọi chùm ngây cải ngựa, dùi trống, câu dầu bel có tên khoa học Moringa oleifera Lam, nằm hệ thống phân loại sau: : Plantae Ngành Ngọc lan (Division) : Magnoliophyta Lớp Ngọc Lan (Class) : Magnoliopsida Bộ Cải (Ordo) : Brassicales Họ Chùm ngây (Familia) : Moringaceae Chi Chùm ngây (Genus) : Moringa Lồi (Species) : Moringa oleifera Lam Hình 1.1 Cây chùm ngây Chi chùm ngây (Moringa) chi họ chùm ngây (Moringacese) Chi có 13 lồi, tất số chúng thân gỗ sinh sống khu vực nhiệt đới cận nhiệt đới Loài phổ biến chùm ngây Moringa oleifera Lam Loài trồng nhiều nơi khu vực nhiệt đới, loài chi Moringa có mặt Việt Nam [1],[2] Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N g/ Giới Thực vật (Kingdom) 1.1.2 Đặc điểm thực vật Hình dáng: Chùm ngây thân mộc cao cỡ trung bình, độ tuổi trưởng thành cao hàng chục mét Cây năm tuổi không cắt cao tới 5-6 m có đường kính 10 cm, 3-4 năm tuổi độ tuổi trưởng thành Thân óng chuốt, khơng có gai [4],[5],[10] Lá: Lá kép lông chim dài 30–60 cm, màu xanh mốc; chét dài 1220 mm hình trứng, mọc đối có 6-9 đơi, kèm bao lấy chồi Hoa: Cây trổ hoa vào tháng 1–2 Hoa trắng kem, có cuống, vểnh lên, hình dạng giống hoa đậu, rộng khoảng 2.5 cm, mọc thành chùm nách lá, có lơng tơ, nhiều mật Bộ nhị gồm nhị thụ xen với nhị lép Bầu noãn buồng nỗn, đính phơi trắc mơ [4],[5] Hình 1.2 Lá chùm ngây Hình 1.3 Hoa chùm ngây Quả: Quả dạng nang treo, dài 25–40 cm, ngang cm, có cạnh, chỗ có g/ hạt gồ lên, dọc theo có khía rãnh N Hạt: Hạt chùm ngây màu đen, trịn có cạnh, trịn dẹp, to khoảng cm Hình 1.4 Quả chùm ngây Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú Hình 1.5 Hạt chùm ngây 1.1.3 Phân bố Cây chùm ngây có nguồn gốc vùng phụ cận dãy Himalaya, tây bắc Ấn Độ, có lịch sử phát sử dụng 4000 năm, ngày trồng rộng rãi Châu Phi, Trung Mỹ, Nam Mỹ, Đông Nam Á… Ở Việt Nam, chùm ngây loài chi chùm ngây phát mọc hoang từ lâu đời nhiều nơi Thanh Hóa, Ninh Thuận, Bình Thuận, vùng Bảy Núi An Giang, đảo Phú Quốc Tuy vậy, trước ý, có nơi trồng để làm hàng rào, vài chục năm trở lại trồng có chủ định có nhiều nghiên cứu liên quan 1.1.4 Trồng trọt Chùm ngây loài nhiệt đới cận nhiệt đới, thích hợp với đất cát khơ có khả chịu hạn hán Theo số báo cáo chi chùm ngây chịu nhiệt độ từ 18.7 – 28.5oC pH khoảng 4.5 – Cây chùm ngây dễ trồng, trồng từ hạt, hom cành trồng quanh năm Cây trồng nhiều vùng đất khô hạn khắc nghiệt nhiệt đới bán nhiệt đới Cây chuộng đất nước, nhiều cát, dù đất xấu dễ mọc, chịu hạn hán, ưa nắng, không bị sâu bệnh hại, chăm sóc khơng cần điều kiện đặc biệt phân bón nước nước tốt g/ tưới Tuy nhiên không chịu úng ngập dễ chết không Gỗ chùm ngây mềm, giòn nên thân cành dễ bị gãy mưa bão đạt độ cao định, vừa tiện thu hái; vừa kích thích đâm tược, nảy cành theo cấp số nhân tán dù; vừa hạn chế thiệt hại gãy đổ 1.2 GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA CÂY CHÙM NGÂY 1.2.1 Giá trị dinh dưỡng Các phận chứa nhiều khoáng chất quan trọng, giàu chất đạm, Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N Do trồng để khai thác sử dụng người trồng thường cắt vitamin, beta-caroten, axit amin nhiều hợp chất phenol Cây chùm ngây cung cấp hỗn hợp gồm nhiều hợp chất quý zeatin, quercetin, alpha-sitosterol, axit caffeoylquinic kaempferol Một số nguồn nghiên cứu cho biết chùm ngây chứa 90 chất dinh dưỡng tổng hợp bao gồm loại vitamin, loại khoáng chất, 18 loại axit amin, 46 chất chống oxi hóa, liều lượng lớn chất chống viêm nhiễm, chất kháng sinh, kháng độc tố, chất giúp ngăn ngừa điều trị ung thư, u xơ tiền liệt tuyến, giúp ổn định huyết áp, hạ cholesterol, bảo vệ gan Lá chùm ngây chứa nhiều dưỡng chất hoa, tính theo trọng lượng, vitamin C cam lần, vitamin A cà rốt lần, canxi gấp lần sữa, sắt gấp lần cải bó xơi, đạm nhiều gấp đôi sữa chua kali gấp lần trái chuối [13] Trong ẩm thực, non chí già chùm ngây sử dụng để nấu canh với thịt, tôm, nấm nấu suông, trộn salad, ăn sống, xào thịt, trứng, xay nhuyễn thành nước sinh tố Lá chùm ngây phơi khô tán bột để lâu mà khơng dinh dưỡng, sử dụng cho nhiều ăn cháo, bột trẻ em, nhào bột bánh, pha nước uống Trái non dùng xào, nấu canh, hầm xương, ninh súp đậu cô ve cho hương vị gần tương tự măng tây sống làm gia vị cải ngựa (mù tạt) g/ Khi già, hạt chùm ngây rang ăn đậu phộng Rễ non ăn 1.2.2 Giá trị y học Rễ có vị đắng, xem loại thuốc bổ cho thể phổi, điều kinh, long đàm, lợi tiểu nhẹ Dịch rễ dùng để điều trị chứng mẫn ngứa dị ứng Trong rễ hạt có chất kháng sinh pterygospermin Pakistan dùng vỏ rễ sắc lấy nước trị đau răng, đau tai Hay rễ tươi non dùng trị nóng sốt, phong thấp, gout, sung gan lách [15],[19] Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N Rễ chùm ngây Vỏ thân chùm ngây Vỏ dùng điều trị chứng thiếu vitamin C, dùng trị tiêu chảy Ở Ấn Độ, người ta hay dùng vỏ thân chùm ngây để trị nóng sốt, đau bao tử, đau bụng có kinh, sâu răng, làm thuốc thoa trị hói tóc, chữa đau cổ họng (dùng chung với hoa nghệ, hạt tiêu đen), trị tiểu máu, trị thổ tả Nhựa có cơng dụng giảm đau, chống sưng tấy Lá chùm ngây Lá dùng để uống điều trị chứng hạ huyết áp vò xát vào vùng thái dương để trị chứng đau đầu Lá dùng để điều trị vết cắt da, vết trầy xướt, sưng tấy, mẩn ngứa hay dấu hiệu lão hóa da Dịch chiết có tác dụng chống nhiễm trùng da Dùng giã nát đắp lên vết thương bị sưng, nhọt, trộn với mật ong để đắp bên mắt trị sưng mắt đỏ [12] Bột làm từ tươi có khả cung cấp lượng cho thể Lá dùng chữa sốt, viêm phế quản, viêm nhiễm mắt tai, viêm màng cơ, diệt giun sán làm thuốc tẩy xổ Sản phụ ăn làm tăng tiết sữa Lá định dùng chống thiếu máu, chứa lượng sắt cao [19] Hoa chùm ngây có giá trị y học cao chất kích thích, kích dục, g/ Hoa chùm ngây tác nhân gây sẩy thai, thông mật, dùng để chữa viêm, bệnh cơ, hội huyết thanh, phospholipid, trigliceride máu, tỉ lệ VLDL, LDL cholesterol thành phospholipid làm giảm số xơ vữa động mạch, giảm thành phần lipid gan, tim động mạch chủ bệnh cao cholesterol máu thỏ giảm thải cặn cholesterol [18] Quả, hạt chùm ngây Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N chứng rối loạn phân ly, khối u, phình to lách Làm giảm cholesterol 10 Quả dùng trị bệnh đau gan tỳ, đau khớp, uốn ván Hạt điều trị viêm dày Dầu hạt dùng để điều trị nấm da Nhiều nơi giới dùng bột nghiền từ hạt để khử trùng, làm nước [18] 1.3 MỘT SỐ CHẤT CÓ TRONG CÂY CHÙM NGÂY 1.3.1 Vitamin E Vitamin E tên gọi chung để hai lớp phân tử (bao gồm tocopherol tocotrienol) Vitamin E chất chống oxi hóa tốt cản trở phản ứng xấu gốc tự tế bào thể HO O Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo vitamin E Vai trị: - Ngăn ngừa lão hóa: phản ứng chống oxi cách ngăn chặn gốc tự mà vitamin E có vai trị quan trọng việc chống lão hóa - Ngăn ngừa ung thư: kết hợp vitamin C tạo thành nhân tố quan trọng - Ngăn ngừa tim mạch: vitamin E làm giảm cholesterol xấu làm g/ làm chậm phát sinh số bệnh ung thư tăng tuần hoàn máu nên làm giảm nguy mắc bệnh tim mạch thường việc bảo vệ tế bào,… [7] 1.3.2 Axit oleic Axit oleic axit béo có nối đơi omega-9 tìm thấy nhiều động vật thực vật Theo IUPAC, tên axit oleic axit cisoctadec-9-enoin Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N - Hệ thống miễn dịch: kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động bình 30 Hình 2.12 Bộ chiết soxhlet * Cách tiến hành Bột nguyên liệu khô đựng túi giấy lọc đặt trực tiếp ống D Lưu ý, đặt vài viên bi thủy tinh đáy ống D để tránh làm cầu cách tháo hệ thống nút mài số 2, lượng dung môi phải đủ thấm ướt g/ nghẹt lối vào ống thơng E Rót dung mơi lựa chọn vào bình bột nguyên liệu chảy xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thơng cần bơi vaseline để sau hồn tất tháo dụng cụ dễ dàng Kiểm tra hệ thống kín, mở cho nước chảy hoàn lưu ống ngưng Cắm bếp cách thủy điều chỉnh nhiệt cho dung mơi bình cầu sơi nhẹ Dung mơi tinh khiết đun nóng bốc lên cao theo ống B, nhờ hệ thống ngưng tụ, dung môi ngưng tụ ống D chứa nguyên Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N E Lưu ý, vị trí gắn kết ống D với bình cầu ống D với ống C 31 liệu Dung môi ngấm vào bột nguyên liệu chiết chất hữu hịa tan vào dung mơi Theo q trình đun nóng, lượng dung mơi rơi vào ống D đồng thời dâng lên ống E Đến mức cao ống E, dung mơi bị hút vào bình A, lực hút rút lượng dung môi chứa ống D Bếp tiếp tục đun quy trình vận chuyển dung mơi theo mơ tả lúc đầu Các hợp chất rút xuống bình cầu nằm lại đó, có dung mơi tinh khiết bốc bay lên để tiếp tục q trình chiết Sau hồn tất, lấy dung mơi chiết khỏi bình cầu A, đuổi dung mơi thu cao chiết * Một số lưu ý dùng kỹ thuật chiết soxhlet: + Các hợp chất chiết trữ bình cầu, đến lúc nồng độ chất đạt đến mức bão hịa cần phải thay dung môi + Tùy trường hợp, việc chiết kéo dài vài ngày Muốn nghỉ, cần phải tắt bếp trước, chờ thêm khoảng 30 phút tắt ống nước làm lạnh ống sinh hàn + Khi thực chiết với dung mơi có nhiệt độ sơi thấp, phịng thí hay khơng, khơng, thấy bốc khí khỏi hệ thống từ đầu cao g/ nghiệm xứ nóng, cần lưu ý xem ống sinh hàn có đủ sức làm ngưng tụ ống sinh hàn, trường hợp cần tìm cách nối dài thêm hệ thống sinh khí bên ngồi nhờ ống sinh hàn, nối dài ống sinh hàn khơng làm ống bị bít + Sau chiết kiệt với loại dung môi, muốn tiếp tục chiết với dung mơi có tính phân cực cao ta phải rút bao chứa nguyên liệu khỏi ống, mở miệng bao cho dung môi bay hết, cho bao trở lại ống, rót dung mơi Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N hàn Lưu ý hệ thống hở, phần bên hệ thống thông với không 32 vào, bắt đầu qui trình chiết * Ưu, nhược điểm phương pháp chiết soxhlet - Ưu điểm: + Tiết kiệm dung mơi, lượng dung mơi mà chiết kiệt mẫu + Không tốn thao tác châm dung môi lọc dịch chiết kỹ thuật khác Chỉ cần cắm điện, mở nước hoàn lưu thiết bị thực chiết + Chiết kiệt hợp chất bột nguyên liệu bột nguyên liệu chiết liên tục dung môi tinh khiết - Nhược điểm: + Kích thước thiết bị làm giới hạn lượng bột nguyên liệu cần chiết + Trong trình chiết, hợp chất chiết từ bột nguyên liệu trữ lại bình cầu, nên chúng ln bị đun nóng nhiệt độ sơi dung mơi hợp chất bền nhiệt dễ bị hư hại + Do toàn hệ thống thiết bị thủy tinh gia công thủ công nên giá thành thiết bị cao Thiết bị thủy tinh nên dễ vỡ, phận thiết bị, nút mài gia công thủ công vừa khớp để thay g/ nên cần làm bể phận khó tìm phận khác 2.2.3 Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Phép đo phổ hấp thụ nguyên tử kỹ thuật phân tích tương đối phát triển mạnh mẽ ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khoa học kỹ thuật nước phát triển Đối tượng phương pháp phân tích theo phổ hấp thụ nguyên tử lượng nhỏ kim loại số kim nhiều đối tượng mẫu: quặng, đất, nước khoáng, mẫu sinh Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N a Giới thiệu phương pháp 33 học, y học, sản phẩm nơng nghiệp, thực phẩm, nước uống, phân bón, vật liệu [6],[8] Với trang thiết bị kỹ thuật nay, người ta định lượng hầu hết kim loại số kim đến giới hạn nồng độ cỡ ppb (nanogram) với sai số không lớn 15% * Nguyên tắc phép đo: Các nguyên tử trạng thái bình thường chúng khơng hấp thụ hay xạ lượng chúng trạng thái tự dạng đám nguyên tử chúng hấp thụ xạ lượng Mỗi nguyên tử hấp thụ xạ định tương ứng với xạ mà chúng phát gọi trình hấp thụ lượng nguyên tử tự trạng thái tạo phổ nguyên tử Phổ sinh trình gọi phổ hấp thụ nguyên tử Phương pháp phân tích dựa sở đo phổ hấp thụ nguyên tử số nguyên tố gọi phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử [6] * Qui trình phép đo AAS: Để thực phép đo phổ hấp thụ nguyên tử cần thực trình sau : Mục đích q trình tạo đám nguyên tử tự từ mẫu g/ - Quá trình ngun tử hóa mẫu phân tích với hiệu suất cao ổn định Ta nguyên tử hóa mẫu phân tích đoạn quan trọng có ảnh hưởng đến kết phép đo AAS Để thu kết phân tích xác, phải nghiên cứu chọn lọc điều kiện tối ưu cho trình ngun tử hóa mẫu cho phù hợp với nguyên tố phân tích loại mẫu cụ thể, là: + Thành phần tốc độ hỗn hợp khí đốt tạo lửa Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N lửa kỹ thuật ngun tử hóa khơng lửa Đây giai 34 + Tốc độ dẫn dung dịch mẫu + Chiều cao đèn nguyên tử hóa + Bề dày môi trường hấp thụ + Độ nhớt dung dịch mẫu Dung dịch phân tích dung dịch dùng để lập đường chuẩn phải chuẩn bị điều kiện để có loại thành phần hóa học, vật lý, đặc biệt thành phần mẫu, độ axit, loại axit dùng làm môi trường - Nguồn phát xạ đơn sắc Muốn thực đo phổ hấp thụ nguyên tử, cần phải có nguồn phát tia xạ đơn sắc nguyên tố cần phân tích để chiếu qua đám nguyên tử tự Nguồn phát tia xạ đơn sắc phải thỏa mãn yêu cầu sau: + Nguồn phát tia xạ đơn sắc tạo phải tia phát xạ có độ nhạy nguyên tố phân tích Chùm tia phát xạ phải có cường độ (I0) ổn định, lặp lại nhiều lần đo khác điều kiện phải điều chỉnh để có cường độ cần thiết cho phép đo + Nguồn phát xạ phải tạo chùm tia phát xạ khiết, bao gồm số vạch ngun tố phân tích Phổ phải không + Nguồn phát tia xạ phải tạo chùm sáng có cường độ cao, g/ đáng kể phải bền theo thời gian không bị yếu tố vật lý khác gây nhiễu, đắc khơng q phức tạp sử dụng Q trình ghi đo gồm hệ thống phân ly ánh sáng sau bị hấp thụ, detector, khuếch đại ghi đo Nhờ hệ thống máy quang phổ, người ta thu, phân ly chọn vạch hấp thụ nguyên tử nguyên tố cần nghiên cứu để đo cường độ Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N không bị ảnh hưởng dao động điều kiện làm việc Ngồi khơng 35 Cường độ tín hiệu hấp thụ vạch phổ Trong giới hạn định nồng độ, giá trị cường độ phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ C nguyên tố mẫu phân tích Cường độ vạch hấp thụ sau detector ghi nhận khuếch đại đưa sang hệ thống thị, khuếch đại tiếp xử lý để có cường độ thực vạch phổ hấp thụ b Trang bị máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử gồm phận sau: - Nguồn phát tia xạ cộng hưởng nguyên tố cần phân tích: Là nguồn tạo chùm xạ đơn sắc nguyên tố cần phân tích, nguồn chiếu vào đám nguyên tử tự phải thỏa mãn yêu cầu trên, thường đèn cathod rỗng (HCL) đèn phóng điện khơng cực (EDL) - Hệ thống nguyên tử hóa mẫu phân tích: Bộ phận ngun tử hóa mẫu chuyển mẫu từ trạng thái ban đầu thành dạng nguyên tử tự tác dụng nhiệt độ Đám ngun tử tự mơi trường hấp thụ xạ sinh phổ hấp thụ nguyên tử Có hai loại kỹ thuật nguyên tử hóa mẫu: + Kỹ thuật nguyên tử hóa lửa, sử dụng khí C2H2 khơng khí + Kỹ thuật ngun tử hóa lửa, sử dụng lị đốt điện, gọi ETA- g/ nén N2O2, gọi F-AAS AAS lọc số vạch thích hợp nguyên tố cần phân tích ghi lại - Bộ phận xử lý kết quả: Máy quang phổ hấp thụ nguyên tử cho phép điều khiển hai chế độ Một điều khiển cách sử dụng bàn phím gắn máy tính Hai điều khiển thơng số qua phần mềm cài đặt máy tính kết nối với máy AAS Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N - Hệ quang detector: Là hệ thống trang thiết bị để thu, phân ly, chọn 36 Hình 2.13 Sơ đồ máy quang phổ hấp thụ nguyên tử c Ưu, nhược điểm phép đo phổ hấp thụ nguyên tử * Ưu điểm Phép đo phổ hấp thụ phân tử có độ nhạy độ xác cao Trên nguyên tố hóa học xác định phương pháp với độ xác 10-4 – 10-5% Có thể đạt tới 10-7% với kỹ thuật khơng lửa Điều kiện thực tương đối dễ, dùng cho tất phịng thí nghiệm nhỏ vừa Có thể xác định liên tiếp nhiều nguyên tố mẫu Kết phân tích ổn định, sai số nhỏ * Nhược điểm Chỉ cho biết thành phần ngun tố chất phân tích có mẫu phân tích, mà khơng trạng thái liên kết, cấu trúc nguyên tố 2.2.4 Sắc ký, sắc ký khí (GC), sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) Sắc ký kỹ thuật vật lí hóa lí để tách phân tích chất g/ a Sắc ký hỗn hợp Cơ sở trình sắc ký trình xảy cột tách + Pha động: Chất phân tích dung mơi thích hợp + Pha tĩnh: thường dạng rắn hay lỏng, dạng màng mỏng bám bề mặt chất mang trơ chứa cột sắc ký Quá trình sắc ký xảy cột q trình tương tác chất phân tích pha tĩnh nằm cột Q trình tương tác theo tính chất hóa lí định, hấp phụ, trao đổi, phân bố, rây phân tử Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N mẫu nạp vào cột sắc ký Để thực q trình sắc ký có hai pha: 37 Tương ứng ta có tên gọi phương pháp sắc ký: sắc ký hấp phụ dựa vào tính chất hấp phụ chất phân tích lên bề mặt pha tĩnh, sắc ký trao đổi dựa vào trao đổi ion dấu chất phân tích với pha tĩnh, sắc ký phân bố dựa vào phân bố chất phân tích lên pha tĩnh… Đặc điểm chung phương pháp sắc ký trình sắc ký lặp lặp lại nhiều lần, xảy giấy, mỏng, cột Do vậy, khả tách hoàn tồn phân tích định lượng tương đối xác b Sắc ký khí (GC) Sắc ký khí phương pháp quan trọng dùng để tách, định lượng, xác định cấu trúc chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng nghiên cứu hợp chất hữu Pha động GC chất khí nên chất phân tích phải hóa để đưa vào cột sắc ký Pha tĩnh chất rắn nhồi vào cột hay màng phim mỏng bám bề mặt chất mang trơ, tạo thành màng mỏng bám lên mặt thành cột (cột mao quản) Tùy thuộc vào chất pha tĩnh ta chia thành hai loại sắc ký khí: + Sắc ký khí rắn (gas soild chromatography – GSC): chất phân tích + Sắc ký khí lỏng (gas liquid chromatography – GLC): Pha tĩnh g/ hấp phụ trực tiếp pha tĩnh tiểu phân rắn chất lỏng không bay phân hủy phân hủy cho sản phẩm phân hủy xác định thể Có hai loại kỹ thuật phân tích: + Giữa cho nhiệt độ khơng đổi suốt q trình phân tích, phương pháp khó tách hồn tồn Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N Phương pháp giới hạn với chất bốc mà khơng bị 38 + Thay đổi nhiệt độ trình phân tích, phương pháp tốn thời gian triệt để Cấu tạo máy sắc ký khí * Hệ thống cung cấp khí mang Khí mang phải trơ mặt hóa học He, Ar, N2, CO2, H2 lựa chọn khí mang định detector sử dụng Hệ thống cung cấp khí mang bao gồm điều chỉnh áp suất, thiết bị đo áp suất, thiết bị đo tốc độ dịng Hệ thống khí mang cịn chứa hệ thống lọc phân tử để tách nước chất nhiễm bẩn khác Độ tinh khiết khí phải đạt 99.95% Có thể sử dụng bình chứa khí thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ khơng khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất,…) * Hệ thống tiêm mẫu Cách thông dụng để đưa mẫu vào cột sử dụng bơm tiêm mẫu vi lượng để tiêm mẫu lỏng khí qua đệm cao su silicon chịu nhiệt vào buồng hóa Lượng mẫu bơm vào thay đổi từ 0.1-10 µl cột mao quản, cột nhồi lượng mẫu bơm vào lớn Có cách đưa mẫu vào cột: tiêm mẫu thủ công tiêm mẫu tự động Lò cột làm nhiệm vụ điều nhiệt cho cột sắc ký g/ * Lò cột cột phân tích Có loại cột: cột nhồi cột mao quản đường kính 3-6 mm chiều dài từ 1-5 m chứa hạt chất mang rắn phủ pha tĩnh lỏng thân hạt rắn pha tĩnh nhồi vào cột Cột nhồi thường có hiệu tách thấp, nhiên có hệ số lưu giữ cao, dung lượng mẫu lớn - Cột mao quản: chế tạo từ thủy tinh oxit tinh khiết nấu chảy, có Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N - Cột nhồi: cột thường làm thép không rỉ, niken, thủy tinh với 39 mức độ liên kết cao nên bền chịu nhiệt độ cao đến 350°C, cột có đường kính 0.1-0.5 mm chiều dài 30-100 m, pha tĩnh lớp phim mỏng dày khoảng từ 0.1-5 µm phủ thành cột chất mang rắn phủ lớp pha tĩnh mỏng gắn bề mặt bên cột pha tĩnh xốp chất hấp phụ hay rây phân tử * Đầu dò Đầu dò dùng phát tín hiệu để định tính định lượng chất cần phân tích Có nhiều loại đầu dị khác tùy theo mục đích phân tích đầu dị ion hóa lửa, đầu dị dẫn nhiệt, đầu dị cộng kết điện tử, đầu dị quang hóa lửa, đầu dị khối phổ * Bộ phận ghi nhận tín hiệu Bộ phận ghi tín hiệu đầu dị phát Đối với hệ thống sắc ký đại, phần phần mềm hệ thống ghi nhận, lưu thông số, sắc ký đồ, thông số liên quan đến pic tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng thời tính tốn, xử lý thông số liên quan đến kết phân N g/ tích Hình 2.14 Sơ đồ thu gọn thiết bị sắc ký khí * Ngun tắc hoạt đơng Nhờ có khí mang chứa bom khí (hoặc máy phát khí), mẫu từ buồng Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú 40 bay dẫn vào cột tách nằm buồng điều nhiệt Quá trình sắc ký xảy Sau rời khỏi cột tách thời điểm khác nhau, cấu tử vào detector, chúng chuyển thành tín hiệu điện Tín hiệu khuếch đại chuyển sang phận in lưu kết (bộ số, máy in máy ghi) Trên sắc ký đồ nhận được, có tín hiệu ứng với cấu tử tách gọi pic Thời gian lưu pic đại lượng đặc trưng cho chất cần phân tích Diện tích pic thước đo định lượng cho chất hỗn hợp cần nghiên cứu c Khối phổ (MS) * Nguyên tắc hoạt động Dựa vào chất nghiên cứu ion hóa pha khí pha ngưng tụ chân khơng phương pháp thích hợp thành ion (ion phân tử, ion mảnh…) có số khối khác nhau, sau ion phân tách thành dãy ion theo số khối m (chính xác theo tỉ số khối diện tích ion, m/e) xác xuất có mặt dãy ion có tỉ số m/e ghi đồ thị có trục tung xác xuất có mặt (hay cường độ vạch), trục hoành tỉ số m/e gọi khối phổ đồ độ cao gọi đỉnh sở Đỉnh ion phân tử thường đỉnh cao nhất, tương g/ Phổ khối lượng ghi lại dạng vạch hay bảng, cường đương với khối lượng phân tử hợp chất khảo sát mà vào mảnh phân tử tạo thành ta suy cấu trúc phân tử Xác định tạo thành mảnh phụ thuộc vào cường độ liên kết tương ứng phân tử vào khả bền hóa mảnh tạo thành nhờ hiệu ứng khác Các mảnh có độ bền lớn ưu tiên tạo thành, liên kết yếu dễ bị đứt Có mảnh có khối lượng đặc trưng gọi Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N Phổ khối lượng cho phép xác định xác phân tử lượng 41 mảnh chìa khóa, chúng cho phép phân tích phổ khối lượng dễ dàng d Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) Sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) dựa sở ghép nối máy sắc ký khí (gas chromatography) khối phổ (mass spectrometry) GC-MS phương pháp với độ nhạy cao sử dụng nghiên cứu thành phần chất khơng khí Máy GC-MS cấu tạo gồm phần: + Phần thiết bị sắc ký khí + Phần thiết bị khối phổ Hai phận ghép với qua kết nối với mục đích loại bớt khí mang hidro, heli để giảm áp suất dịng khí mang phân tử mẫu chất vào buồng ion hóa khối phổ Phần thiết bị sắc ký khí dùng mao quản, phần khối phổ sử dụng buồng ion hóa với tách từ cực detector khối phổ Nguyên lí hoạt động máy sắc ký khí ghép khối phổ Dung môi chứa hỗn hợp chất tiêm vào hệ thống cửa tiêm mẫu Mẫu sau dẫn qua hệ thống khí trơ, thường heli, nhiệt độ cửa tiêm mẫu nâng lên 300oC để mẫu trở thành dạng khí Phần vỏ từ 40oC đến 320oC Bên hệ thống GC cuộn ống nhỏ hình trụ có g/ ngồi hệ thống GC lị đặc biệt Nhiệt độ lò dao động chiều dài 30 m với mặt tráng loại polime đặc biệt Các Sau qua cột sắc ký khí, chất tiếp tục vào pha khối phổ, chúng bị ion hóa, sau tới phận lọc detector Dựa khối lượng, lọc lựa chọn cho phép hạt có khối lượng nằm giới hạn định qua Thiết bị cảm ứng có nhiệm vụ đếm số lượng hạt có khối lượng Thơng tin sau chuyển đến máy tính xuất kết Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N chất hỗn hợp phân tách cách chạy dọc theo cột 42 gọi phổ khối Phổ khối phổ đồ phản ánh ion với khối lượng khác qua phận lọc Máy tính phận chịu trách nhiệm tính tốn tín hiệu cảm biến cung cấp đưa kết khối phổ So sánh kết khối phổ thu thí nghiệm với thư viện phổ chất xác định trước Nếu tìm chất tương ứng thư viện định danh chất Nếu phép so sánh khơng tìm kết tương ứng có thêm một kiện đóng góp vào thư viện cấu trúc sau tiến hành thêm biện pháp để xác định xác loại hợp chất 2.2.5 Phương pháp thăm dò khả kháng vi sinh vật a Chuẩn bị dịch chiết Tiến hành chưng ninh 10 gam mẫu bột (bột hạt) chùm ngây 120 ml dung môi: n-hexan, diclometan, etyl axetat, ethanol nhiệt độ 49oC vòng 24 Sau chưng ninh, lọc dịch chiết cô quay 10 ml, thu dịch chiết bột (bột hạt) chùm ngây dung môi Dịch chiết thăm dò khả kháng vi sinh vật với hai chủng vi khuẩn Bacillus subtilis, vi khuẩn Escherichia coli phương pháp đục lỗ thạch b Môi trường thạch dùng để thăm dò khả kháng vi sinh vật 20.0 gam Pepton: 10.0 gam Cao thịt: 5.0 gam NaCl: 10.0 gam Nước cất vừa đủ: 1000ml pH= 6.8; khử trùng 119oC 20 phút Tiến hành: Cân xác 10.0 gam pepton, 5.0 gam cao thịt, 10.0 gam NaCl cho Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú N Agar: g/ Môi trường pha để nấu thạch gồm: 43 vào ca nhựa lít, sau thêm nước cất vừa đủ lít Điều chỉnh pH = 6.8 máy đo pH cho 20.0 gam Agar khuấy cho tan, sau nấu sơi lo vi sóng Sau nấu, hỗn hợp cho vào bình tam giác lít, nút bơng gịn hấp khử trùng 119oC 20 phút c Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật Hoạt tính kháng vi sinh vật xác định phương pháp đục lỗ Phương pháp sau: Môi trường sau pha hấp khử trùng, cho vào đĩa petri có đáy phẳng rửa sạch, sấy khô đặt lên bề mặt thật phẳng để thạch có bề dày đồng nhất, khoảng mm Thể tích mơi trường khoảng 25 ml/ đĩa Để nguội nhiệt độ phòng Sau môi trường đông cứng, tiến hành đục lỗ thạch, đĩa lỗ Sau đó, dùng que cấy trang vô khuẩn, trang khuẩn lên bề mặt thạch Trong lỗ đục: Lỗ số đổ dịch chiết Lỗ thứ đổ dung môi dùng để chiết Lỗ thứ ba để trống Sau mang đĩa thạch giữ tủ ấm 37oC Sau 24 giờ, quan sát N Quá trình tiến hành tủ cấy vơ trùng g/ vịng kháng khuẩn tạo thành Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú 44 2.3 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM Lá (hạt) chùm ngây Xử lí sơ bộ, xay mịn Xác định độ ẩm, hàm lượng tro, kim loại nặng Chiết n- hexan Dịch chiết n-hexan (lá, hạt) Bột (hạt) chùm ngây Khảo sát điều kiện chiết thích hợp (thời gian chiết) Chiết soxhlet dung môi Chiết diclometan Dịch chiết diclometan (lá, hạt) Định danh, xác định thành phần hóa học (Đo GC-MS) Chiết etyl axetat Dịch chiết Etyl axetat (lá, hạt) Chiết ethanol Dịch chiết Ethanol (lá, hạt) Thăm dị hoạt tính kháng sinh N g/ Hình 2.15 Sơ đồ nghiên cứu thực nghiệm Giới thiệu trích đoạn GV Nguyễn Thanh Tú ... chiết tách chất hạt chùm ngây - Định danh, xác định thành phần hóa học dịch chiết từ hạt chùm - Thăm dị hoạt tính kháng sinh số dịch chiết từ hạt chùm g/ ngây ngây - Lá, hạt chùm ngây thu hái... (lá, hạt) Bột (hạt) chùm ngây Khảo sát điều kiện chiết thích hợp (thời gian chiết) Chiết soxhlet dung môi Chiết diclometan Dịch chiết diclometan (lá, hạt) Định danh, xác định thành phần hóa học. .. khoa học thực tiễn Vì chọn đề tài: “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học số dịch chiết hạt chùm ngây ” làm đề tài luận văn tốt nghiệp Mục tiêu nghiên cứu - Tìm điều kiện thích hợp chiết