Luận văn xác định khả năng phân giải muối mật của các chủng vi khuẩn lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa của người

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Giải thích chữ viết tắt WHO World Health Organization - Tổ chức y tế Thế giới LAB Vi khuẩn sinh axit lactic BSH Bile salts hydrolase- Enzym thủy phân muối mật S aureus Staphylococcus aureus RT-PCR Realtime Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực Pox Pyruvate oxidase Lox Lactate oxidase Nox NADH oxidase SE Staphylococcal enterotoxin De novo Tổng hợp MRS De Man, Rogosa & Sharpe HRP Horseradish peroxidase TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbezidine SGC Sodium Glycocholate SGDC Sodium Glycodeoxycholate STC Sodium Taurocholate STDC Sodium Taurodeoxycholate DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Pha loãng H2O2 theo nồng độ khác 29 Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng để khuếch đại gen bsh 31 Bảng 3.1 Giá trị đo OD620nm hàm lƣợng H2O2 có dịch ni 42 Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót sau ủ mơi trƣờng pH thấp chủng vi khuẩn chọn lọc so với đối chứng 44 Bảng 3.3 Tỷ lệ sống sót chủng vi khuẩn sau ủ môi trƣờng có bổ sung muối mật 45 Bảng 3.4 Kết đo nồng độ DNA mẫu 54 Bảng 3.5 Kết so sánh với trình tự 16S đƣợc cơng bố ngân hàng gen (NCBI) Lac.VFE -04, Lac.VFE -08 Lac.VFE -14 56 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Lactobacillus sp Hình 1.2 Đồng phân quang học axit lactic Hình 1.3 Cấu trúc axit mật 14 Hình 1.4 Sự tổng hợp axit mật 15 Hình 1.5 Hoạt động thủy phân muối mật hệ vi khuẩn đƣờng tiêu hóa 19 Hình 3.1 Khuẩn lạc vi khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc từ mẫu phân ngƣời 38 Hình 3.2 Khuẩn lạc Lactobacillus khiết sau 24 ni cấy 38 Hình 3.3 Lactobacillus quan sát dƣới kính hiển vi điện tử A ảnh soi tƣơi B ảnh nhuộm Gram 39 Hình 3.4 Kết thử hoạt tính Catalase 40 Hình 3.5 Khả sinh H2O2 chủng vi khuẩn Lactobacillus so với đối chứng 41 Hình 3.6 Đƣờng chuẩn thể mối tƣơng quan nồng độ H2O2 mật độ quang sản phẩm màu sau phản ứng với TMB 41 Hình 3.7 Khả phân giải muối mật chủng Lactobacillus 48 Hình 3.8 Kết điện di sản phẩm PCR gen bsh1, bsh2, bsh3 bsh4 (lần lƣợt từ trái sang phải) chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 Lac.VFE-14 50 Hình 3.9 Khả ức chế sinh trƣởng S aureus chủng Lactobacillus 52 Hình 3.10 Kết điện di mẫu DNA chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 Lac.VFE-14 54 Hình 3.11 Kết sản phẩm PCR chủng Lac.VFE-04; Lac.VFE-08 Lac.VFE-14 55 Hình 3.12 Quan hệ phát sinh chủng loại trình tự gene 16S chủng phân lập Lac VFE-04, Lac VFE-08, Lac VFE-14 phân tích phần mềm MEGA7 Neighbor-Joining Tree 57 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS 1.1.1 Vị trí, đặc điểm chung 1.1.2 Chức sinh học đặc điểm probiotic vi khuẩn Lactobacillus 1.1.3 Ứng dụng Lactobacillus 12 1.2 TỔNG QUAN VỀ ENZYME THỦY PHÂN MUỐI MẬT – BILE SALT HYDROLASE (BSH) 13 1.2.1 Sự hình thành chuyển hóa mật đƣờng tiêu hóa 13 1.2.2 Enzyme thủy phân muối mật Bile salt hydrolase 18 1.3 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN LACTOBACILLUS CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT HIỆN NAY 19 1.3.1 Các nghiên cứu giới 20 1.3.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 21 CHƢƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 23 2.2 ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 23 2.2.2 Mẫu vật nghiên cứu 23 2.2.3 Máy móc thiết bị 23 2.2.4 Hóa chất mơi trƣờng 23 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Lactobacillus 25 2.3.2 Phƣơng pháp làm giữ chủng vi khuẩn Lactobacillus 25 2.3.3 Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh học đặc điểm probiotic chủng vi khuẩn Lactobacillus 26 2.3.4 Xác định khả phân giải muối mật chủng vi khuẩn Lactobacillus 30 2.3.5 Xác định khả ức chế sinh trƣởng vi khuẩn gây bệnh Staphylococcus 31 2.3.6 Định danh vi khuẩn 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTOBACILLUS 37 3.2 KẾT QUẢ LÀM SẠCH VI KHUẨN LACTOBACILLUS 38 3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH SINH HỌC VÀ ĐẶC ĐIỂM PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS 39 3.3.1 Kết xác định hình thái tế bào vi khuẩn 39 3.3.2 Kết xác định khả sinh H2O2 chủng vi khuẩn Lactobacillus 40 3.3.3 Kết xác định khả chịu pH axit muối mật chủng đƣợc chọn lọc 43 3.4 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS 47 3.4.1 Khả phân giải muối mật chủng vi khuẩn Lactobacillus môi trƣờng nuôi cấy 47 3.4.2 Kết xác định có mặt gen bsh 49 3.5 KHẢ NĂNG ỨC CHẾ SINH TRƢỞNG TRÊN VI KHUẨN GÂY BỆNH S AUREUS 51 3.6 ĐỊNH DANH VI KHUẨN 53 3.6.1 Kết tách DNA tổng số 53 3.6.2 Kết PCR 55 3.6.3 Kết giải trình tự 55 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 4.1 KẾT LUẬN 59 4.2 KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 71 MỞ ĐẦU Theo thông báo tổ chức y tế giới WHO, tính đến hết năm 2015 giới có khoảng 2,1 tỉ ngƣời thừa cân béo phì Đây số báo động xã hội Béo phì đƣợc đặc trƣng nhóm rối loạn chuyển hóa mãn tính quan trọng, bao gồm tiểu đƣờng type 2, gan nhiễm mỡ, tăng huyết áp, ung thƣ đặc biệt bệnh tim mạch Trong số bệnh tim bệnh mạch vành gây tỷ lệ tử vong cao Tình trạng cao cholesterol máu làm tích tụ cholesterol động mạch vành, dẫn đến hình thành mảng bám, gây xơ vữa động mạch, thúc đẩy phát triển bệnh mạch vành Số liệu cho thấy, nồng độ cholesterol máu giảm 1% nguy mắc bệnh liên quan đến mạch vành giảm tới 3% Những nghiên cứu gần cho thấy hệ vi sinh vật yếu tố mơi trƣờng liên quan đến việc kiểm sốt trọng lƣợng thể Ở ngƣời, hệ vi sinh đƣờng ruột chứa khoảng 1014 tế bào vi khuẩn với bảy nhóm Firmicutes, Bacteroides, Proteobacteria, Fusobacteria, Verrucomicrobia, Cyanobacteria Actinobacteria [1] Các mơ hình thực nghiệm cho thấy đối tƣợng động vật ngƣời béo phì có thay đổi thành phần hệ vi sinh vật đƣờng ruột so với đối tƣợng khỏe mạnh; hệ vi sinh đối tƣợng béo phì có số lƣợng Firmicutes lớn Bacteroidetes hơn, nhƣ tính đa dạng vi khuẩn tổng số bị giảm [2] Sự thay đổi gen vi khuẩn tiêu biểu đƣợc coi nguyên nhân ảnh hƣởng đến đƣờng chuyển hóa thể [3] Trong số vi khuẩn lactic có ảnh hƣởng lớn đến trao đổi chất ngƣời béo phì, chi Lactobacillus giữ vai trò quan trọng Lactobacillus vi khuẩn lactic sản phẩm cuối trình lên men carbohydrate axit lactic Vi khuẩn Lactobacillus đƣợc cho sở hữu lợi ích sức khỏe đƣợc sử dụng dƣới điều kiện khác Vi khuẩn có vai trị quan trọng điều trị phòng ngừa bệnh nhiễm trùng đƣờng ruột hội chứng sau dùng kháng sinh Một số vi khuẩn Lactobacillus làm giảm tái phát bệnh tiêu chảy liên quan đến vi khuẩn Clostridium difficile [4], có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm ruột, ngăn ngừa ung thƣ đại trực tràng điều trị hội chứng ruột kích thích [5] Chi Lactobacillus đƣợc tìm thấy đa dạng lồi số lƣợng đƣờng tiêu hóa ngƣời, nơi có pH axit số lƣợng đáng kể muối mật, chứng tỏ chúng có khả chống chịu muối mật pH thấp Sản xuất enzyme thủy phân muối mật- BSH chế đề kháng mật thông thƣờng chi vi khuẩn [6] Nghiên cứu Yuji Aiba cộng phân lập đƣợc L johnsonii số 1088 đƣợc tìm thấy có khả kháng axit mạnh > 10% tế bào sống sót pH 1.0 sau [7].Thí nghiệm Rajesh Kumar cộng cho thấy sống sót chủng Lactobacilli pH 2.5 2% muối mật sau [6] Các nghiên cứu khác chứng minh vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus làm giảm mức độ cholesterol huyết nhờ công dụng hoạt tính thủy phân muối mật thơng qua tác động trực tiếp vào trình chuyển đổi muối mật vật chủ [6] Enzyme thủy phân muối mât (Cholylglycine hydrolase, E.C.3.5.1.24) xúc tác trình thủy phân muối mật, cắt đứt liên kết peptide axit mật tự với gốc Glycine Taurin Các axit mật tự (dạng giải liên hợp) sau bị kết tủa pH thấp khiến cho chúng đƣợc tái hấp thu qua ruột đƣợc thải thể Cholesterol chất để tổng hợp nên axit mật, việc thủy phân muối mật làm lƣợng cholesterol máu giảm đi, giúp thể khỏe mạnh hơn, tránh nguy béo phì bệnh tim mạch [8] Các chủng Lactobacillus phân lập có đặc điểm probiotics đặc trƣng nghiên cứu có tiềm lớn để trở thành sản phẩm probiotics, liệu pháp khả thi cho việc giảm mức cholesterol thông qua khả sinh enzyme thủy phân muối mật BSH Chính lí nêu trên, tiến hành thực luận văn với tiêu đề: " Xác định khả phân giải muối mật chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa ngƣời."  Với mục tiêu: Nhằm xác định khả phân giải muối mật chủng vi khuẩn Lactobacillus đặc điểm probiotics chủng vi khuẩn  Nhiệm vụ đề tài: - Phân lập, tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả phân giải muối mật - Xác định đặc điểm sinh học đặc điểm probiotic chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập đƣợc H2O2 production in Lactobacillus strains isolated tùy thuộc vào lượng H2O2 có mặt dịch ni chủng vi khuẩn (hình 2) Kết kiểm tra khả sinh H2O2 chủng vi khuẩn Lactobacillus phân lập thể bảng Trong đó, chủng có khả sinh lượng H2O2 lớn Lac.VFE-14 đạt 2,183 mM, Hình Tế bào Lactobacillus (Lac.VFE-14) nhuộm gram quan sát kính hiển vi điện tử Định tính định lƣợng H2O2 Phương pháp đo màu dựa HRP/TMB sử dụng để xác định có mặt H2O2 dịch ni vi khuẩn có độ nhạy cao độc tính thấp (Xianyu et al., 2013) Các phản ứng màu với TMB có độ nhạy cao, nồng H2O lượng ứng màu với TMB phát có độhiện nhạyđược cao, phátđộhiện độrất H2O2 từ lượng thấp từ từ nồng thấp từ nanomolar đến millimolar) (Martin et molar đến millimolar) al.,(Martin 2010) et al., 2010) ĐC Lac VFE-04 Lac VFE-08 Lac VFE-14 Hình Khả sinh H2O2 chủng vi khuẩn Lactobacillus so với đối chứng Sau bổ sung HRP TMB vào dịch nuôi vi khuẩn Lactobacillus ly tâm, môi trường chuyển từ màu vàng sang xanh hầu hết mẫu với độ đậm nhạt khác 87 Ha Thi Thu et al Lac.VFE-08 Lac.VFE-04 với nồng độ H2O2 tương ứng đạt 2,081 mM 2,067 mM sau 24 nuôi cấy Lượng H2O2 sinh chủng phân lập tương đối cao so với với chủng nghiên cứu trước Nghiên cứu cho thấy khả sinh H2O2 phụ thuộc vào loài cụ thể Trong thí nghiệm Hertzberger et al (2014), khả sinh H2O2 chủng L johnsonni NCC 533 mM, khả sản sinh H2O2 L plantarum 2142 0,16 mM L casei Shirota 0,056 mM (Zalán et al., 2005) Nguồn cacbon có ảnh hưởng định đến nồng độ H2O2 Khi sử dụng nguồn carbon galactose, L bulgaricus sản xuất lượng H2O2 cao 0,02 mM, sorbitol sử dụng, lượng H2O2 tạo 0,0006 mM Ngoài ra, nguồn nitơ hay yếu tố nhiệt độ có khả tác động lên khả sinh H2O2 vi khuẩn (Enitan et al., 2011) Như vậy, điều kiện nuôi cấy khác tổng hợp H2O2 khác Lượng H2O2 sản xuất phụ thuộc vào khả chủng vi sinh vật Ngồi ra, phương pháp định lượng có ảnh hưởng lớn đến việc xác định nồng độ H2O2 mà vi sinh vật sản xuất mơi trường Vì cần tối ưu điều kiện nuôi cấy chọn lọc chủng vi sinh vật để thu hàm lượng H2O2 cao nhất, đồng thời cần lựa chọn phương pháp định lượng phù hợp để xác định hàm lượng H2O2 vi sinh vật tổng hợp Hình Đường chuẩn thể mối tương quan nồng độ H2O2 mật độ quang sản phẩm màu sau phản ứng với TMB Bảng Giá trị trung bình lần đo OD620nm hàm lượng H2O2 có dịch nuôi Chủng vi khuẩn Giá trị OD620nm Nồng độ H2O2 (mM) Lac.VFE-04 0,976 ± 0,011 2,067 ± 0,008 Lac.VFE-08 0,981 ± 0,012 2,081 ± 0,003 Lac.VFE-09 0,621 ± 0,017 1,005 ± 0,012 Lac.VFE-14 1,015 ± 0,014 2,183 ± 0,006 Lac.VFE-16 0,557 ± 0,012 0,812 ± 0,012 Lac.VFE-17 0,454 ± 0,013 0,504 ± 0,001 Lac.VFE-48 0,560 ± 0,012 0,822 ± 0,002 Lac.VFE-72 0,327 ± 0,011 0,125 ± 0,005 Lac.VFE-76 0,294 ± 0,014 0,024 ± 0,001 Khả chịu pH axit muối mật chủng đƣợc chọn lọc 88 Để đến ruột non đại tràng người, thực chức sinh học, vi sinh H2O2 production in Lactobacillus strains isolated vật cần phải vượt qua dày, nơi có pH thấp (pH < 3) (Derrien etal., 2015) Khả chịu axit chủng vi khuẩn khảo sát cách xác định số lượng khuẩn lạc sau ủ vi khuẩn pH Kết thể bảng Sau ủ pH 3, tỷ lệ sống sót chủng vi khuẩn cao, tương ứng 95,27%, 94,15% 98,54% Ở pH 2, lượng tế bào sống so với đối chứng tương đối cao, với tỷ lệ sống Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 Lac.VFE-14 tương ứng 85,12%, 84,51% 88,22% Sau di chuyển qua dày, vi sinh vật lại phải đối mặt với dịch mật Sự tiếp xúc với mật thử thách cho vi khuẩn xâm nhập vào đường tiêu hóa Muối mật hoạt động chất tẩy rửa sinh học, làm phá hủy màng tế bào vi khuẩn, muốn tồn vi khuẩn phải có khả chịu muối mật (Urdaneta et al., 2017) Vì khả chịu axit muối mật đặc tính quan trọng cần có hệ vi khuẩn đường ruột Bảng Tỷ lệ sống sót sau ủ chủng vi khuẩn chọn lọc so với đối chứng Tỷ lệ sống sót sau ủ (%) Chủng 0,3% muối mật pH pH Lac.VFE-04 97,02 ± 1,12 85,12 ± 5,44 95,27 ± 3,21 Lac.VFE-08 95,15 ± 1,14 84,51 ± 8,01 94,15 ± 5,69 Lac.VFE-14 99,08 ± 1,02 88,22 ± 5,14 98,54 ± 6,68 Nồng độ muối mật 0,3% xem nồng độ quan trọng để xác định khả chịu muối mật chủng vi khuẩn probiotic LAB (Belicová et al., 2013) Hầu hết chủng thử nghiệm trì khả sinh trưởng tốt mơi trường MRS có bổ sung muối mật 0,3% So với đối chứng khơng có muối mật, tỷ lệ sinh trưởng chủng dao động từ 90 đến 99% Chủng Lac.VFE-14 có khả sinh trưởng tốt với tỷ lệ 99,08%, gần khơng có khác biệt so với đối chứng Các chủng Lac.VFE-04 Lac.VFE-08 có tỷ lệ sống sót tương ứng 97,02% 95,15% (bảng 2) Kết cho thấy, chủng vi khuẩn nghiên cứu có khả chịu axit muối mật tốt so với với chủng vi khuẩn lactic nghiên cứu trước Trong nghiên Nguyễn Văn Thanh nnk (2007) môi trường pH 4, tỷ lệ sống chủng L acidophilus L casei 41 65% Trong điều kiện pH 2, tỷ lệ sống sót chủng vi khuẩn lactic L casei VTCC186 L pentosus D3 sản phẩm kefir chanh dây 39,36 52,01% Các chủng có khả sinh trưởng mơi trường có diện muối mật với nồng độ 0,3% (Quách Đức Tính nnk., 2013) Một nghiên cứu khác (Shehata et al., 2016) cho thấy, mơi trường MRS có bổ sung 0,3% muối mật, tỷ lệ sống sót chủng vi khuẩn lactic dao động khoảng 69,8 đến 85% Các chủng có tỷ lệ sống sót từ 68 đến 88,3% sau ủ môi trường dịch dày nhân tạo pH Như vậy, thấy, so với chủng nghiên cứu trước đây, chủng Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 Lac.VFE-14 có khả chịu pH axit muối mật vượt trội hẳn Kết định danh vi khuẩn theo phƣơng pháp giải trình tự gen 16S rRNA Sau so sánh trình tự 16S rRNA chủng chọn lọc với trình tự 16S rRNA cơng bố ngân hàng gen (NCBI), cho thấy Lac.VFE-14 Lac.VFE-04 có mức độ tương đồng 100% 99% tương ứng so với chủng L plantarum ZZU 23 L plantarum S7 Trong đó, Lac.VFE-08 có độ tương đồng lên tới 98,65% so với L rhamnosus JCM 1136 (bảng 3) 89 Ha Thi Thu et al Bảng Kết so sánh với trình tự 16S công bố ngân hàng gen (NCBI) Lac.VFE -04, Lac.VFE -08 Lac.VFE -14 Identify Kí hiệu chủng Mã số đăng ký Tên chủng phân lập NCBI (Tương đồng) L plantarum S7 GU195646.1 99% Lac.VFE -04 L plantarum T3R1C1 JX193637.1 99% L plantarum ST-III CP002222.1 99% L rhamnosus JCM 1136 NR_113332.1 98,65% Lac.VFE -08 L rhamnosus NBRC 3425 NR_043408.1 98,38% L rhamnosus JCM 1136 NR_043408.1 98,38% L.plantarum ZZU 23 AB830324.1 100% Lac.VFE -14 L plantarum C KM507561.1 100% L plantarum KLB 416 KM670024.1 100% Nhóm Nhóm Hình Quan hệ phát sinh chủng loại trình tự gene 16S chủng phân lập Lac VFE-04, Lac VFE-08, Lac VFE-14 phân tích phần mềm MEGA7 Neighbor-Joining Tree Với kết này, xây dựng phát sinh chủng loại để đánh giá mối quan hệ di truyền chủng phân lập với số chủng thuộc chi Lactobacillus Kết thu cho thấy, chủng khảo sát chia thành nhóm rõ rệt Trong đó, nhóm cho thấy chủng phân lập Lac VFE-08 có mối quan hệ di truyền gần với chủng L rhamnosus JCM 1136 chủng thuộc chi Lactobacillus L paracasei, L casei L zeae (hình 4) Nhóm 2, chủng phân lập Lac VFE-04, Lac VFE-14 thể mối quan hệ di truyền cao với chủng thuộc loài L plantarum Dựa kết phát sinh lồi, dịng Lac.VFE-04 Lac.VFE-14 có quan hệ gần với L plantarum Lac.VFE-08 L rhamnosus 90 Khả ức chế sinh trƣởng vi khuẩn gây bệnh S aureus S aureus tác nhân gây nhiễm trùng người động vật (Johansson et al., 2016; Ren et al., 2017) Việc sử dụng kháng sinh liều cao để tiêu diệt vi khuẩn có nguy gây kháng kháng sinh Vì vậy, sản phẩm probiotics sử dụng liệu pháp thay kháng sinh để chống lại vi khuẩn (Eggers et al., 2018) Lactobacillus biết đến từ lâu với khả sinh chất kháng khuẩn bao gồm H2O2, kháng sinh, axit hữu Trong nghiên cứu này, dịch nuôi vi khuẩn loại bỏ tế bào chủng vi khuẩn Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 Lac.VFE-14 thể khả ức chế sinh trưởng vi khuẩn S aureus ATCC-23235, khả ức chế chủng khác thể hình Hoạt tính ức chế sinh trưởng S aureus ATCC-23235 chủng vi khuẩn xác định cách đo đường kính vịng kháng khuẩn đĩa petri Chủng Lac.VFE-14 có đường kính vịng kháng khuẩn lớn 19,0 ± 1,0 mm, chủng Lac.VFE-08 với đường kính 14,0 ± 1,0 mm vàLac.VFE-04 11,7 ± 1,3 mm H2O2 production in Lactobacillus strains isolated (2,183 mM), Lac.VFE-08 (2,081 mM) Lac.VFE-04 (2,067 mM) Kết trình tự 16S rARN chủng cho thấy Lac.VFE-14 có độ tương đồng 100% với L plantarum ZZU 23; Lac.VFE-04 có độ tương đồng 99% với L plantarum S7 Lac.VFE-08 có độ tương đồng 98,65% với L rhamnosus JCM 1136 Sản phẩm tiết chủng có tác dụng ức chế vi khuẩn S aureus ATCC-23235 Các chủng có tiềm dùng cho sản xuất probiotic nhờ khả chịu môi trường pH axit muối mật khả ức chế sinh trưởng vi khuẩn S aureus ATCC-23235 Hình Khả ức chế sinh trưởng S aureus chủng Lactobacillus Trong nghiên cứu L rhamnosus, Fornitano et al (2019) cho thấy khả ức chế sinh trưởng S aureus làm giảm khả sản xuất enzyme gây độc coagulase (giảm từ 20,45 đến 22,73%) Đối với probiotic L rhamnosus HN001, sau tuần thử nghiệm đối tượng binh sĩ dương tính với nhiễm S aureus, số lượng S aureus giảm 73 đến 83% so với nhóm dùng giả dược (Eggers et al., 2018) Nghiên cứu Misaghi et al (2017) cho thấy vi khuẩn Lactobacillus gồm L acidophilus, L fermentum L paracasei ức chế sản xuất Staphylococcal enterotoxin (SE) bao gồm SEA, SEC SEE vi khuẩn S aureus Như vậy, thấy chủng vi khuẩn Lac.VFE-04, Lac.VFE-08 Lac.VFE-14 nghiên cứu có khả ức chế sinh trưởng S aureus ATCC-23235, có tiềm tương lai để hỗ trợ điều trị bệnh nhiễm trùng S aureus KẾT LUẬN Chúng phân lập 115 chủng Lactobacillus môi trường MRS từ mẫu phân người khỏe mạnh Trong đó, ba chủng biểu hoạt tính sinh H2O2 mạnh Lac.VFE-14 Lời cảm ơn: Cơng trình thực nhờ hỗ trợ kinh phí từ đề tài mã số CT0000.03/18-19 TS Nguyễn Thị Tuyết Nhung làm chủ nhiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO Belicová A., Mikulášová M., Dušinský R., 2013 Probiotic potential and safety properties of Lactobacillus plantarum from Slovak Bryndza cheese BioMed research international, 2013(ID 760298): pp Bermudez-Brito M., Plaza-Díaz J., MozQuezada S., Gómez-Llorente C., Gil A., 2012 "Probiotic mechanisms of action." Annals of Nutrition and Metabolism, 61(2): 160–174 Boateng, M., S Price, K Huddersman and S E Walsh , 2011 Antimicrobial activities of hydrogen peroxide and its activation by a novel heterogeneous Fenton’s‐ like modified PAN catalyst Journal of applied microbiology, 111(6): 1533–1543 Chen C., Lai C., Huang L., Huang Y., Toh S., Weng C., Chuang C., Lu C., H.-J Tang , 2019 Antimicrobial activity of Lactobacillus species against carbapenemresistant Enterobacteriaceae Frontiers in microbiology, 10: 789 Corry J.E.L., Curtis G.D.W., Baird R M., 2003 Handbook of Culture Media for Food Microbiology Elsevier Science, 37 91 Ha Thi Thu et al Davoodabadi A., Dallal M M S., Foroushani A R., Douraghi M., Harati F A., 2015 Antibacterial activity of Lactobacillus spp isolated from the feces of healthy infants against enteropathogenic bacteria Anaerobe, 34: 53–58 Derrien M., van Hylckama Vlieg J E., 2015 Fate, activity, and impact of ingested bacteria within the human gut microbiota Trends in microbiology, 23(6): 354–366 Thi Bich Thuy Do, Thi Diem Huong Nguyen, 2018 Determination of salt intolerance and probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from gut of Decapterus lajang HUAF journal of agricultural science & technology, Hue University University of Agriculture and Forestry, 2(2): 799–806 [in Vietnamese] Eggers S., Barker A K., Valentine S., Hess T., Duster M., Safdar N., 2018 Effect of Lactobacillus rhamnosus HN001 on carriage of Staphylococcus aureus: results of the impact of probiotics for reducing infections in veterans (IMPROVE) study BMC infectious diseases, 18(1): 129 Enitan A., Adeyemo J., Ogunbanwo S., 2011 Influence of growth conditions and nutritional requirements on the production of hydrogen peroxide by lactic acid bacteria African journal of microbiology research, 5(15): 2059–2066 Fornitano A., Amêndola I., Santos S., 2019 Lactobacillus rhamnosus versus Staphylococcus aureus: influence on growth and expression of virulence factors J Dent Maxillofacial Res, 2(2): 29–33 Hertzberger R., Arents J., Dekker H L., Pridmore R D., Gysler C., Kleerebezem M., de Mattos M J T., 2014 H2O2 production in species of the Lactobacillus acidophilus group: a central role for a novel NADHdependent flavin reductase Appl Environ Microbiol., 80(7): 2229–2239 92 Johansson M A., Björkander S., Mata Forsberg M., Qazi K R., Salvany Celades M., Bittmann J., Eberl M., SverremarkEkström E., 2016 Probiotic lactobacilli modulate Staphylococcus aureus-induced activation of conventional and unconventional T cells and NK cells Frontiers in immunology, 7: 273 Kang D.-K., Oh H., Ham J.-S., Kim J., Yoon C., Ahn Y., Kim H., 2005 Identification and characterization of hydrogen peroxide-generating Lactobacillus fermentum CS12-1 Asian-australasian journal of animal sciences, 18(1): 90–95 Nanda., Chaudhary., Kumar., 2018 Molecular Approaches for Identification of Lactobacilli from Traditional Dairy Advances in Animal Biotechnology and its Applications, 181–196 Van Thanh Nguyen, Thu Hoa Tran, Vu Tuong Vy Nguyen, 2007 Investigation of acid, bile salt and antibiotic tolerance of some oral probiotics Pharmaceutical journal, 378: 255–263 [in Vietnamese] Markowiak P., Śliżewska K., 2017 Effects of probiotics, prebiotics, and synbiotics on human health Nutrients, 9(9): 1021 Martín R., Suárez J E., 2010 Biosynthesis and degradation of H2O2 by vaginal lactobacilli Appl Environ Microbiol., 76(2): 400–405 Misaghi A., Parsaeimehr M., Akhondzadeh A., Gandomi H., Azizkhani M., 2017 The inhibitory effects of Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus paracasei isolated from yoghurt on the growth and enterotoxin A gene expression of S aureus Iranian Journal of Veterinary Medicine, 11(2): 191–201 Tomas Vetrovsky, Petr Baldrian , 2013 The Variability of The 16S rRNA Gene in Bacterial Genomes and Its Consequences for Bacterial Community Analyses Plos One 8: (2) Duc Tinh Quach, Thanh Trung Tong, Ngoc Duy Nguyen, Thuy Huong Nguyen, 2013 H2O2 production in Lactobacillus strains isolated Investigation of some probiotic properties of traditional and Lactobacillus casei VTCC186-supplemented Kefir Science & Technology Development, 16(3): 40–47 [in Vietnamese] Ren D., Gong S., Shu J., Zhu J., Rong F., Zhang Z., Wang D., Gao L., Qu T., Liu H., 2017 Mixed Lactobacillus plantarum strains inhibit Staphylococcus aureus induced inflammation and ameliorate intestinal microflora in mice BioMed research international., 2017(ID 7476467): pages Shehata M., El Sohaimy S., El-Sahn M A., Youssef M.,2016 Screening of isolated potential probiotic lactic acid bacteria for cholesterol lowering property and bile salt hydrolase activity Annals of Agricultural Sciences, 61(1): 65–75 Urdaneta V., Casadesús J., 2017 Interactions between bacteria and bile salts in the gastrointestinal and hepatobiliary tracts Frontiers in medicine, 4: 163 Xianyu Y., Zhu K., Chen W., Wang X., Zhao H., Sun J., Wang Z., Jiang X., 2013 Enzymatic assay for Cu (II) with horseradish peroxidase and its application in colorimetric logic gate Analytical chemistry, 85(15): 7029–7032 Zalán Z., Németh E., Baráth Á., Halász A., 2005 Influence of growth medium on hydrogen peroxide and bacteriocin production of Lactobacillus strains Food Technology and Biotechnology, 43(3): 219–225 93 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 161-168, 2020 KHẢ NĂNG ĐỒNG PHÂN HÓA LINOLEIC ACID CỦA CÁC CHỦNG LACTOBACILLUS PHÂN LẬP TỪ HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT Ở NGƯỜI Trần Xuân Thạch1, Hà Thị Thu1, Vũ Thị Hiền1, Hoàng Thế Hưng4, Nguyễn Thị Hoa1, Lê Thị Thu Hồng1, Lưu Đàm Ngọc Anh2, Bùi Văn Hướng2, Lã Thị Lan Anh3, Đồng Văn Quyền1, Nguyễn Thị Tuyết Nhung1,  Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Nghiên cứu Khoa học Hậu cần Quân - Học viện Hậu cần  Ngƣời chịu trách nhiệm liên lạc E-mail: nttnhung@gmail.com Ngày nhận bài: 27.6.2019 Ngày nhận đăng: 03.9.2019 TÓM TẮT Linoleic acid liên hợp (conjugated linoleic acid - CLA) có nhiều lợi ích cho sức khỏe, bao gồm chống ung thƣ, chống xơ vữa, chống tiểu đƣờng, chống nhiễm trùng, giảm cholesterol, chống oxy hóa, chống vi khuẩn, điều chế hệ miễn dịch đặc tính kích thích tăng trƣởng Ở ngƣời, CLA đƣợc sản xuất từ Linoleic acid (LA) vi khuẩn đƣờng ruột Trong nghiên cứu này, mƣời chín chủng Lactobacillus (Lac.) phân lập từ vi khuẩn đƣờng ruột ngƣời đƣợc xác định khả chuyển hóa LA chúng Các vi khuẩn đƣợc nuôi môi trƣờng MRS dạng lỏng, yếm khí có bổ sung 0,5 mg/mL LA Hoạt tính đồng phân hóa LA vi khuẩn mơi trƣờng MRS đƣợc xác định sắc ký khí Kết cho thấy, số 19 chủng, bao gồm chủng Lac.02, Lac.05, Lac.14 Lac.16 có khả tạo khoảng 40-50 μg/mL CLA từ LA Trong số đó, khả tạo CLA cao chủng Lac.02 Trong trình tạo CLA từ LA, enzyme liên quan đến q trình chuyển hóa Lactobacillus đóng vai trị chất xúc tác cho q trình thêm vào loại gốc OH (CLA-HY), oxy hóa nhóm OH khử nhóm oxo (CLA-DH), di chuyển liên kết đơi carbon-carbon (CLA-DC) làm bão hịa liên kết đôi carbon-carbon (CLA-ER) Các gen cla-dh, cla-dc, cla-hy cla-er mã hóa cho enzyme CLA-DH, CLA-DC CLA-ER đƣợc tìm thấy chủng Lac.02, Lac.05, Lac.14 Lac.16 Kết sắc ký khí cho thấy chủng tạo cis-9, trans-11 trans-10, cis-12 CLA Trong nghiên cứu tiếp theo, tối ƣu hóa điều kiện nhƣ nồng độ chất, giá trị pH, nhiệt độ thời gian nuôi cấy chủng để thu đƣợc kết tốt Từ khóa: Cis-9, trans-11 CLA, Lactobacillus; linoleate isomerase; trans-10, cis-12 CLA MỞ ĐẦU CLA hỗn hợp đồng phân hình học vị trí LA với liên kết đơi liên hợp Những CLA có nhiều đặc tính sinh học có liên quan đến sức khỏe nhƣ đặc tính chống ung thƣ, chống xơ vữa động mạch (McCrorie et al., 2011), chống đái tháo đƣờng, chống béo phì, giảm cholesterol (Fiona et al., 2007, Tatiana et al., 2015), chống oxy hóa, kháng khuẩn (Rafaela et al., 2012), điều hịa miễn dịch kích thích sinh trƣởng (Marianne et al., 2004) CLA đƣợc tìm thấy chủ yếu thịt sản phẩm từ sữa động vật nhai lại (Sebastiano, 2002) Hoạt tính CLA phụ thuộc vào vị trí nối đơi phân tử Nghiên cứu cho thấy, liên kết đôi CLA đƣợc tìm thấy chủ yếu vị trí 11, hay 10 12 (Alonso et al., 2003) Trong số đồng phân đƣợc tạo thành từ LA cis-9, trans-11 CLA trans-10, cis-12 CLA đồng phân (Akalin et al., 2007, Adamczak et al., 2008, Macouzet et al., 2010) có tác dụng lần lƣợt việc phịng chống ung thƣ chống béo phì (Kelley et al., 2007) Theo Arman đồng tác giả (2016), cis-9, trans-11 CLA điều hòa chất sinh ung thƣ cách tác động lên giai đoạn khác 161 Trần Xuân Thạch et al trình phát triển ung thƣ nhƣ giai đoạn khởi phát, tăng trƣởng, tiến triển, thối hóa (Arman et al., 2016) Bổ sung 1% CLA ức chế tăng sinh khối u (Ip et al., 1991) Ở tế bào đại trực tràng chuột, cis-9, trans-11 CLA hoạt hóa gen tổng hợp caspase caspase 9, qua kích thích tế bào kích hoạt chết theo chƣơng trình - apoptosis (Ewaschuk et al., 2006) Bên cạnh đó, đồng phân trans-10, cis-12 CLA lại có tác dụng việc giảm mỡ thể (Marques et al., 2015) trì trọng lƣợng thể (Sou et al., 1994) Trans-10, cis12 CLA ức chế tổng hợp enzyme quan trọng liên quan đến tổng hợp acid béo, từ giảm tổng hợp chất béo sữa (Baumgard et al., 2000) Trans-10, cis-12 CLA làm tăng hoạt tính enzyme carnitine palmitoyltransferase (CPT), kết làm tăng trình beta oxy hóa acid béo (Park et al., 1997) CLA tác động lên thụ thể alpha đƣợc hoạt hóa peroxisome “peroxisome proliferator-activated receptor alpha” (PPAR-α) để làm tăng trình phân giải lipid gan động vật (Lee et al., 2007) Nhiều nghiên cứu cho thấy, số vi khuẩn có chi Lactobacillus phân lập từ hệ vi sinh vật đƣờng ruột ngƣời có khả tạo CLA từ LA (Ewaschuk et al., 2006, Rosberg-Cody et al., 2011, Kishino et al., 2013) Hơn nữa, cis-9, trans-11 trans-10, cis-12 CLA đƣợc xác định đồng phân q trình chuyển hóa (Alonso et al., 2003) Lee đồng tác giả báo cáo L rhamnosus PL60 có nguồn gốc từ ngƣời, có khả sản xuất trans-10, cis-12 CLA từ LA L casei tạo nhiều đồng phân trans-10, cis-12 CLA cis-9, trans-l1 CLA (Anil et al., 2009) L plantarum ZS2058 chuyển hóa 37,78% linoleic acid thành cis- 9, trans-11 CLA 16,57% thành trans-9, trans-11 CLA (Yang et al., 2014) Tại Việt Nam, số 100.000 ngƣời chết ung thƣ năm với số ca tử vong ung thƣ đại trực tràng ƣớc tính khoảng 55.000 trƣờng hợp Bên cạnh đó, tốc độ gia tăng tỉ lệ ngƣời cân, béo phì Việt Nam nằm nhóm nƣớc có tỉ lệ gia tăng nhanh giới Với tác dụng có lợi cho sức khỏe CLA việc phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn Lactobacillus có ích từ hệ vi sinh vật đƣờng ruột ngƣời có khả chuyển hóa LA thành CLA nhƣ probiotic cần thiết để tăng lƣợng CLA đƣa vào thể ngƣời thu đƣợc lợi ích hữu hiệu CLA (McCrorie et al., 2011) 162 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguồn mẫu phân lập Các mẫu phân đƣợc ngƣời tình nguyện tham gia khu vực Hà Nội tự thu thập phân sau để hộp vơ trùng Mẫu sau giữ lạnh 4°C chuyển đến phịng thí nghiệm để phân tích Phân lập vi khuẩn Lactobacillus Một gram phân đƣợc hòa mL nƣớc muối sinh lý vơ trùng Dung dịch sau đƣợc pha lỗng 10 lần liên tiếp 10-7 Mỗi nồng độ pha loãng từ 10-4 đến 10-7 đƣợc cấy gạt môi trƣờng thạch MRS đƣợc nuôi cấy điều kiện kị khí 37°C vịng 48 đến 72 h Các khuẩn lạc phát triển đĩa MRS đƣợc lựa chọn làm cách ria pha loãng đĩa MRS để thu nhận khuẩn lạc riêng lẻ Các khuẩn lạc phân lập kiểm tra hoạt tính catalase nhuộm Gram, khuẩn lạc âm tính với hoạt tính catalase Gram dƣơng đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu Những khuẩn lạc đƣợc giữ đĩa thạch MRS để sử dụng cho nghiên cứu tiếp đƣợc lƣu trữ lâu dài -80°C dịch MRS có bổ sung 20% glycerol Tuyển chọn chủng Lactobacillus biểu enzyme isomerase Quá trình chuyển hóa LA thành CLA vi khuẩn Lactobacillus gồm nhiều bƣớc với kết hợp enzyme bao gồm enzyme xúc tác hydrat hóa/dehydrat (CLA-HY), oxy hóa nhóm hydroxy/sự khử nhóm oxo (CLA-DH), di chuyển nối đơi carbon-carbon (CLA-DC), bão hịa liên kết đôi carbon-carbon (CLA-ER) (Kishino et al., 2013) Để sàng lọc chủng mang gen giúp chuyển hóa LA thành CLA sử dụng phƣơng pháp PCR với mồi đặc hiệu, bao gồm gen mã hóa CLADH (F: 5’- AGC TAG TGT CGA CGA TGC GG-3’; R: 5’-GAC GGT ATC GGC AAT CGT ATC-3’), CLA-DC (F: 5’- ATG CCA CTG ACG AAG CGG TG-3’; R: 5’-TGT CGC AGC ATC AAC TTC GTC3’), CLA-HY (F: 5’- TGG TGT TGA TAT GCA CGG TGC-3’; R: 5’-AGT CTG CGC ATC CTC AAT GAC-3’) CLA-ER (F:5’ CAGACGTGATGTTTAACCGC-3’; R: 5’ CAGTCTGTGTTTTGGCATCG-3’) Các cặp mồi đƣợc thiết kế sở trình tự hệ gen chủng Lactobacillus công bố GenBank [cladh (GenBank NC-004567)], [cla-dc (GenBank NC004567)], cla-er (GenBankNC-004567)] Sản phẩm PCR đƣợc tách dòng vào vector tách dòng pCR2.1 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 18(1): 161-168, 2020 (Invitrogen), giải trình tự máy xác định trình tự DNA tự động so sánh với gen loại GenBank phần mềm tin sinh chuyên dụng nhƣ mô tả nghiên cứu trƣớc (Đỗ Thị Ngọc Huyền et al., 2005) Những chủng mang gen đƣợc lựa chọn để thử nghiệm khả đồng phân hóa LA Xác định khả chuyển hóa LA thành đồng phân cis-9, trans-11 trans-10, cis-12 CLA Các chủng mang gen mã hóa cho LA isomerase đƣợc kiểm tra; cấy chuyển ba lần MRS sử dụng 1% dịch vi khuẩn ủ 18 37oC Dung dịch MRS đƣợc bổ sung 0,5 mg/mL LA (Sigma, USA) Các LA đƣợc hòa vào 1% Tween 80 trƣớc bổ sung vào môi trƣờng Môi trƣờng đƣợc cấy 1% vi khuẩn ủ 37°C với thời gian ủ khác Sau thời gian ủ, mẫu từ nồng độ đƣợc lấy để đá Đo pH, xác định mật độ vi khuẩn cách trải đĩa MRS ủ 37°C vịng 48 đến 72 h Sau dịch ni đƣợc ly tâm 23.500×g 10 4°C Loại bỏ cặn tế bào thu dịch để phân tích CLA KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân lập tuyển chọn chủng Lactobacillus Tổng số 195 chủng Lactobacillus phân lập đƣợc môi trƣờng MRS từ mẫu phân ngƣời khỏe mạnh khu vực Hà Nội Trên môi trƣờng MRS số lƣợng khuẩn lạc xuất nhiều với hình dạng màu sắc khác so với môi trƣờng nƣớc ép cà chua Briggs hay môi trƣờng chiết xuất thịt cà chua de Man (Lee et al., 2008) Các khuẩn lạc thu đƣợc hầu hết có hình dạng lồi, khơng nhăn, trắng đục, khơng màu, rìa trơn xẻ thùy Các mẫu phân lập đƣợc làm cách ria cấy đĩa thạch MRS để thu đƣợc khuẩn lạc khiết Sau nhuộm Gram, hoạt tính catalase kiểm tra đồng dƣới kính hiển vi quang học, 19 chủng đƣợc chọn lọc để kiểm tra khả chuyển hóa LA thành CLA Khả chuyển hóa LA thành CLA Khả biến đổi LA thành CLA vi khuẩn đƣợc biết đến từ năm 1980 (Arion et al., 2010) Mƣời chín chủng vi khuẩn Lactobacillus Thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần vào ngày khác Xác định đồng phân CLA sắc ký khí Sự có mặt đồng phân dịch nuôi tế bào đƣợc xác định phƣơng pháp sắc ký khí (GC) nhƣ mơ tả nghiên cứu Yang đồng tác giả (2014) Các bƣớc đƣợc tiến hành nhƣ sau: bổ sung 217 µg chất nội chuẩn, C17: heptadecanoic acid vào mL dịch Sau thêm vào mL isopropanol, hỗn hợp đƣợc vortex 30 s Tiếp theo, bổ sung mL nhexane vortex, ly tâm 5000×g phút Lớp hexan thu đƣợc (có chứa lipid) đƣợc làm bay khí nitrogen Các đồng phân đƣợc biến đổi thành methyl este tƣơng ứng với (trimetylsilyl)diazomethane (Sigma, USA) Các FAME (fatty acid methyl ester) đƣợc chiết xuất n-hexane phân tách cột phân tách dùng sắc ký khí (Shimadzu, Japan) Các đồng phân CLA đƣợc xác định thời gian lƣu với tham chiếu tiêu chuẩn pha CLA (Sigma, USA) Lƣợng CLA thu đƣợc dịch nuôi sau ủ với Lactobacillus hình que, Gram dƣơng có hoạt tính enzyme catalase âm tính đƣợc kiểm tra khả chuyển hóa LA Kết Hình cho thấy, hầu hết chủng có khả chuyển hóa LA thành CLA nhƣng với mức độ khác Bốn chủng Lac.02, Lac.05, Lac.14 Lac.16 có hoạt tính cao so với 15 chủng lại Những nghiên cứu trƣớc cho thấy, vi khuẩn Lactobacillus tạo từ đến 56% CLA mơi trƣờng ni cấy có bổ sung LA tự (Yang et al., 2014) Hơn hoạt tính đồng phân hóa LA Lactobacillus tùy thuộc vào lồi Theo Pei đồng tác giả, hiệu suất chuyển đổi từ LA thành CLA chủng L plantarum lp15 25% (Pei et al., 2011) L reuteri đạt hiệu suất 54,35% (Sun et al., 2003) Ngoài ra, hiệu suất phản ứng chuyển hóa LA thành CLA quy mơ phịng thí nghiệm cịn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhƣ thành phần môi trƣờng, nồng độ chất LA, giá trị pH nhiệt độ nuôi cấy Alonso đồng tác giả (2003) cho thấy nuôi cấy L acidophilus L1 môi trƣờng MRS có bổ sung 0,02% LA cho hiệu suất chuyển hóa thành CLA cao bổ sung 0,05% LA Thêm 163 Trần Xuân Thạch et al vào đó, nhiệt độ nuôi cấy 37ºC, lƣợng CLA thu đƣợc cao sau 24 h so với lƣợng CLA 36, 48 72 h (Alonso et al., 2003) Ngƣợc lại, có tác giả lại cho phần lớn CLA đƣợc tạo thành sau chủng đạt đến pha cân bằng, 36 h nuôi cấy Trong nghiên cứu khác, tác giả Ty đồng tác giả (2002) cho biết thử nghiệm với L acidophilus (CCRC14079) pH 5, 6, 7, 8, kết cho thấy lƣợng CLA đƣợc tạo pH cao (TY et al., 2002) Nhƣ thấy việc tối ƣu hóa điều kiện ni cấy chủng vi khuẩn Lac.02, Lac.05, Lac.14 Lac.16 cần thiết Hình Hoạt tính chuyển hóa LA (0.5 mg/mL) thành CLA 19 chủng vi khuẩn phân lập từ phân người khỏe mạnh Hà Nội Gen quy định enzyme mã hóa cho LA isomerase Linoleate isomerase enzyme đa thành phần tham gia trình sản xuất CLA từ LA vi khuẩn lactic Dựa vào trình tự hệ gen đƣợc cơng bố GenBank, thiết kế cặp mồi đặc hiệu để nhân lên đoạn gen cla-dh (529bp), cla-dc (681bp), cla-er (654bp) cla-hy (717bp) Sản phẩm PCR thu đƣợc cho thấy, chủng chọn lọc xuất hiên đầy đủ gen nêu với kích thƣớc theo nhƣ dự đoán lý thuyết (cla-dh 529 bp; cla-dc - 681 bp; cla-er - 654 bp cla-hy 717 bp) Theo công bố Kishino đồng tác giả, (2013), Lactobacillus gen mã hóa cho CLADH, CLA-DC, CLA-ER tạo thành cụm gen (Kishino et al., 2013) Giống nhƣ L plantarum, L casei L rhamnosus có cụm gen CLA-HY Ngoài ra, loài vi khuẩn lactic khác chứa từ đến gen nói Ví dụ, L salivarius có gen cla-dc, cla-er cla-hy; L cripatus có nhƣng lại cla-dh, cla-er cla-hy Có nghiên cứu cho phải có kết hợp gen cho sản phẩm CLA từ LA Bên cạnh đó, sản phẩm CLA tạo tùy thuộc vào thành 164 phần enzyme cụ thể (Kishino et al., 2013) Cụ thể, phản ứng đồng phân hóa đƣợc xúc tác CLAHY cho trans-10, cis-12 CLA, cịn phản ứng đồng phân hóa đƣợc xúc tác kết hợp hoạt động CLA-HY, CLA-DH, CLA-DC cho cis-9, trans11 trans-9, trans-11 CLA Trong chủng vi khuẩn Lac.02, Lac.05, Lac.14 Lac.16 đƣợc kiểm tra, thành phần enzyme thuộc hệ thống LA isomerase có mặt, kết cho thấy chủng vi khuẩn tạo nhiều loại đồng phân CLA khác Các loại đồng phân CLA khác tạo Khả chuyển hóa LA thành CLA vi khuẩn đƣợc biết đến từ năm 1980 (Haiqin et al., 2012) Có đến đồng phân CLA mà vi khuẩn Lactobacillus tạo từ LA cis-9, trans- 11 CLA trans-10, cis- 12 CLA đƣợc xem đồng phân Một số chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả tạo cis-9, trans-11CLA trans-10, cis-12 CLA nhƣ đồng phân Tuy nhiên, số chủng có khả tạo đồng phân với lƣợng tƣơng đƣơng (Julia et al., 2006) Thử nghiệm khả đồng phân hóa LA chủng vi khuẩn chọn lọc, kết Trần Xuân Thạch et al Bảng cho thấy có khoảng gần 10% LA đƣợc chuyển hóa thành CLA Trong nghiên cứu này, sử dụng phƣơng pháp sắc ký khí để phân tách định lƣợng đồng phân tạo từ bốn chủng vi khuẩn Lac.02, Lac.05, Lac.14 Lac.16, chúng tơi thu đƣợc kết Hình Hình Gen mã hóa linoleic acid isomerase chủng LA 02, LA05, LA12 LA16 (1) cla-hy; (2): cla-dc; (3) cla-er ; (4): cla-dh Bảng Tỉ lệ thành phần CLA Linoleic acid (%) cis-9, trans-11 CLA (%) trans-10, cis-12-CLA (%) Thành phần CLA khác (%) LA 90,51 0,08 2,08 7,33 LA 91,34 0,07 1,2 7,39 LA 14 92,61 0,07 0,68 6,64 LA 16 95,84 0,07 0,18 3,91 162 Trần Xuân Thạch et al Hình Đặc điểm CLA tạo (1) Linoleic Acid; (2) Cis-9, trans-11 CLA; (3) Trans-10, cis-12 CLA Các chủng chuyển hóa LA tự thành cis-9, trans-11, trans-10, cis-12 CLA Kết hình cho thấy, số đồng phân cis/trans trans/trans CLA có phân tách riêng rẽ Trong có cis-9, trans -11 trans -10, cis -12 CLA Kết định lƣợng (bảng 1) cho thấy, trans10, cis-12 CLA đƣợc tạo từ chủng vi khuẩn Lac.02, Lac.05, Lac.14 Lac.16 có khác biệt, với kết cao thu đƣợc chủng Lac.02, thấp chủng Lac.16 Trong đó, Cis-9, trans-11 CLA đƣợc tạo với mức độ gần tƣơng đƣơng chủng vi khuẩn thử nghiệm Nhƣ đề cập, hiệu suất phản ứng đồng phân hóa LA phụ thuộc vào nhiều yếu tố Trong nghiên cứu Niu đồng tác giả (2007) cho thấy, sản phẩm CLA tạo L plantarum ZS2058, Cis-9, trans11 CLA chiếm đến 96,4 % Ngƣợc lại, L acidophilus lại sản xuất trans-10, cis-12 CLA chủ yếu đƣơc nuôi cấy môi trƣờng MRS có bổ sung LA (Ty et al., 2002) Kết tƣơng tự đƣợc quan sát nghiên cứu trƣớc, ví dụ nhƣ L reuteri cho thấy độ đặc hiệu cao cho việc sản xuất đồng phân cis-9, trans-11 CLA nhƣng L gasseri tích lũy nhiều đồng phân trans-10, cis-12 cis-9, trans-11 nuôi điều kiện Ngồi hai đồng phân CLA đƣợc chúng tơi báo cáo (cis-9, trans-10 trans-10, cis-12) có nhiều đồng phân khác có mặt mơi trƣờng mà khơng đƣợc phát phƣơng pháp sắc ký khí đƣợc sử dụng nghiên cứu 166 KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, phân lập đƣợc bốn chủng vi khuẩn Lac.02, Lac.05, Lac.14 Lac.16 có khả chuyển hóa LA thành CLA có ích kiểm tra có mặt gen liên quan đến chuyển hóa LA Những phát khả chuyển hóa LA thành trans-10, cis-12-CLA cis-9, trans-11-CLA chủng Lactobacillus phân lập từ phân ngƣời Việt Nam số liệu lần đầu đƣợc công bố Việt Nam Lời cảm ơn Cơng trình thực với hỗ trợ kinh phí đề tài Nafosted Mã số 106.042017.313, chủ nhiệm: TS Nguyễn Thị Tuyết Nhung TÀI LIỆU THAM KHẢO Adamczak M, Bornscheuer UT, Bednarski W (2008) Properties and biotechnological methods to produce lipids containing conjugated linolleic acid Eur J Lipid Sci Technol 110: 491-504 Akalin AS, Tokusoglu ệ, Gửnỗ S, Aycan S (2007) Occurrence of conjugated linoleic acid in probiotic yoghurts supplemented with fructo oligosaccharide Int Dairy J 17: 1089–1095 Alonso L, Cuesta EP, Gilliland SE (2003) Production of free conjugated linoleic acid by Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei of human intestinal origin J Dairy Sci 86: 1941-1946 Tạp chí Công nghệ Sinh học 18(1): 161-168, 2020 Anil Kumar Puniya, Chaitanya S Reddy, Sanjay Kumar, Kishan Singh (2009) Influence of sunflower oil on conjugated linoleic acid production by Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei Annals of Microbiology 59(3): 505–507 Arion Kennedy, Kristina Martinez, Soren Schmidt, Susanne Mandrup, Kathleen LaPoint, Michael McIntosh (2010) Antiobesity mechanisms of action of conjugated linoleic acid J Nutr Biochem 21(3): 171–179 Arman Arab, Shahab Aldin Akbarian, Reza Ghiyasvand, Maryam Miraghajani (2016) The effects of conjugated linoleic acids on breast cancer: A systematic review Adv Biomed Res 5:115 Baumgard LH, Corl BA, Dwyer DA, Saebo A, Bauman DE (2000) Identification of the conjugated linoleic acid isomer that inhibits milk fat synthesis Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 278(1): 179-184 Đỗ Thị Ngọc Huyền, Trịnh Thị Thu Hằng, Nguyễn Tiến Minh, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Đinh Duy Kháng, Trƣơng Nam Hải, Nguyễn Thuỳ Châu (2005) Tách dòng xác định trình tự gen phyC mã hố cho Phytaza từ chủng Bacillus subtilis Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông thôn 3: 83-86 Ewaschuk JB, Walker JW, Diaz H, Madsen KL (2006) Bioproduction of conjugated linoleic acid by probiotic bacteria occurs in vitro and in vivo in mice J Nutr 136(6): 1483-1487 Fiona Moloney, Sinead Toomey, Enda Noone, Anne Nugent, Bernard Allan, Christine E Loscher, Helen M Roche (2007) Antidiabetic effects of cis-9, trans-11– conjugated linoleic acid may be mediated via antiinflammatory effects in white adipose tissue DIABETES 56: 574-582 HM Lee, Yeonhee Lee (2008) A differential medium for lactic acid-producing bacteria in a mixed culture Lett Appl Microbiol 46(6): 676-681 Haiqin Chen, Bo Yang, Sitian Gu, Baixi Zhang, Qingyan Xu, Qiang Ye, Yuanda Song, Yong Q Chen, Hao Zhang, Wei Chen (2012) Purification and characterization of a linoleate isomerase from Lactobacillus plantarum ZS2058 African Journal of Biotechnology 11(20): 4579-4587 Ip C, Chin SF, Scimeca JA, Pariza MW (1991) Mammary cancer prevention by conjugated dienoic deriative of linoleic acid Cancer Res 51: 6118-6124 Julia B, Ewaschuk John W, Walker Hugo Diaz Karen L, Madsen (2006) Bioproduction of conjugated linoleic acid by probiotic bacteria occurs in vitro and in vivo in mice The Journal of Nutrition 136(6): 1483–1487 Kelley NS, Hubbard NE, Erickson KL (2007) Conjugated linoleic acid isomers and cancer J Nutr 137: 2599–2607 Kishino S, Takeuchi M, Park S B, Hirata A, Kitamura N, Kunisawa J, Kiyono H, Iwamoto R, Isobe Y, Arita M, Arai H, Ueda K, Shima J, Takahashi S, Yokozeki K, Shimizu S, Ogawa J (2013) Polyunsaturated fatty acid saturation by gut lactic acid bacteria affecting host lipid composition PNAS 110(44): 17808-17813 Lee K, Paek K, Lee HY, Park JH, Lee Y (2007) Antiobesity effect of trans-10, cis-12-conjugated linoleic acid-producing Lactobacillus plantarum PL62 on dietincluded obese mice Journal of Applied Microbiology 103: 1140-1146 Macouzet M, Lee BH, Robert N (2010) Genetic and structural comparison of linoleic isomerases from selected food-grade bacteria J Appl Microbiol 109: 2128-2134 Marianne O’Shea, Josep Bassaganya-Riera, Inge CM Mohede (2004) Immunomodulatory properties of conjugated linoleic acid Am J Clin Nutr 79(6): 1199S1206S Marques TM, Wall R, O'Sullivan O, Fitzgerald GF, Shanahan F, Quigley EM, Cotter PD, Cryan JF, Dinan TG, Ross RP, Stanton C (2015) Dietary trans-10, cis-12conjugated linoleic acid alters fatty acid metabolism and microbiota composition in mice Br J Nutr 113(5): 728-738 McCrorie TA, Keaveney EM, Wallace JM, Binns N, L MB (2011) Human health effects of conjugated linoleic acid from milk and supplements Nutr Res Rev 24(2): 206-227 Niu XY, Chen W, Tian FW, Zhao JX, Zhang H (2007) Bioconversion of conjugated linoleic acid by resting cells of Lactobacillus plantarum ZS2058 in potassium phosphate buffer system Acta Meteorol Sin 47: 244–248 Park Y, Albright KJ, Liu W, Storkson JM, Cook ME, Pariza MW (1997) Effect of conjugated linoleic acid on body composition in mice Lipids 32(8): 853-858 Pei Liu, Sheng-rong Shen, Q Z Hui Ruan, Liu-liu Ma, Guo-qing He (2011) Production of conjugated linoleic acids by Lactobacillus plantarum strains isolated from naturally fermented Chinese pickles J Zhejiang Univ Sci B 12(11): 923–930 Rafaela da Silva Marineli, Anne y Castro Marques, Cibele Priscila Busch Furlan (2012) Antioxidant effects of the combination of conjugated linoleic acid and phytosterol supplementation in Sprague–Dawley rats Food Research International 49(1): 487-493 Rosberg-Cody E, Stanton C, O’Mahony L, Wall R, Shanahan F, Quigley EM, Fitzgerald GF, Ross RP (2011) Recombinant lactobacilli expressing linoleic acid isomerase can modulate the fatty acid composition of host adipose tissue in mice Microbiology 157: 609-615 Sebastiano Banni (2002) Conjugated linoleic acid metabolism Current Opinion in Lipidology 13(3): 261-266 167 Trần Xuân Thạch et al Sou F Chin, Jayne M Storkson, Karen J Albright, Mark E Cook, Michael W Pariza (1994) Conjugated linoleic acid is a growth factor for rats as shown by enhanced weight gain and improved feed efficiency The Journal of Nutrition 124(12): 2344–2349 Sun Ok Lee, Chang Sup Kim, Somi Kim Cho, Ha Jong Choi, Geun Eog Ji, Deok-Kun Oh (2003) Bioconversion of linoleic acid into conjugated linoleic acid during fermentation and by washed cells of Lactobacillus reuteri Biotechnology Letters 25(12): 935–938 Tatiana Ederich Lehnen, Marcondes Ramos da Silva, Augusto Camacho, Aline Marcadenti, Alexandre Machado Lehnen (2015) A review on effects of conjugated linoleic fatty acid upon body composition and energetic metabolism J Int Soc Sports Nutr 12:36 TY Lin, CW Lin, YJ Wang (2002) Linoleic acid isomerase activity in enzyme extracts from Lactobacillus acidophilus and Propionibacterium freudenreichii ssp shermanii Journal of Food Science 67(4): 1502-1505 Yang B, Chen H, Gu Z, Tian F, Ross R, Stanton C, Chen Y, Chen W, Zhang H (2014) Synthesis of conjugated linoleic acid by the linoleate isomerase complex in foodderived lactobacilli J Appl Microbiol 117(2): 430-439 CONJUGATED LINOLEIC ACID PRODUCTION FROM VIETNAMESE HUMAN GUT LACTOBACILLUS SPP Tran Xuan Thach1, Ha Thi Thu1, Vu Thi Hien1, Hoang The Hung4, Nguyen Thi Hoa1, Le Thi Thu Hong1, Luu Dam Ngoc Anh2, Bui Van Huong2, La Thi Lan Anh3, Dong Van Quyen1, Nguyen Thi Tuyet Nhung1 SUMMARY Conjugated linoleic acid (CLA) have been shown to exert numerous health benefits, including anticarcinogenic, anti-atherogenic, anti-diabetic, antiobesity, cholesterol reducing, antioxidant, anti-microbial, immune system modulator and growth-stimulating properties In human, CLA is produced from Linoleic acid (LA) by gut bacteria In this study, nineteen Lactobacillus (Lac.) strains isolated from human feces were studied to determine their ability to metabolize LA The bacteria were grown in the liquid form of anaerobic MRS medium supplemented with 0.5 mg/mL LA The linoleate isomerase activity in bacteria grown on MRS medium was determined by Gas chromatograpy The results indicated that out of 19 strains, including strains Lac.02, Lac.05, Lac.14 and Lac.16 are capable of producing about 40-50 μg/mL CLA from LA Among them, the highest ability to produce CLA from LA is Lac.02 strain In the production of CLA from LA, enzymes involved in this metabolism in Lactobacillus act as catalysts of hydration/dehydration (CLA-HY), oxidation of hydroxy groups/reduction of oxo groups (CLA-DH), migration of carbon-carbon double bonds (CLA-DC), and saturation of carbon-carbon double bonds (CLA-ER) The cla-dh, cla-dc, cla-hy and cla-er genes that encode enzymes CLA-DH, CLA-DC, and CLA-ER had been found in all Lac.02, Lac.05, Lac.14 and Lac.16 strains Gas chromatography traces indicated that these strains produced the same compounds, which was subsequently identified as cis-9, trans-11, and trans-10, cis-12 CLA In the next study, we will optimize the conditions such as substrate concentrations, pH values, temperature and culture time of each strain to obtain the best rerults Keywords: Cis-9, trans-12 CLA, Lactobacillus; linoleate isomerase; trans-10, cis-12 CLA; 168 ... QUẢ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI MUỐI MẬT CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN LACTOBACILLUS 3.4.1 Khả phân giải muối mật chủng vi khuẩn Lactobacillus môi trƣờng nuôi cấy Sự tồn vi sinh vật qua đƣờng tiêu hóa. .. phải chủng có khả sinh trƣởng điều kiện có muối mật có khả phân giải muối mật 44 Chính cần phải tiếp tục tiến hành thử nghiệm phân giải muối mật để xác định khả phân giải muối mật của chủng vi khuẩn. .. khuẩn Lactobacillus phân lập từ hệ tiêu hóa ngƣời."  Với mục tiêu: Nhằm xác định khả phân giải muối mật chủng vi khuẩn Lactobacillus đặc điểm probiotics chủng vi khuẩn  Nhiệm vụ đề tài: - Phân lập,