GIẢI TRÌNH TỰ DNA pot

GIẢI TRÌNH TỰ DNA DNA SEQUENCING TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy 1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA Giải trình tự DNA là một thí nghiệm cho kết quả thứ tự sắp xếp các nucleotide trong đoạn DNA đó. Vd: 5’CGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTC CAGGCATTGAGCGGGTTTGATCCAAGAAAGGACCCGG TCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCA GACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGATCCTGGA GGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACG CTTAATAGAACAANAAA3’ 2. HAI PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNA  Phương pháp hoá học giải trình tự DNA của Maxam & Guilbert (1977) Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự) Walter Gilbert  Phương pháp enzyme giải trình tự của Frederick Sanger (1977) Nobel hoá học 1958 (cấu trúc protein: Insulin) Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự) 2.1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP HÓA HỌC 1. Đánh dấu một đầu của đoạn DNA bằng gốc phospho đồng vị phóng xạ ( 32 P). 2. Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu 32 P bằng hóa chất làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA [...]... chu kỳ giải trình tự Hệ thống giải trình tự Trugene Siemens Medical Solutions Diagnostics CEQ 8000 (Beckman Coulter) CÁC HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ TỰ ĐỘNG ABI 3130 4 Cappilaries ABI 3130 XL 16 Cappilaries ABI 3730 5 PYROSEQUENCING Mostafa Ronaghi và Pal Nyrén tại Royal Institute of Techology ở Stockholm 1990s Peaks in pyrogram reflect nucleotide sequence =pyrophosphate = pyrophosphate Giải trình tự bằng... On to sequencing… PCR + DNA đích + Taq polymerase + Mồi và dNTPs + PCR buffer, etc… Sản phẩm PCR tinh sạch + nước Đo nồng độ DNA bằng máy hay ước lượng qua điện di Bước 2: Phản ứng chu kỳ giải trình tự (cycle sequencing reaction) denaturation Product extension Primer annealing PCR machine Tủa sản phẩm giải trình tự loại bỏ chất đánh dấu thừa Bước 3: Điện di trên máy giải trình tự 1 Mỗi ddNTP được gắn... của DNA đích được tạo đồng thời, nên các sản phẩm DNA được tổng hợp mới của tất cả các kích thước đều hiện diện với tận cùng là các ddNTP Sequence-specific primer GIẢI TRÌNH TỰ BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN 1 Dùng gel polyacrylamide biến tính, có độ phân giải cao, có thể phân biệt các đoạn DNA khác nhau chỉ 1 nucleotid 2 Gel polyacrylamide thường chứa urea (tác nhân làm biến tính DNA) 3 KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ... STEP 4: The complementary DNA strand is build up as the process continues The sequence is determined from the signal peaks in the pyrogram 6 ỨNG DỤNG CỦA GIẢI TRÌNH TỰ DNA 6.1 Giải trình tự bộ gen người HGP (10/1990): Viện quốc gia Y tế Hoa kỳ (3 tỉ USD) - 6/2000: Crag Venter và Francis Collins 97% bộ gen người được giải mã - 4/2003 (kỷ niệm 50 năm mô hình DNA của W-C) Hoàn tất giải mã bộ gen người -... gồm cường độ huỳnh quang thu được và màu sắc của mỗi đoạn DNA 4 Trình tự của đoạn DNA được đọc theo chiều 5’ đến 3’, từ trái sang phải  Automated DNA Sequencing with Fluorescent Dyes Mỗi ddNTP có một màu khác nhau, ddTTP đỏ, ddGTP đen,… 4 HIỆU QUẢ P/ỨNG GIẢI TRÌNH TỰ 1 Tối ưu hóa phản ứng PCR phải thật sự hoàn chỉnh 2 Chất lượng và nồng độ DNA đích 3 Mồi đặc hiện với nồng độ thích hợp 4 Sản phẩm PCR... vào kỷ nguyên Post-genomic và Proteomic - Giá thành 2001: 1us / 1bp, 10 đến 15 năm nữa: 0,01 us/ 1bp 6.2 Định danh VSV: VK kỵ khí: giải trình tự một đoạn đặc hiệu cho giống và loài ở gen 16S 6.3 Định danh nấm: giải trình tự một đoạn đặc hiệu cho giống và loài ở gen 28S rDNA 6.3 Xác định genotype của các VR, VSV… HCV: genotype 1 (1a, 1b), 2 (2a, 2b, 2c)… HPV: high-risk, low-risk… 6.4 Phát hiện các đột... (tyrosine, methionine, aspartate, aspartate) của protein polymerase của virus  Lao kháng thuốc Rifampicine, INH… Sau khi xác định trình tự một đoạn DNA quan tâm, so sánh với ngân hàng dữ liệu gene của NCBI (National Center Biotechnology Information) … MỘT SỐ HỆ THỐNG GIẢI TRÌNH TỰ MỚI Genome Analyzer Iix - Illumina Genome Sequencer FLX System 1 million high-quality reads per run and read lengths of 400... điện di ~500 MB on one plate, in just a few hours PYROSEQUENCING Step 1: DNA đích, Primer, ủ với enzym DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase, và cơ chất là APS (adenosine 5’phosphosulphat) và luciferin Step 2: 4 dNTP được đưa vào phản ứng DNA polymerase xúc tác gắn dNTP vào sợi DNA tiếp theo primer nếu nó bổ xung với DNA đích Mỗi khi 1 dNTP gắn vào, sẽ phóng thích 1 pyrophosphat (PPi) PYROSEQUENCING... thuốc - Định danh vi khuẩn, nấm - Phân tích SNP-Single nucleotide polymorphisms PYROSEQUENCING Pyrosequencing technology (DNA) n + dNTP Polymerase dNTP (DNA) n-1 + PPi ATP Apyrase Apyrase dNTP + dNMP + phosphate ADP + AMP + phosphate STEP 1: Hybridization of sequencing primer to ssDNA Incorporation dNTP with release of PPi STEP 3: Degradation of unincorporated dNTP’s and excess ATP by apyrase After degradation . GIẢI TRÌNH TỰ DNA DNA SEQUENCING TS. BS. Đỗ Thị Thanh Thủy 1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA Giải trình tự DNA là một thí nghiệm cho kết quả thứ tự sắp xếp các nucleotide trong đoạn DNA đó. Vd: 5’CGGCTAGCAGTCTCGCGGGGGCACGCCCAAATCTC CAGGCATTGAGCGGGTTTGATCCAAGAAAGGACCCGG TCGTCCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCA GACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGGGATCCTGGA GGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATGGCTAGACG CTTAATAGAACAANAAA3’. PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ DNA  Phương pháp hoá học giải trình tự DNA của Maxam & Guilbert (1977) Nobel hóa học 1980 (phương pháp giải trình tự) Walter Gilbert  Phương pháp enzyme giải trình tự. học 1980 (phương pháp giải trình tự) 2.1. GIẢI TRÌNH TỰ DNA BẰNG PP HÓA HỌC 1. Đánh dấu một đầu của đoạn DNA bằng gốc phospho đồng vị phóng xạ ( 32 P). 2. Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu 32 P